Summary
Den nåværende protokollen beskriver isolasjonen og kulturen til orale keratinocytter avledet fra den voksne muspalmen. Det rapporteres også om en evalueringsmetode ved bruk av immunstaining.
Abstract
I årevis har de fleste studier som involverer keratinocytter blitt utført ved hjelp av humane og mus hud epidermale keratinocytter. Nylig har orale keratinocytter tiltrukket seg oppmerksomhet på grunn av deres unike funksjon og egenskaper. De opprettholder homeostase av det orale epitelet og tjener som ressurser for applikasjoner i regenerative terapier. In vitro-studier som bruker orale primær keratinocytter fra voksne mus har imidlertid vært begrenset på grunn av mangel på en effektiv og veletablert kulturprotokoll. Her ble orale primære keratinocytter isolert fra ganevevet til voksne mus og dyrket i et kommersielt lavkalsiummedium supplert med et chelexed-serum. Under disse forholdene ble keratinocytter opprettholdt i en proliferativ eller stamcellelignende tilstand, og deres differensiering ble hemmet selv etter økte passasjer. Markøruttrykksanalyse viste at de kultiverte orale keratinocyttene uttrykte basalcellemarkørene p63, K14 og α6-integrin og var negative for differensieringsmarkøren K13 og fibroblastmarkøren PDGFRα. Denne metoden produserte levedyktige og dyrkbare celler egnet for nedstrømsapplikasjoner i studiet av orale epitelbaserte stamcellefunksjoner in vitro.
Introduction
Det orale epitelet fungerer som en første barriere for å beskytte kroppen mot miljøbelastninger, inkludert kjemisk eller fysisk skade og bakterielle og virusinfeksjoner1,2. Den orale slimhinnen består av et ytre lag av stratifisert squamous epitel som består av keratinocytter og underliggende bindevev kalt lamina propria, som hovedsakelig består av fibroblaster og den ekstracellulære matrisen. Musen oral slimhinne kan bredt deles inn i tre undertyper: masticatory (hard gane og gingiva), spesialisert (dorsal tunge), og fôr (bukkal slimhinne, ventral tunge, myk gane, lepper) slimhinne2,3 (Figur 1A). Det orale epitelet er keratinisert i masticatory og spesialisert slimhinne og ikke-keratinisert i foringsslimhinnen. Til tross for sin anatomiske plassering, er det orale epitelet lik hudepidermis ved at det består av tettpakkede epitelceller med varierende grad av differensiering: basale lag som inneholder undifferentiated celler; spinøse, granulære og cornified lag som danner keratinisert epitel, eller mellomliggende og overfladiske lag som danner ikke-keratinisert epitel4. Transgene musemodeller har lagt til rette for studiet av orale epitelcellers cellulære og molekylære trekk i ganen, bukkal slimhinne, tunge og gingiva5,6,7,8,9,10,11. Imidlertid brukte de fleste av disse studiene primært in vivo museeksperimenter. Cellekultursystemer ble vanligvis ikke brukt på grunn av mangel på etablerte og effektive protokoller.
Et in vitro-kultursystem kan brukes til molekylær og biokjemisk analyse av stamcelleregulatorer, cellebaserte analyser og legemiddelscreening. For tiden er protokoller for kulturen av primære keratinocytter av hudepærene utviklet, der basale keratinocytter kan isoleres og dyrkes for kliniske og forskningsformål12,13,14,15. I 1980 viste Hennings et al. at en lav kalsiumkonsentrasjon (< 0,09 mM Ca2+) i kulturmediet la til rette for spredning og opprettholdt celler i en uavklart tilstand. Et høyere nivå av kalsium fremmet celledifferensiering og redusert spredning16. Deretter har kulturmetodikk for nyfødte og voksne murine epidermale keratinocytter blitt etablert og mye brukt på mange musemodeller med forskjellig genetisk bakgrunn for in vitro-studier17,18,19. Selv om hud og oral epithelia deler felles egenskaper, viser de også iboende forskjeller, for eksempel i deres keratiniseringsstatus, omsetningshastighet, genuttrykk og sårhelingsevne3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Selv om menneskelig oral keratinocyttkultur har blitt vellykket utført27,28,29, publikasjoner om mus muntlig keratinocytt kultur30,31,32 er begrenset på grunn av den lille størrelsen på målvevet og de distinkte egenskapene til cellene sammenlignet med hud epidermal keratinocytter. Denne protokollen beskriver isolasjon og langsiktige kulturteknikker av musen primære orale keratinocytter.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene fra Institutional Animal Experiment Committee ved Kumamoto University og University of Tsukuba.
1. Utarbeidelse av reagenser og kulturmedier
- Forbered 40 ml keratinocyttkulturmedium som inneholder 60 μM kalsium og 600 μL antibiotika-antimykotisk løsning. Forbered 20 ml 0,025% trypsin og 400 μL antibiotika-antimykotisk løsning.
