Summary
本方案描述了衍生自成年小鼠上颚的口腔角质形成细胞的分离和培养。还报道了一种使用免疫染色的评估方法。
Abstract
多年来，大多数涉及角质形成细胞的研究都是使用人类和小鼠皮肤表皮角质形成细胞进行的。近年来，口腔角质形成细胞因其独特的功能和特点而受到关注。它们维持口腔上皮的稳态，并作为再生疗法应用的资源。然而，由于缺乏有效且完善的培养方案，使用成年小鼠口服原发性角质形成细胞的 体外 研究受到限制。在这里，从成年小鼠的上颚组织中分离出口服原代角质形成细胞，并在补充有螯合血清的商用低钙培养基中培养。在这些条件下，角质形成细胞保持在增殖或干细胞样状态，即使在增加传代后，它们的分化也被抑制。标记表达分析表明，培养的口腔角质形成细胞表达基底细胞标志物p63、K14和α6-整合素，分化标志物K13和成纤维细胞标志物PDGFRα阴性。该方法产生的活细胞和可培养细胞适合于在 体外研究口腔上皮干细胞功能的下游应用。
Introduction
口腔上皮是保护身体免受环境压力的第一道屏障，包括化学或物理损伤以及细菌和病毒感染1，2。口腔粘膜包括分层鳞状上皮的外层，该鳞状上皮由角质形成细胞和称为固有层的底层结缔组织组成，其主要由成纤维细胞和细胞外基质组成。小鼠口腔粘膜大致可分为三种亚型：咀嚼（硬腭和牙龈），专门（背舌）和衬里（颊粘膜，腹舌，软腭，嘴唇）粘膜2，3（图1A）。口腔上皮在咀嚼和特化粘膜中角化，在衬里粘膜中非角化。尽管口腔上皮位于解剖学位置，但它与皮肤表皮相似，因为它由紧密堆积的上皮细胞组成，具有不同程度的分化：基底层含有未分化的细胞;形成角质化上皮的多刺、颗粒状和角质化层，或形成非角质化上皮的中间层和浅表层4。转基因小鼠模型促进了口腔上皮干细胞在上颚，颊粘膜，舌头和牙龈中的细胞和分子特征的研究5，6，7，8，9，10，11。然而，这些研究中的大多数主要使用体内小鼠实验。由于缺乏既定和有效的方案，通常不使用细胞培养系统。
体外培养系统可用于干细胞调节剂的分子和生化分析、基于细胞的测定和药物筛选。目前，已经开发了皮肤表皮原发性角质形成细胞的培养方案，其中基底角质形成细胞可以成功分离和培养用于临床和研究目的12，13，14，15。1980年，Hennings等人表明，培养基中的低钙浓度（<0.09mM Ca2 +）促进了增殖并使细胞保持在未分化状态。更高水平的钙促进细胞分化并减少增殖16。随后，新生儿和成年小鼠表皮角质形成细胞的培养方法已经建立，并广泛应用于许多具有不同遗传背景的小鼠模型进行体外研究17，18，19。虽然皮肤和口腔上皮具有共同的特征，但它们也显示出内在的差异，例如，它们的角化状态，周转率，基因表达和伤口愈合能力3，11，20，21，22，23，24，25，26。
尽管人口服角质形成细胞培养已成功进行27，28，29，但由于靶组织体积小且细胞与皮肤表皮角质形成细胞相比具有明显特征，因此关于小鼠口服角质形成细胞培养的出版物30，31，32受到限制。该方案描述了小鼠原代口腔角质形成细胞的分离和长期培养技术。
Protocol
所有动物实验均根据熊本大学和筑波大学的机构动物实验委员会指南进行。
1. 试剂和培养基的制备
- 制备40mL含有60μM钙和600μL抗生素 - 真菌溶液的角质形成细胞培养基。准备20毫升0.025%胰蛋白酶和400μL抗生素抗真菌溶液。
- 在室温下解冻胰蛋白酶抑制溶液，并将其保持在4°C，直到在步骤4.1中使用。
注意：分离试剂用于五只小鼠的组织分离。
- 在室温下解冻胰蛋白酶抑制溶液，并将其保持在4°C，直到在步骤4.1中使用。
- 为了准备培养基，取500mL培养基并加入5mL生长补充剂溶液（见 材料表）（以下简称完全培养基）和20%钙耗尽的螯合胎牛血清（FBS）33 （以下简称螯合FBS）。
