Summary
Bir arka pençenin geçici bir haşlanma yaralanması (65 °C ± 0.5 °C, 3 s), ipsilateral tarafın von Frey filament stimülasyonuna eşik (g) değerini azaltır ve yürüyüş düzenini değiştirir. Ayrıca, yanık yaralanması zorunlu yüzme testinde depresyon benzeri davranışlara neden olur.
Abstract
Haşlama suyu, hem yaşlı hem de genç popülasyonda yanık yaralanmasının en yaygın nedenidir. Düşük ve orta gelirli ülkelerdeki yüksek mortalite ve sekeller nedeniyle en büyük klinik zorluklardan biridir. Yanıklar sıklıkla yoğun spontan ağrı ve kalıcı allodininin yanı sıra hayatı tehdit eden bir soruna neden olur. Daha da önemlisi, aşırı ağrıya genellikle yaşam kalitesini önemli ölçüde azaltabilecek depresyon eşlik eder. Bu makale, yanık kaynaklı ağrı ve depresyon benzeri davranışların incelenmesi için bir hayvan modelinin nasıl geliştirileceğini göstermektedir. Anesteziden sonra, farenin bir arka pençesinin 3 s boyunca sıcak suya (65 ° C ± 0.5 ° C) batırılmasıyla yanık yaralanmasına neden oldu. Von Frey testi ve otomatik yürüyüş analizi, yanık yaralanmasından sonra her 2 günde bir yapıldı. Ek olarak, zorla yüzme testi kullanılarak depresyon benzeri davranış incelendi ve yanık yaralanmasından sonra anormal motor fonksiyonu ayırt etmek için rota-çubuk testi yapıldı. Bu çalışmanın temel amacı, farelerde yanık yaralanmasına bağlı ağrı ve depresyon benzeri davranışların incelenmesi için bir hayvan modelinin geliştirilmesini tanımlamaktır.
Introduction
Yanık ve travma gibi doku hasarı genellikle akut ağrının birlikte ortaya çıkmasıyla ilişkilidir. Yanık yaralanmaları ve travmaya bağlı semptomlar, her yıl yaklaşık 1.80.000 ölümün yanıklardan kaynaklandığı tahmin edilmektedir - büyük çoğunluğu düşük ve orta gelirli ülkelerde farklı yanık türlerinden meydana gelmektedir1. Dünya çapında yayınlanan bir rapora göre, yanıklar çocuklarda yaygındır ve hastanede yatan hastaların yaklaşık% 40-60'ını oluşturur 2,3. Bu spesifik yaralanmalar, kaynar veya banyo suyu gibi günlük yaşamda ortaya çıkabilecekleri için daha da ciddidir 4,5. Akut ağrı çoğu durumda doku hasarından kurtulduktan sonra kendiliğinden düzelebilse de, sinir sistemindeki anormal değişiklikler nedeniyle kronikleşmek mümkün olabilir 6,7.
Son zamanlarda, akut ağrının depresif bir ruh halini tetikleyebileceği ve kronik ağrının anksiyete ve depresyona neden olabileceği öne sürülmüştür 8,9,10,11. Ağrı ve depresyonun bir arada bulunması hastanın tedavisini zorlaştırır. Depresyon ayrıca ağrı duyarlılığını artırma eğilimindedir, bu da daha yoğun depresyon ve ağrıya neden olabilir12. Ağrı ve depresyonun komplikasyonları periferik inflamasyonun hayvan modellerinde gösterilmiştir13,14,15,16. Ağrıya bağlı depresyonun altında yatan ayrıntılı mekanizmalar şimdiye kadar iyi bilinmemektedir17. Bu nedenle, yan etkileri ve semptomları hafifletmek için yanıklar için daha etkili tedaviler geliştirmek gerekir.
Bu nedenle, bu çalışma, farelerde yanık yaralanmasına bağlı akut ağrı ve depresyon benzeri davranışları incelemek için bir hayvan modeli geliştirmek üzere tasarlanmıştır. Bunun için yanık yaralanmasına bağlı anormal dokunsal duyarlılık, değişmiş yürüyüş paterni ve depresyon benzeri davranış ölçüldü. Ek olarak, bu çalışma NSAID'leri kullanarak modeli doğrulamaya çalışmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller, Güney Kore'deki Chungnam Ulusal Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve daha sonra Uluslararası Ağrı Çalışmaları Derneği18'in etik kurallarına dayanarak yürütülmüştür.
1. Arka pençede haşlama yanığı yaralanmasının indüklenmesi
- 20-25 g ağırlığındaki erkek ICR farelerini ışık ve sıcaklık kontrollü bir odada (12/12 saat açık-karanlık döngüsü, 22,5 °C ± 2,5 °C) %40-%60 nem oranıyla barındırın.
NOT: Bu protokol için hem erkek hem de dişi fareler kullanılabilir. - Hayvanın yiyecek ve suya serbestçe erişmesine izin verin ve deneye başlamadan önce en az 1 hafta boyunca iklimlendirin.