- Tine trypsinhemmingsløsningen ved romtemperatur og hold den ved 4 °C til den brukes i trinn 4.1.
MERK: Isolasjonsreagenset er forberedt på vevsisolasjon av fem mus.
- Tine trypsinhemmingsløsningen ved romtemperatur og hold den ved 4 °C til den brukes i trinn 4.1.
- For å forberede kulturmediene, ta 500 ml medium og tilsett 5 ml av en veksttilskuddsløsning (se Materialfortegnelse) (heretter kalt komplett medium) og 20% kalsiumutarmet chelexed-fetal bovine serum (FBS)33 (heretter referert til som chelexed-FBS).
2. Disseksjon av ganevev fra voksen mus
- Ofre en voksen C57BL/6J mus (enten mann eller kvinne) ved cervical dislokasjon i samsvar med anleggets forskrifter om dyrevelferd.
- Fjern håret rundt munnen med en barbermaskin. Bruk saks, kutt fra kinnet mot kjeven, på begge sider.
MERK: Musen må bedøves før den ofres. En bedøvelsesblanding av medetomidin, midazolam og butorphanol brukes (se materialfortegnelse).
- Fjern håret rundt munnen med en barbermaskin. Bruk saks, kutt fra kinnet mot kjeven, på begge sider.
- Bruk tang for å åpne munnen bred og absorbere blod ved hjelp av en bomullspinne. For å desinfisere ganen, tørk innsiden av munnen med en bomullspinne som inneholder 10% povidon-jod.
- For å høste muspalmen, bruk først et kirurgisk skalpellblad for å lage et marginalt snitt i full tykkelse langs ganesiden av de maksillære tennene. Deretter dissekerer du forsiktig hele ganen ved hjelp av et raspatorium.
MERK: Et raspatorium er et verktøy som brukes til å heve en mukoperiosteal klaff (se materialtabellen) (figur 1B). - Overfør ganevevet raskt til et 15 ml rør som inneholder 4 ml komplett medium + antibiotika-antimykotisk løsning. Hold vevet på is til det er klart for inkubasjon.
MERK: For innsamling fra flere mus kan ganevev holdes på is i opptil 4 timer.
3. Forbehandling av ganevev
- I en laminær strømningshette, overfør vev til en 60 mm tallerken som inneholder 4 ml komplett medium + antibiotika-antimykotisk løsning.
- Bruk korte, stumpe tang og et skalpellblad, fjern forsiktig blod fra vevet. Vask vev 10 ganger i komplett medium.
- Overfør vev til en 35 mm tallerken som inneholder 4 ml 0,025% trypsin + antibiotika-antimykotisk løsning, med epiteloverflaten vendt ned.
MERK: Epiteloverflaten, som kurver innover, skal være gjennomvåt i trypsinoppløsningen; lamina propria bør møte opp. Vevet skal flates så mye som mulig for å inkuberes helt i trypsinoppløsningen. - Inkuber vev i 0,025% trypsin i ~ 16 timer ved romtemperatur i kulturhetten.
4. Innsamling og kultur av primære celler
- Bruk ett par stumpe tang, fjern vev fra trypsinoppløsning (i 35 mm parabolen) og overfør til trypsinhemmeroppløsning i en 60 mm tallerken (4 ml per tallerken) med epiteloverflaten vendt opp.
- Bruk tang til å holde på kanten av ganen, skrap forsiktig epitellaget av den underliggende lamina propria ved hjelp av et skalpellblad.
MERK: Bindevev fordøyes ikke av trypsin, så det skreller ikke av under skraping. - For å samle maksimal mengde epitelceller fra vev, overfør vevet til en annen 60 mm tallerken med 4 ml komplett medium og gjenta skrapetrinnet.
MERK: Sørg for å unngå å skrape vevet med bladets spiss; Bruk bladets kant i stedet. Skraping utføres i 5-10 min per vev. - Plasser en steril 100 μm cellesil på toppen av et 50 ml konisk rør.
- Bruk en steril pipette og overfør 2 ml trypsinoppløsning (fra trinn 4.1) til silen for å fukte overflaten.
- Bruk en pipette, bland cellefjæringen i 60 mm parabolen (fra trinn 4,2-4,3) noen ganger og filtrer celler gjennom 100 μm cellesil fremstilt i trinn 4,4-4,5.
- Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer. Forbered 15 μL trypan blå oppløsning og tilsett 15 μL celleoppheng (trinn 4.6). Overfør 10 μL av celle-trypan blå blanding til et hemocytometer og telle antall celler.
MERK: Ett stykke mus gane kan gi opptil 1 million celler. - Under telling, sentrifuger røret (fra trinn 4.6) ved 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten med en pipette. Tilsett 2 ml komplett medium + chelexed-FBS i røret. Resuspend cellepellet ved å triturere flere ganger ved hjelp av en 5 ml pipette.
- Plate 2-5 x 105 celler fra en mus til en brønn av en 24-brønns plate forhåndsbelagt med Kollagen type I (se Materialbord).