2. 从成年小鼠身上解剖腭组织
- 根据设施有关动物福利的规定，通过宫颈脱位处死一只成年C57BL / 6J小鼠（雄性或雌性）。
- 用剃须刀去除嘴周围的毛发。使用剪刀，从脸颊切向下巴，两侧。
注意：小鼠在牺牲前需要麻醉。使用美托咪定、咪达唑仑和丁邻苯醇的麻醉混合物（ 材料表）。
- 用剃须刀去除嘴周围的毛发。使用剪刀，从脸颊切向下巴，两侧。
- 使用镊子张大嘴巴，并使用棉签吸收任何血液。为了消毒口感，用含有10%聚维酮碘的棉签擦拭口腔内部。
- 为了收获小鼠的腭，首先，使用手术刀刀片沿着上颌牙齿的上颚侧做一个全厚度的边缘切口。然后，使用覆盆仔细解剖整个口感。
注：覆盆是用于抬高粘膜骨皮瓣的工具（见 材料表）（图1B）。 - 快速将腭组织转移到含有4 mL完整培养基+抗生素抗真菌溶液的15 mL管中。将组织保持在冰上，直到准备好孵育。
注意：对于从多只小鼠收集，上颚组织可以在冰上保持长达4小时。
3. 上颚组织的预处理
- 在层流罩中，将组织转移到含有4mL完整培养基+抗生素 - 抗真菌剂溶液的60mm培养皿中。
- 使用短而钝的镊子和手术刀刀片，轻轻地从组织中去除任何血液。在完全培养基中洗涤纸巾10次。
- 将组织转移到含有4 mL 0.025%胰蛋白酶+抗生素抗真菌溶液的35mm培养皿中，上皮表面朝下。
注意：向内弯曲的上皮表面应浸泡在胰蛋白酶溶液中;本体层应朝上。组织应尽可能扁平，以完全在胰蛋白酶溶液中孵育。 - 在培养罩中室温下将组织在0.025%胰蛋白酶中孵育约16小时。
4. 原代细胞的收集和培养
- 使用一对钝钳，从胰蛋白酶溶液（在35mm培养皿中）中取出组织，并在60mm培养皿（每培养皿4mL）中转移到胰蛋白酶抑制剂溶液中，上皮表面朝上。
- 使用镊子抓住上颚边缘，使用手术刀刀片轻轻刮掉下层本体上的上皮层。
注意：结缔组织不被胰蛋白酶消化，因此在刮擦过程中不会剥落。 - 为了从组织中收集最大量的上皮细胞，将组织转移到另一个具有4mL完整培养基的60mm培养皿中，并重复刮擦步骤。
注意：确保避免用刀片尖端刮擦纸巾;请改用刀片式服务器的边缘。每个组织进行刮擦5-10分钟。 - 将无菌的100μm细胞过滤器放在50mL锥形管的顶部。
- 使用无菌移液器，将2mL胰蛋白酶溶液（从步骤4.1开始）转移到过滤器中以润湿其表面。
- 使用移液器，将细胞悬浮液在60mm培养皿（从步骤4.2-4.3）中混合几次，并通过步骤4.4-4.5中制备的100μm细胞过滤器过滤细胞。
- 使用血细胞计数器计数细胞数量。准备15μL台盼蓝溶液并加入15μL细胞悬浮液（步骤4.6）。将10μL细胞 - 台盼蓝混合物转移到血细胞计数器中并计数细胞数量。
注意：一块小鼠腭可以产生多达100万个细胞。 - 计数时，在室温下以100× g 离心管（从步骤4.6开始）5分钟。
- 用移液管吸出上清液。将2 mL完整培养基+螯合FBS加入试管中。通过使用5mL移液器多次研磨来重悬细胞沉淀。
- 将2-5 x 105 个细胞从一只小鼠放入预涂有I型胶原蛋白的24孔板的一个孔中（见 材料表）。
- 将细胞在37°C下孵育2天而不改变培养基。
- 接种后两天，用完整的培养基+螯合FBS替换一半的培养基。在显微镜下检查细胞形态。每2天用完全培养基+螯合FBS喂养细胞。
注意：接种后，将观察到不同大小的细胞。播种后约3-5天，可以观察到具有鹅卵石形态的角质形成细胞（图2）。在进行第一次传代之前需要1-2周的培养，并且在细胞准备好进行第二次和第三次传代之前需要随后的1-2周。之后，细胞将生长得更快，并且可以准备冷冻保存。细胞可以分别在第一次和第二次传代中重新接种到一个孔（24孔板）和6孔板中。随后的传代将取决于细胞生长和密度。第三次传代后可以使用1：2或1：3的细胞分裂比。