NOT: Tüm hayvanlar, izolasyon stresi gibi değişkenleri dışlamak için grup halinde barındırılmıştır. - Fareleri rastgele deney veya kontrol grubuna atayın ve hayvan numaralarını kod olarak kullanarak kör deneyler yapın.
- Yanık indüksiyonu gününde, fareyi 100 mg / kg'lık bir dozda 300 μL alfaxalone intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile anestezi yapın. Yanık indüksiyonunu yaparken cerrahi bir elbise, eldiven ve maske takın.
- Fareyi derinlemesine anestezi altına aldıktan sonra,% 70 etanol ile sağ arka pençenin etrafını dezenfekte edin.
NOT: Derin anestezi durumunu doğrulamak için arka ayak parmaklarına veya kuyruğa uygulanan çimdik stimülasyonuna yanıt verilmediğini kontrol edin. - Anestezi indüksiyonundan sonra kornea kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Derin anestezi uygulanan farenin sağ arka pençesini 65 °C ± 0,5 °C'de 3 sn sıcak suya batırın. Yanmış alanda tutarlılığı korumak için arka pençeyi sıcak suya batırmadan önce her farenin ayak bileğinde bir işaret yapın.
- Yanıkların indüklenmesinden sonra, fareleri temiz bir ev kafesine getirin ve hayvanlar anesteziden iyileşene kadar bir ısıtma yastığına yerleştirin.
NOT: Analjezik ajan olan asetaminofen (200 mg/kg), yanık yaralanması gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez intraperitoneal olarak uygulandı (Sadece Yanık + Asetaminofen grubu). Yanık grubuna araç kontrolü olarak salin uygulandı. Deney, önceki bir çalışmada açıklanan yönteme göre gerçekleştirildi4.
2. Mekanik allodininin ölçülmesi
- Fareleri davranışsal test odasına getirin ve testten önce en az 30 dakika boyunca iklimlendirmelerine izin verin. Testi yaparken cerrahi bir elbise, eldiven ve maske takın.
- Fareleri metal bir örgü zeminde (ağ boyutu: 0,7 cm x 0,7 cm) kare bir kutuya (çap: 13 cm, yükseklik: 12 cm) yerleştirin ve en az 30 dakika boyunca iklimlendirmelerine izin verin.
- Yükselen uyaran yöntemi 19,20'yi kullanarak arka pençenin mekanik eşiğini değerlendirin.
- Arka plantarı uyarmak için 5-8 s aralıklarla bir dizi von Frey filamentini nazikçe dürtün. Yanık indüksiyonundan önceki gün temel değerleri elde edin.
NOT: Testte sırasıyla tüm hayvanlarda pençe çekilme eşiğini ölçmek için 0.16-1.2 g von Frey filamentleri kullanılmıştır. Pençe geri çekilme tepki testi, von Frey filamentinin en düşük bükülme kuvveti ile başlatıldı (bu protokolde 0.16 g). Yanıt yoksa, bir sonraki bükme kuvvetine sahip bir filament uygulandı. - Her ipsilateral (yaralı) arka pençe için mekanik eşikleri değerlendirmek için beş deneme yapın.
NOT: Her hayvandaki beş denemenin üç katından fazlasına yanıt veren von Frey filamentinin bükülme kuvveti, pençe çekilme eşiği (PWT, g) olarak ifade edilmiştir. Mekanik eşikler yanık yaralanmasından bir gün önce ve 1, 3, 5 ve 7 gün sonra ölçüldü. Analjezik etki, hayvanda asetaminofenin uygulanmasından 1 saat sonra değerlendirildi.
3. Otomatik yürüyüş analizi
- Fareleri, yanık yaralanmasından 5 gün önce 10-15 dakika boyunca günde bir kez yürüyüş analiz sistemine alıştırın. Yürüyüş analizi yaparken cerrahi bir elbise, eldiven ve maske takın.
- Test gününde, fareleri davranışsal test odasına getirin ve testten en az 30 dakika önce iklimlendirin.
NOT: Karanlık bir ortamda alışma ve yürüme analizi testleri gerçekleştirin. Program menüsünün koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın.- Programı çalıştırdıktan sonra, verileri kaydedecek klasörü belirlemek için Yeni Deneme Oluştur menüsünü tıklayın.
- Atamadan sonra, maksimum çalışma süresini 5 s'ye ve izin verilen maksimum hız değişimlerini% 50'ye ayarlayın.
- Kayıtlı bir kamera seçin ve programın Kurulum sekmesinde yürüyüş yolu uzunluğunu 30 cm olarak ayarlayın.
- Program menüsünün Al sekmesinde, Alımı Aç'ı seçin.
- Durum mesajlarına bağlı olarak, boş bir yürüyüş yolunun arka plan görüntüsünü almak için Arka Planı Tutturma düğmesine tıklayın.
- Edinimi Başlat düğmesine tıklayın ve ardından fareyi sol-sağa çapraz geçiş yolunun girişine yerleştirin. Kayıt, farenin serbest hareketini takiben otomatik olarak başlayacaktır.