5. 角质形成细胞通过
- 从培养皿中收集2mL上清液，并分配到15mL锥形管（冰上）中。用无菌的1x PBS洗涤细胞两次。
注意：当细胞达到约70%-80%的汇合度时，它们就可以传代了。 - 将1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA加入培养皿中，加入6孔板的一个孔中。
- 在37°C下孵育5-15分钟;5分钟后检查细胞是否从培养皿中分离。
- 使用1mL胰蛋白酶抑制溶液和2mL完整培养基+螯合FBS通过温和移液中和反应。接下来，将细胞悬浮液转移到与步骤5.1相同的15mL锥形管中。
- 在4°C下以100× g 离心细胞悬浮液5分钟。 用移液管吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL完整培养基中。
- 使用血细胞计数器计数细胞。接下来，将1mL细胞悬浮液加入新的24或6孔培养板中。
注意：早期传代中的一些细胞可以在70%完全培养基+ 20%螯合FBS + 10%DMSO的混合物中冷冻。可以从一个汇合培养板中收集1-2个细胞冷冻管。
6. 角质形成细胞的冷冻保存和恢复
- 细胞冷冻
- 将角质形成细胞培养至80%-90%汇合度。
注意：不要让细胞过度生长，因为这会降低它们的增殖状态和活力。 - 用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理培养皿中的角质形成细胞，如步骤5.1-5.5中所述。
- 使用血细胞计数器计数角质形成细胞。根据计算的细胞数制备冷冻管，以允许将1 x 10 6 个细胞/ mL转移到每个小瓶中。
- 在4°C下以100× g 离心细胞悬浮液5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于10%DMSO + 20%螯合FBS + 70%完全培养基（9mL完全培养基+螯合FBS和1mL DMSO）的10mL溶液中。
- 将细胞以每瓶1mL悬浮液分配到冷冻管中。将小瓶置于-80°C的低温储存容器中过夜。 第二天将小瓶转移到液氮罐中。
- 将角质形成细胞培养至80%-90%汇合度。
- 细胞回收
- 从液氮罐中取出冷冻管，并在室温下部分解冻。在15 mL管中，将1mL细胞悬浮液与3mL完整培养基+螯合FBS混合。
- 将混合物在100× g 和4°C下离心5分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL完整培养基+螯合FBS中。
- 将细胞悬浮液接种到新的60 mm胶原蛋白I包被培养皿中。每2-3天更换培养基，并在汇合后传代细胞。
7. 免疫荧光染色
- 在6孔板（5×105 个细胞/孔）的方形盖玻片（22mm×22mm）上培养口腔角质形成细胞2天。
- 在室温下将角质形成细胞固定在4%多聚甲醛（PFA）和PBS的溶液中20分钟，然后用1x PBS洗涤三次。
- 在PBS中0.1%Triton的溶液中透化细胞。将细胞在封闭试剂（2.5%山羊血清，2.5%驴血清）中室温下孵育1小时，然后在4°C下与一抗（见 材料表）孵育过夜。
注意：一抗在以下稀释液中使用：兔抗K14（1：1000），大鼠α6-整合素（1：100），兔抗p63（1：500），兔抗K13（1：100）和山羊抗PDGFRα（1：100）。 - 在PBS中0.1%Triton的溶液中洗涤样品，然后在室温下与二抗孵育1小时。