NOT: Hayvanın yürüyüşü başarıyla kaydedildiyse ve tüm ayak sesleri algılandıysa, yeşil bir simgeyle Uyumlu Koşu olarak işaretlenir. Yazılım herhangi bir ayak izi algılamazsa, kırmızı bir simge görüntülenir, bu durumda kaydın tekrar yapılması önerilir. Yazarlar, benzer çalışma hızlarıyla gerçekleştirilen en az beş başarılı uyumlu koşunun toplanmasını ve analiz edilmesini önermektedir. - Program menüsünün Al sekmesinde, Çalıştırmaları Sınıflandır'ı seçin.
NOT: Yukarıdaki başarılı uyumluluk çalışmasından elde edilen verileri seçtikten sonra, farelerin yürüyüş kalıplarının kaydedildiği video analiz ekranına gidin. - Analiz edilecek çalıştırmayı seçin ve Otomatik Sınıflandır'a tıklayın.
- Otomatik sınıflandırma yaptıktan sonra, burun, genital tanıma ve pençelerin her çalıştırmada önemsiz verilere yanlış tanınmasını kaldırın ve ardından verileri analiz edin.
NOT: Tüm istatistiksel parametreler otomatik olarak analiz edilir ve programa kaydedilir ve ham veri değerleri deneycinin analiz menüsünde bulunabilir. Otomatik yürüyüş analizi, yanık yaralanmasından önce ve 1, 3, 5 ve 7 gün sonra yapıldı. Değerlendirme, Yanık + Asetaminofen grubunda asetaminofen uygulamasından 30 dakika sonra ve Yanık grubunda salin tedavisinden 30 dakika sonra yapıldı. Bu deney, önceki çalışmalarda açıklanan yönteme göre gerçekleştirilmiştir 4,21,22.
4. Depresyon benzeri davranışların ölçülmesi
NOT: Umutsuzluğa dayalı davranış, sudaki hareketsizlik süresi zorla yüzme testi ile ölçülmüştür.
- Fareleri davranışsal test odasına getirin ve testten en az 30 dakika önce iklimlendirin. Zorla yüzme testini yaparken cerrahi bir elbise, eldiven ve maske takın.
- Fareyi 15 dakika boyunca 15 cm su (25 °C ± 0,5 °C) içeren şeffaf bir pleksiglas silindire (10 cm x 25 cm) koyun.
- 24 saat sonra, fareyi aynı koşulların silindirine koyun ve hareketsizlik süresini ölçün.
NOT: Hareketsizlik süresi 5 dakikalık test süresi boyunca ölçüldü ve farelerin tırmanmayı veya yüzmeyi bıraktığı ve sadece kafalarını su yüzeyinin üzerinde tutmak için yüzdüğü zaman kaydedildi. Zorla yüzme testi, yanık yaralanmasından sonraki 7. günde yapıldı. Değerlendirme, Yanık + Asetaminofen grubunda asetaminofen uygulamasından 1 saat sonra, Yanık grubunda salin tedavisinden 1 saat sonra yapıldı. Deney, önceki çalışmalarda açıklanan yönteme göre gerçekleştirilmiştir23,24.
5. Normal motor fonksiyonunun ölçülmesi
NOT: Rota-çubuk testi, yanık yaralanmasından sonra anormal motor fonksiyonu ayırt etmek için yapılmıştır.
- Fareleri davranışsal test odasına getirin ve testten en az 30 dakika önce iklimlendirin. Zorla yüzme testini yaparken cerrahi bir elbise, eldiven ve maske takın.
- Hayvanları, aparatın tabanından 16 cm yukarıda asılı duran yuvarlanan silindirik bir platforma (5,7 cm genişliğinde; 3 cm çapında) yerleştirin.
- Her hayvanın, yanık yaralanmasının indüklenmesinden önce en az 5 gün boyunca günde bir kez rota-çubuk üzerinde antrenman yapmasına izin verin.
- İlaç uygulamasından sonra 2 saat boyunca her 20 dakikada bir rota-çubuk testi yapın. Kesme süresini 2 dakikaya ayarlayın.
- Farenin dönen bir çubuk üzerinde düşmeden dakikada 15 devir sabit hızda çalıştığı süreyi ölçün.
NOT: Rota-çubuk testi, yanık yaralanmasının indüklenmesinden 7 gün sonra gerçekleştirilmiştir. Değerlendirme, Yanık + Asetaminofen grubunda asetaminofen uygulamasından hemen sonra ve Yanık grubunda salin tedavisinden hemen sonra yapıldı. Alfaxalone, bu testte deneysel olarak tedavi edilen ilaçlar için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Rotarod testi sırasında, farenin dönen çubuk üzerinde düşmeden çalıştığı süre ölçülür. Deney, önceki çalışmalarda açıklanan yönteme göre gerçekleştirilmiştir22,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hayvan ıstırabını en aza indirmek ve Üç R (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme) kılavuzlarına göre kullanılan hayvan sayısını azaltmak için, bu çalışma ön deney yoluyla belirlenen önemli verilerin toplanması için minimum sayıda hayvan ile tasarlanmıştır. Bu çalışmada, davranışsal deneyler bağımsız olarak aşağıdaki gibi iki kez gerçekleştirilmiştir. Yürüme analizi, mekanik allodini ve depresyon benzeri davranış testleri Kontrol (n = 5), Yanık (n = 7; araç kontrolü; salin) ve Yanık + Asetaminofen (n = 7) grupları ile gerçekleştirildi. Rota-çubuk testinde, Kontrol (n = 3), Yanık (n = 4; araç kontrolü; salin), Yanık + Asetaminofen (n = 4), Pozitif kontrol (n = 4; Alfaxalone) grupları tasarlandı. Alfaxalone, şu anda veteriner hekimlikte enjekte edilebilir genel anestezik indükleyici olarak kullanılan bir nöroaktif steroid ve anestezik türüdür. Bu çalışmada, yanık indüksiyonu için hayvan anestezisinde alfaxalone kullanıldı ve rota-rod testinde motor bozukluklar için pozitif kontrol ilacı olarak kullanıldı.
Veriler ortalama ± S.E.M olarak ifade edildi. Ayrıca, farklı zamanlarda elde edilen deneysel veriler bağımsız olarak analiz edilmiştir. Ağrı davranışsal yanıtları eğrinin altındaki alan (AUC) olarak hesaplandı. Mekanik allodinya testi, yürüyüş analizi ve rota-çubuk testinden elde edilen verilerdeki zaman içindeki farklılıkları belirlemek için iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA yapıldı. Dunnett'in testi, deney grupları arasında P-değerini belirlemek için Post-hoc analiz için kullanıldı. 0.05'ten küçük P-değerleri anlamlı olarak kabul edildi. Bu istatistiksel geçerliliği analiz etmek için GraphPad Prism 6.0 yazılımı kullanıldı. Tüm istatistiksel analiz prosedürleri deney koşullarıyla ilişkili olarak körü körüne gerçekleştirilmiştir. Yanık yaralanmasına bağlı doku hasarını gösteren bir şekil Ek Şekil 1'de gösterilmiştir.
Yanık yaralanmasından sonra pençe çekilme eşiğindeki (PWT, g) zaman seyri değişiklikleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Yanık yaralanmasına bağlı farelerin PWT'si (g), yanık indüksiyonundan 1 gün sonra azaldı ve kontrol grubununkine kıyasla 7 gün boyunca sürdürüldü. Asetaminofen uygulaması (200 mg/kg, yani yanık indüksiyonu gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez), PWT'de yanığa bağlı azalmayı önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 1A, ** p < 0.01 Yanık grubuna karşı). Ek olarak, AUC analizi (7 gün boyunca), asetaminofen uygulamasının yanık yaralanmasına bağlı mekanik allodini'yi önemli ölçüde azalttığını göstermiştir (Şekil 1B, *** p < Kontrol grubuna karşı 0.001, ** p < 0.01'e karşı Yanık grubu).
Yanık yaralanmasından sonra arka pençe baskı alanında zaman içinde meydana gelen değişiklikler Şekil 2'de gösterilmiştir. Yanık yaralanması, ipsilateral arka pençe baskı alanını indüksiyondan sonraki günden itibaren önemli ölçüde azalttı ve 7 gün boyunca devam etti. Arka pençe baskı alanı, asetaminofen (200 mg / kg, yani yanık indüksiyonu gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez) uygulanarak, araçla tedavi edilen gruba kıyasla anlamlı derecede iyileşmiştir (Şekil 2A, B, * p < 0.05 ve ** p < 0.01'e karşı Yanık grubu).
Yanık yaralanması sonrası tek bir duruşta zaman seyri değişiklikleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Yanık yaralanması, yanık indüksiyonundan 1 gün sonra ipsilateral arka pençenin tek duruşunu (%) azalttı ve bu azalma 7 gün boyunca korundu. Arka pençe tek duruşu, asetaminofen uygulaması (200 mg / kg, yani yanık indüksiyonu gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez) ile araçla tedavi edilen gruba kıyasla iyileştirildi (Şekil 3A, B, * p < 0.05'e karşı Yanık grubu).
Zorla yüzme testinden elde edilen hareketsizlik süresindeki değişiklikler Şekil 4'te gösterilmiştir. Yanık yaralanmasına bağlı farelerin hareketsizlik süresi, yanık indüksiyonundan 7 gün sonra kontrol grubununkine kıyasla artmıştır. Yanık yaralanmasına bağlı farelerde, asetaminofen uygulaması (200 mg / kg, yani yanık indüksiyonu gününden itibaren 7 gün boyunca günde bir kez), hareketsizlik süresinde yanık yaralanmasına bağlı artışı önemli ölçüde azaltmıştır (** p < 0.01 ve *** p < 0.001 Yanık grubuna karşı).