注：二抗（Alexa 488或555）以1：300稀释度使用。 - 用Hoechst溶液对所有样品进行复染10分钟，并将细胞安装到载玻片上。
注意：Hoechst溶液用于染色细胞核。 - 使用共聚焦显微镜进行样品成像。
注：使用图像编辑软件将亮度和对比度调整为相等的强度。
Representative Results
从成人小鼠腭中解剖过程和口腔角质形成细胞的分离概述
从成年小鼠腭中收集解离的口腔角质形成细胞，并在定制的20%螯合-FBS中培养。小鼠腭由硬腭和软腭组成（图1C）。分离小鼠口腔角质形成细胞的程序总结在 图1D中。将腭组织解剖并转移到含有抗生素 - 抗真菌溶液的培养基中，然后在4°C下在0.025%胰蛋白酶溶液中孵育过夜。第二天，用胰蛋白酶抑制剂溶液和等体积的完整培养基处理腭组织。随后，使用手术刀刀片刮擦组织以收集口腔角质形成细胞。细胞悬浮液通过100μm细胞过滤器过滤并离心。然后将细胞接种在含有2mL完整培养基+螯合FBS的胶原蛋白I包衣24孔板中。
成功分离小鼠口腔角质形成细胞的代表性结果
原代口腔角质形成细胞生长为单层，并显示出鹅卵石形态（图2）。小角质形成细胞集落在3-5天时可见（图2A，B）;这些在孵育1周时变大并形成紧密的菌落（图2C）。角质形成细胞集落显示出基底角质形成细胞的典型形态学特征，表明其健康状况。人口服角质形成细胞在含有0.06mM Ca2 + 16，28的完整培养基中保持未分化几次。第一次通过是在初始电镀后约2周进行的（图2D）。在后来的传代中，角质形成细胞表现出稳定的生长，培养时间较短（图2E-G）。如果在分离过程中发生显着的成纤维细胞污染，角质形成细胞停止生长（图2H）。
分离的小鼠口服角质形成细胞表达基底细胞标志物
为了确认原代口腔角质形成细胞的状态，使用基础细胞标志物角蛋白14（K14）和α6-整合素34进行免疫染色。培养后在角质形成细胞中表达K14和α6-整合素（图3A，B）。细胞还用干细胞标记物p63染色以确认其干性。早期传代（传代4）和晚期传代（传代7）细胞表现出均匀表达的p63（图3C，D）。相反，用高钙（1.2mM诱导2天）处理的角质形成细胞表现出p63表达降低（图3E），表明高钙处理抑制了原代角质形成细胞中的干细胞相关基因，如前所述16。分化标志物角蛋白13（K13）在早期和晚期传代中均表现出罕见或无表达，并且在高钙处理下有显着表达（图3F-H）。为了测试角质形成细胞培养物中成纤维细胞污染的可能性，使用成纤维细胞标志物PDGFRα与小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）相比，使用同一组角质形成细胞进行染色。与MEF细胞中观察到的高表达相比，角质形成细胞培养物中没有PDGFRα的表达（图3I-3L）。这些结果表明，该方案可以成功地分离基底角质形成细胞，并将这些细胞维持在未分化状态。
图1：小鼠口腔角质形成细胞的解剖程序和分离概述。 （A）小鼠口腔示意图。（B）用于解剖腭和分离小鼠口腔角质形成细胞的器械。（C）小鼠腭的明场图像。比例尺：100μm. （D）协议摘要。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：成功分离小鼠口腔角质形成细胞的代表性结果。 （A-G）分离后培养 3 天 （A）、5 天 （B）、1 周 （C） 和 2 周 （D） 培养的原发性口腔角质形成细胞的时间过程图像。显示第一（E），第二（F）和第三（G）代后小鼠口腔角质形成细胞的形态。（H）小鼠口腔角质形成细胞培养物中成纤维细胞污染的例子。比例尺：400 μm，请点击此处查看此图的放大图。