Normal motor fonksiyonu, Şekil 5'te gösterildiği gibi, rota-çubuk üzerindeki çalışma süresindeki değişikliklere dayanarak değerlendirilmiştir. Yanık yaralanmasına bağlı farelerin çalışma süresi, yanık indüksiyonundan 7 gün sonra kontrol grubununkine kıyasla değişmedi. Buna karşılık, alfaxalone ile tedavi edilen farelerin çalışma süresi (pozitif kontrol) yaklaşık 60 dakika boyunca önemli ölçüde azalmıştır. Bu sonuç, bu çalışmada kullanılan bir yanık yaralanmasının motor bozulmaya neden olmadığını göstermektedir (*** p < 0.001'e karşı Yanık grubu).
Şekil 1: Yanık yaralanmasına bağlı farelerde von Frey testi ile değerlendirilen mekanik allodinya. (A) Farelerin ipsilateral arka pençesindeki pençe yoksunluk eşiği (PWT, g), yanık yaralanmasından 1 gün sonra azalmış ve Kontrol grubuna kıyasla 7 gün boyunca sürdürülmüştür. Asetaminofen uygulaması (200 mg/kg, yani yanık indüksiyonu gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez) yanık yaralanmasına bağlı mekanik allodiniyi önemli ölçüde azaltmıştır. (B) PWT, eğrinin altındaki alan (AUC) olarak analiz edildi. Oklar ilaç uygulama gününü gösterir. p < 0.001'e karşı Kontrol grubu, ** p < 0.01'e karşı Burn grubu. Von Frey testinin zaman akışındaki genel etkileri belirlemek için iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA yapıldı. Post-hoc analiz, P-değerini belirlemek için Dunnett testi kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yanık yaralanmasına bağlı farelerde otomatik yürüyüş analizinden elde edilen pençe baskı alanı . (A) Farelerin hem ipsilateral hem de kontralateral arka pençelerinin temsili görüntüleri yürüyüş analiz yazılımı tarafından yakalanmıştır. Pençenin temas boyutu, yanık yaralanmasından sonra Kontrol grubununkine kıyasla azalır. Bu azalma, asetaminofen (200 mg / kg, yani yanık indüksiyonu gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez) uygulanarak kısmen geri kazanıldı. Beyaz dikdörtgenler yazılım tarafından analiz edilen arka pençeleri gösterir, (B) bir grafik pençe baskı alanındaki zaman seyri değişikliklerini gösterir (%). Veriler, ipsilateral (sağ) ve kontralateral (sol) arka pençeler arasındaki baskı alanındaki değişikliklerin yüzdesi olarak hesaplanır (örneğin; %50 değeri, sağ ve sol arka pençelerdeki aynı pençe baskı alanlarını gösterir). Oklar ilaç uygulama gününü gösterir. * p < 0.05 ve ** p < 0.01 Yanık grubuna karşı. Yürüme analizinde baskı alanının zaman akışındaki genel etkileri belirlemek için iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA yapıldı. Post-hoc analiz, P-değerini belirlemek için Dunnett testi kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yanık yaralanmasına bağlı farelerde otomatik yürüyüş analizinden elde edilen tek duruş . (A) Tek bir duruşun temsili görüntüleri yürüyüş analiz yazılımı tarafından yakalandı. Farklı renkler her pençenin duruşunu gösterdi: mavi, sağ ön pençe; pembe, sağ arka pençe; sarı, sol ön pençe; yeşil, sol arka pençe. İpsilateral arka pençenin tek duruşu yanık yaralanmasından sonra kısaltıldı. Bu değişiklik, asetaminofen (200 mg / kg, yani yanık indüksiyonu gününden başlayarak 7 gün boyunca günde bir kez) uygulanarak kısmen geri kazanıldı. (B) Bir grafik, tek duruştaki zaman rotası değişikliklerini gösterir (%). Veriler, ipsilateral (sağ) ve kontralateral (sol) arka pençeler arasındaki tek duruştaki değişikliklerin yüzdesi hesaplandıktan sonra bir çizgi grafik olarak özetlenir (örneğin,% 50 değeri, sağ ve sol arka pençelerdeki aynı tek duruşu gösterir). Oklar ilaç uygulama gününü gösterir. * p < 0.05 Yanık grubuna karşı. Yürüme analizinde tek duruşun zaman akışındaki genel etkileri belirlemek için iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA yapıldı. Post-hoc analiz, P-değerini belirlemek için Dunnett testi kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yanık yaralanmasına bağlı farelerde zorla yüzme testinin hareketsizlik süresi. Yanık yaralanmasına bağlı farelerin hareketsizlik süresi, yanık indüksiyonundan 7 gün sonra Kontrol grubununkine kıyasla artmıştır. Yanık yaralanmasına bağlı farelerde, asetaminofen uygulaması (200 mg / kg, yani yanık indüksiyonu gününden itibaren 7 gün boyunca günde bir kez), yanık yaralanmasına bağlı gelişmiş hareketsizlik süresini önemli ölçüde hafifletmiştir. p < 0.001'e karşı Kontrol grubu, ** p < 0.01'e karşı Burn grubu. Zorla yüzme testinin zaman akışındaki genel etkileri belirlemek için tek yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA yapıldı. Post-hoc analiz, P-değerini belirlemek için Dunnett testi kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yanık yaralanmasına bağlı farelerde rota-çubuk testinin çalışma süresindeki