图3：分离的小鼠口腔角质形成细胞表达基底细胞标志物。 （A-B）第4代中K14（A;红色）和α6-整合素（B;绿色）免疫荧光染色的代表性图像。（C-E）p63（绿色）在传代4（C），传代7（D）和高钙处理（E）中的免疫荧光染色的代表性图像。（F-H）K13（绿色）在传代4（F），传代7（G）和高钙治疗（H）中的免疫染色图像。（I-L）PDGFRα（红色）在传代4（I），传代7（J），高钙处理（K）和MEF（L）中的免疫染色图像。细胞核被赫赫斯特（蓝色）染色。比例尺：100 μm.请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
从人或小鼠皮肤表皮中分离出的原发性角质形成细胞已在研究和临床应用中使用多年12，13，15，18，27，28，29。相比之下，很少有方案用于从成年小鼠中分离和培养原代口腔角质形成细胞30，31，32。本研究使用商业完整培养基和螯合FBS来维持角质形成细胞处于增殖或干细胞样状态。该培养系统可用于分子和生化测定，以进一步了解口腔上皮干细胞的特征及其相关疾病。
此协议中包括几个关键步骤。首先，胰蛋白酶浓度和孵育时间对于产生用于后续培养的活细胞至关重要。我们始终如一地使用0.025%胰蛋白酶溶液，并在室温下在腔室罩中孵育16小时。如果不孵育足够长的时间，角质形成细胞将无法从组织中正确解离，导致最终细胞产量降低。其次，在第二天轻轻移液细胞悬浮液会显着影响细胞活力。刮擦应从上皮侧轻轻开始，每个组织样本不超过10分钟。最后，第一个分离的细胞悬浮液含有成纤维细胞和其他细胞类型;这些不需要的细胞通常会在随后的培养物中开始消失。
在细胞分离和培养过程中发现了潜在的局限性。在极少数情况下，成纤维细胞可能在分离过程中被污染，成纤维细胞可能在随后的传代中抑制角质形成细胞的生长（图2H）。有必要选择含有成纤维细胞生长抑制剂的商业培养基，以消除培养物中的这种污染。由于小鼠上颚和其他口腔粘膜的尺寸相对较小，因此一只小鼠的初始细胞产量可能较低。因此，该方案的整个培养期 - 直到冷冻保存阶段 - 比原发性皮肤角质形成细胞的培养期长。分离的口腔角质形成细胞最好在10次传代中使用，因为更长的培养期可能会改变细胞性质并降低干细胞的数量。
目前的方法表明，小鼠口腔角质形成细胞表现出紧密堆积的鹅卵石形态，并在增殖条件下形成单层菌落。它们还显示出基底标记α6-整合素，K14和干细胞标记p63的高表达。在未来的研究中，除了免疫荧光染色外，还将使用RNA测序，RT-PCR和蛋白质印迹分析来验证口服角质形成细胞的细胞异质性和纯度，这将进一步增强我们对这些细胞性质的理解。
2-3次传代后，口腔角质形成细胞足够稳定，可用于进一步的功能实验。重要的是，该培养方案可与转基因小鼠品系（包括基因敲除、Cre-loxP和tet诱导系统）结合使用，也可用于细胞和分子测定。因此，本方案为研究人员提供了一种基本而有效的方法，可用于进一步了解口腔角质形成细胞干细胞生物学。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了科学研究补助金（B）（20H03266）（向A.S.），早期职业科学家补助金（18K14709）（向A.S.），AMED（授予JP21gm6110016和21bm0704067（向A.S.）以及武田科学基金会（向A.S.）提供的研究补助金的支持。我们感谢熊本大学动物资源与开发中心和筑波大学动物资源中心对小鼠的出色护理。我们感谢熊本大学的IRCMS核心设施在共聚焦成像方面的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
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