değişikliklere dayanan normal motor fonksiyon değerlendirmesi. Yanık yaralanmasına bağlı farelerin çalışma sürelerinde, yanık indüksiyonundan 7 gün sonra, Kontrol ve asetaminofen ile tedavi edilen yanık yaralanması gruplarına kıyasla herhangi bir değişiklik olmamıştır. Bununla birlikte, alfaxalone ile tedavi edilen farelerin çalışma süresi (Pozitif kontrol) ~ 60 s'ye kadar önemli ölçüde azalmıştır. Bu sonuç, bu çalışmada kullanılan yanık yaralanmasının motor bozulmaya neden olmadığını göstermektedir. p < 0.001 karşı Burn grubu. Rota-çubuk testinin zaman akışındaki genel etkileri belirlemek için iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA yapıldı. Post-hoc analiz, P-değerini belirlemek için Dunnett testi kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Yanıkların indüklenmesinden sonra zamanla doku hasarındaki değişiklikler. Haşlama yanığı indüksiyonundan sonra, zamanla kademeli olarak artan önemli doku hasarı gözlendi. Bu çalışmada, pozitif kontrol ilacı olarak kullanılan Asetaminofen, doku hasarları üzerinde koruyucu bir etki göstermiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Haşlama yanığı, ısıtılmış sıvıların neden olduğu bir tür termal yanıktır. Çoğu durumda birinci veya ikinci derece yanıkların meydana geldiği öne sürülmüştür, ancak ısı kaynaklarıyla uzun süreli temas üçüncü derece yanıklara neden olabilir26. Bu çalışmada, farelerin sağ arka pençesinin 3 s 4,26 için 65 °C'de sıcak suya maruz bırakılmasıyla yanık hasarı indüklenmiştir. Yanık yaralı pençede doku hasarı tespit edildi ve bu da kızarıklık, cildin soyulması ve şişlik gibi sık görülen yanık semptomlarını gösterdi (Ek Şekil 1)4.
Mekanik allodinya ölçümü, hayvan ağrı modellerinde yaygın olarak kullanılan bir ağrı yanıtı tanımlama yöntemidir ve bu çalışmada von-Frey filamentleri kullanılarak ölçülmüştür. Von Frey filamentleri ile artan uyaran yöntemi, bir hayvanın pençe çekilme tepkisini indüklemek için gereken mekanik eşiği belirlemek için kullanılır19,20. Deney, en az uyaranla filament ile başladı. Filamentin belirli bir sayıya cevap veren bükülme kuvveti (bu protokolde üç kez) pençe geri çekilme eşik değeri olarak elde edildi.
Serbest yürüyüş sırasında kemirgenlerin yürüyüş analizi, Parkinson hastalığı veya uzuv hareketlerini ve omurilik yaralanması ve inme27,28 dahil olmak üzere duyusal-motor bozukluk modellerindeki pozisyon değişikliklerini incelemek için kullanılır. Yürüyüş analiz sistemi, pençe yoğunluğu, pençe izi, duruş aşaması vb. dahil olmak üzere çeşitli yürüyüş parametrelerini otomatik olarak analiz eder. Yürüme analiz sisteminin analiz edebileceği parametrelerdeki değişiklikler, ağrı hayvanı modellerinin yürüyüş analizinde ağrı ile ilgili göstergeler olarak kullanılabilir. Bu nedenle, yürüyüş analizi, hayvan modellerinde spontan ağrıyı invaziv olmayan bir şekilde ölçmek için deneysel bir yöntem olarak kullanılabilir 4,21,22. Ağrı 21,22'nin hayvan modellerinde ağrıya bağlı tarafta yürüme parametrelerinin azaldığına dair önceki bulgulara dayanarak, sunulan bu protokol, her bir yürüyüş parametresini yanığa bağlı ipsilateral ve kontralateral tarafın oranı olarak ölçmüştür. Bu protokolde, pençe baskı alanı ve tek duruş verileri, ipsilateral (yaralı) ve kontralateral (yaralanmamış) arka pençeler arasındaki değişim oranına dönüştürülmüştür. % 50 değeri, pençe baskı boyutunun ve zemine ulaşma süresinin hem ipsilateral hem de kontralateral olarak aynı olduğu anlamına gelirken,% 50'den düşük değer, bu parametrelerin yanık kaynaklı ipsilateral arka pençede azaldığını gösterir. İpsilateral ve kontralateral arka pençeler arasındaki yüzde değişimleri, tüm verileri elde etmek için kullanıldı (yani, normal fareler ~% 50 gösterdi, bu da ipsilateral: kontralateral oranın 50: 50 olduğu anlamına gelir). Normal hayvanlarda, her bir arka bacak ile ilgili parametreler, serbestçe yürürken her iki tarafta da aynı görünür. Bununla birlikte, bu protokolün analizi, ipsilateral taraftaki parametrelerin ağrı indüksiyonundan sonra azaldığı gerçeğine odaklanmıştır. Ek olarak, her hayvanda bireysel varyasyon vardır; ham veriler olduğu gibi analiz edildiğinde doğru veriler elde edilemeyebilir. Bu nedenle, analiz sırasında daha doğru sonuçlar elde etmek için her bir yürüyüş parametresi değeri bir orana dönüştürülmüştür. Bu çalışmada, yanık yaralanması sonrası ipsilateral arka pençenin baskı alanı büyüklüğünün ve tek duruş süresinin azaldığı ve bu azalmanın tekrarlanan intraperitoneal asetaminofen uygulaması ile geri kazanıldığı gösterilmiştir. Bu değişiklikler, yanık yaralanması ve ilaç uygulamasından sonra ağrı davranışlarında benzer bir zaman seyri değişikliği paterni ile çakıştı.
Tartışmalı olmasına rağmen, zorla yüzme testi, depresif kemirgenlerin davranışlarını incelemek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Hayvanlar su dolu kaptan kaçmaya çalışırlar, ancak sonunda hareket etmezler ve umutsuzluğa neden olurlar29. Bununla birlikte, hareketsizliğin bir depresyon ölçüsü olarak değerlendirilmesinin zor olduğu iddia edilmektedir, çünkü bu test dayanıklılık ve umutsuzluk duyguları ile ilişkilidir. Zorla yüzme deneyinin sonuçlarını desteklemek için, kuyruk süspansiyon testi, yenilik baskılanmış beslenme testi ve sakkaroz tüketim testi gibi depresyonu değerlendirmek için diğer yöntemler30,31 olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada yanık yaralanması sonrası immobilizasyon süresi uzatılmış ve bu artış asetaminofen uygulaması ile sağlanmıştır.
Bu çalışmanın protokolleri, yanık yaralanması sonrası depresyon benzeri davranışa eşlik eden akut ağrı modelini oluşturmak için tasarlanmıştır. Bu çalışmadaki depresyon benzeri davranış, fiziksel bozukluğun ikincil etkileri ve yanık yaralanması sonrası termal duyarlılıktaki değişiklikler olabilir 15,32,33. Sonuçlar, yanık yaralanmasından sonra indüklenmiş akut ağrıya sahip farelerin depresyon benzeri davranış sergilediğini gösterebilir. Deneysel olarak tedavi edilen ilaçlarla ağrı yanıtını ve bunun sonucunda depresyon benzeri davranışları iyileştirdiği gösterilmiştir.
Rota-çubuk testi, genellikle atletik aktiviteye sahip kemirgenlere zorla uygulanan rotasyonel bir yüke dayanan bir performans testidir. Test, çalışma süresi ve dayanıklılık gibi parametreleri ölçer. Test özelliklerinden bazıları, diğerlerinin yanı sıra, deneysel bir ilacın etkilerini veya nöropatik ağrı modelindeki deneklerin dengesini, kavrama gücünü ve motor koordinasyon değerlendirmesini içerir22,25,34. Bu çalışmanın sonuçlarında gösterildiği gibi, yanık yaralanması veya asetaminofen tedavisini takiben rota-rod çalışma süresinde kontrol grubununkine kıyasla herhangi bir değişiklik olmamıştır.
Bu çalışma, farelerde yanık yaralanmasına bağlı ağrı ve depresyon benzeri davranışları incelemek için bir hayvan modelinin gelişimini göstermektedir. Bu bağlamda, bu çalışma, haşlanma yanığı yaralanmalarının mekanik alloni, yürüme parametrelerinde değişiklikler ve hareketsizlik süresi gibi depresyon benzeri davranışlara neden olduğunu göstermiştir. Bu model, yanık ağrısının ve tedavisinin çeşitli yönleri ve sonuçları üzerine araştırmalar için uygundur ve bu araştırma alanına önemli bilgiler getirmesi beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Kore hükümeti tarafından finanse edilen Chungnam Ulusal Üniversitesi ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (NRF-2019R1A6A3A01093963 ve NRF-2021R1F1A1062509) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 307809 | |
| 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL tube | SPL | 50050 | |
| Acetaminophen BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | A7085-100G | This analgesic agent is used as a positive control. |
| Alfaxan multidose (Alfaxalone) | JUROX Pty.Limited | In this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test. | |
| CatWalk automated gait analysis system | Noldus | CatWalk XT | Gait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction |
| OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment) | Ashish Life Science | This material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia. | |
| Plexiglass cylinder | SCITECH KOREA | custom made products | Used in forced swimming test |
| Rota-rod system | SCITECH KOREA | Accelerating rota rod | Used in the measurement of Normal Motor Function |
| von Frey filaments | North Coast Medical | NC12775 | Used in the measurement of Mechanical Allodynia |
| Waterbath | CHANGSHIN SCIENCE | C-WBE | Used in the burn injury induction |
References
- Peck, M. D. Epidemiology of burns throughout the World. Part II: intentional burns in adults. Burns. 38 (5), 630-637 (2012).
- Tracy, L. M., Cleland, H. Pain assessment following burn injury in Australia and New Zealand: Variation in practice and its association on in-hospital outcomes. Australasian Emergency Care. 24 (1), 73-79 (2021).
- Montgomery, R. K.
- Kang, D. W., Choi, J. G. Bee venom reduces burn-induced pain via the suppression of peripheral and central substance P expression in mice. Journal of Veterinary Science. 22 (1), 9 (2021).
- Abdi, S., Zhou, Y.
- Ullrich, P. M., Askay, S. W. Pain, depression, and physical functioning following burn injury. Rehabilitation Psychology. 54 (2), 211-216 (2009).
- Patwa, S., Benson, C. A. Spinal cord motor neuron plasticity accompanies second-degree burn injury and chronic pain. Physiological Reports. 7 (23), 14288 (2019).
- Michaelides, A., Zis, P. Depression, anxiety and acute pain: links and management challenges. Postgraduate Medicine. 131 (7), 438-444 (2019).
- Doan, L., Manders, T., Wang, J. Neuroplasticity underlying the comorbidity of pain and depression. Neural Plasticity. 2015, 504691 (2015).
- Vachon-Presseau, E., Centeno, M. V. The emotional brain as a predictor and amplifier of chronic pain. Journal of Dental Research. 95 (6), 605-612 (2016).
- Apkarian, A. V., Baliki, M. N. Predicting transition to chronic pain. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 360-367 (2013).
- Yin, W., Mei, L. A Central amygdala-ventrolateral periaqueductal gray matter pathway for pain in a mouse model of depression-like behavior. Anesthesiology. 132 (5), 1175-1196 (2020).
- Deng, Y. T., Zhao, M. G., Xu, T. J. Gentiopicroside abrogates lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice through tryptophan-degrading pathway. Metabolic Brain Disease. 33 (5), 1413-1420 (2018).
- Zhang, G. F., Wang, J. Acute single dose of ketamine relieves mechanical allodynia and consequent depression-like behaviors in a rat model. Neuroscience Letters. 631, 7-12 (2016).
- Edwards, R. R., Smith, M. T. Symptoms of depression and anxiety as unique predictors of pain-related outcomes following burn injury. Annals of Behavioral Medicine. 34 (3), 313-322 (2007).
- Pincus, T., Vlaeyen, J. W. Cognitive-behavioral therapy and psychosocial factors in low back pain: directions for the future. Spine. 27 (5), 133-138 (2002).
- Laumet, G., Edralin, J. D. CD3(+) T cells are critical for the resolution of comorbid inflammatory pain and depression-like behavior. Neurobiology of Pain. 7, 100043 (2020).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Scholz, J., Broom, D. C. Blocking caspase activity prevents transsynaptic neuronal apoptosis and the loss of inhibition in lamina II of the dorsal horn after peripheral nerve injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (32), 7317-7323 (2005).
- Kang, D. W., Choi, J. G. Automated gait analysis in mice with chronic constriction injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56402 (2017).
- Kang, D. W., Moon, J. Y. Antinociceptive profile of levo-tetrahydropalmatine in acute and chronic pain mice models: Role of spinal sigma-1 receptor. Scientific Reports. 6, 37850 (2016).
- Huang, W., Chen, Z. Piperine potentiates the antidepressant-like effect of trans-resveratrol: involvement of monoaminergic system. Metabolic Brain Disease. 28 (4), 585-595 (2013).
- Can, A., Dao, D. T. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Choi, J. G., Kang, S. Y. Antinociceptive effect of Cyperi rhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 16 (6), 387-392 (2012).
- Mosby's. Mosby's Dictionary of Medicine, Nursing & Health Professions - Seventh edition, Nursing Standard. 20 (22), RCN Publishing Company Ltd. 36 (2006).
- Vandeputte, C., Taymans, J. M. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Isvoranu, G., Manole, E. Gait analysis using animal models of peripheral nerve and spinal cord injuries. Biomedicines. 9 (8), 1050 (2021).
- Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52587 (2015).
- Yan, H. C., Cao, X.
- Papp, M., Willner, P. An animal model of anhedonia: attenuation of sucrose consumption and place preference conditioning by chronic unpredictable mild stress. Psychopharmacology. 104 (2), 255-259 (1991).
- Seminowicz, D. A., Laferriere, A. L. MRI structural brain changes associated with sensory and emotional function in a rat model of long-term neuropathic pain. Neuroimage. 47 (3), 1007-1014 (2009).
- Yalcin, I., Barthas, F. Emotional consequences of neuropathic pain: insight from preclinical studies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 47, 154-164 (2014).
- Choi, J. W., Kang, S. Y. Analgesic effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain via spinal opioidergic and adrenergic mechanisms in mice. American Journal of Chinese Medicine. 43 (1), 57-70 (2015).