- Inkuber cellene ved 37 °C i 2 dager uten å endre mediet.
- To dager etter sådd erstatter du halvparten av kulturmediet med hele mediet + chelexed-FBS. Kontroller cellemorfologien under mikroskopet. Fôrceller med komplett medium + chelexed-FBS annenhver dag.
MERK: Etter sådd vil celler av forskjellige størrelser bli observert. Omtrent 3-5 dager etter sådd kan keratinocytter med brosteinsmorfologi (figur 2) observeres. Det vil ta 1-2 uker kultur før den første passasjen kan utføres og en etterfølgende 1-2 uker er nødvendig før cellene er klare for andre og tredje passasjer. Etter det vil cellene vokse raskere og kan være forberedt på kryopreservering. Celler kan re-belagt til en brønn (av en 24-brønns plate) og en 6-brønns plate i henholdsvis første og andre passasje. Den etterfølgende passasjen vil være avhengig av cellevekst og tetthet. Et celledelingsforhold på 1:2 eller 1:3 kan brukes etter det tredje avsnittet.
5. Keratinocytt passasje
- Samle 2 ml av supernatanten fra kulturretten og dispenser inn i et 15 ml konisk rør (på is). Vask cellene med steril 1x PBS to ganger.
MERK: Når cellene når omtrent 70% -80% samløp, er de klare for passasje. - Tilsett 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i parabolen til den ene brønnen på en 6-brønns plate.
- Inkuber i 5-15 min ved 37 °C; sjekk etter 5 min for å se om cellene løsner fra parabolen.
- Nøytraliser reaksjonen ved hjelp av 1 ml trypsininhiberingsløsning og 2 ml komplett kulturmedium + chelexed-FBS ved skånsom pipettering. Deretter overfører du cellefjæringen til samme 15 ml koniske rør som i trinn 5.1.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten med en pipette og resuspend cellepelleten i 1 ml komplett kulturmedium.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Deretter platen 1 ml av cellefjæringen i en ny 24- eller 6-brønns kulturplate.
MERK: Noen av cellene fra de tidlige passasjene kan fryses i en blanding av 70% komplett kulturmedium + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 kryonæringer av celler kan samles fra en sammenfallende kulturplate.
6. Kryopreservering og gjenvinning av keratinocytter
- Frysing av celler
- Øk keratinocytter til 80%-90% samløp.
MERK: Ikke la celler vokse overgrodd, da dette kan redusere spredningsstatusen og levedyktigheten. - Behandle keratinocyttene i parabolen med 0,05% trypsin-EDTA, som beskrevet i trinn 5.1-5.5.
- Tell keratinocyttene ved hjelp av et hemocytometer. Forbered kryovarier basert på beregnede cellenumre for å tillate overføring av 1 x 106 celler / ml til hvert hetteglass.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Kast den supernatante og resuspend cellepellet i en 10 ml løsning på 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% komplett kulturmedium (9 ml komplett medium + chelexed-FBS og 1 ml DMSO).
- Dispenser cellene i kryolegemer ved 1 ml suspensjon per hetteglass. Legg hetteglassene i en kryogen oppbevaringsbeholder over natten ved -80 °C. Overfør hetteglassene til en flytende nitrogentank neste dag.
- Øk keratinocytter til 80%-90% samløp.
- Gjenoppretting av celler
- Fjern en kryovial fra den flytende nitrogentanken og tin delvis ved romtemperatur. I et 15 ml rør blander du 1 ml cellefjæring med 3 ml komplett kulturmedium + chelexed-FBS.
- Sentrifuger blandingen i 5 min ved 100 x g og 4 °C. Kast den supernatante og resuspend pellet i 1 ml komplett kulturmedium + chelexed-FBS.
- Legg cellesuspensjonene i nye 60 mm Kollagen I-belagte kulturretter. Bytt ut kulturmediet hver 2-3 dager og passer cellene en gang sammenfallende.
7. Immunfluorescent farging
- Kultur orale keratinocytter på firkantede deksler (22 mm x 22 mm) i 6-brønnsplater (5 x 105 celler / brønn) i 2 dager.
- Fest keratinocytter i en løsning på 4% paraformaldehyd (PFA) og PBS i 20 min ved romtemperatur før vask tre ganger med 1x PBS.
- Permeabiliser celler i en løsning på 0,1% Triton i PBS. Inkuber celler i blokkerende reagens (2,5% geitserum, 2,5% eselserum) i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av inkubering over natten med primære antistoffer (se Materialtabell) ved 4 °C.
MERK: Primære antistoffer ble brukt ved følgende fortynninger: kanin anti-K14 (1:1000), rotte α6-integrin (1:100), kanin anti-p63 (1:500), kanin anti-K13 (1:100) og geit anti-PDGFRα (1:100). - Vask prøver i en løsning på 0,1% Triton i PBS, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur.
MERK: De sekundære antistoffene (Alexa 488 eller 555) ble brukt ved en fortynning på 13.300. - Forsenk alle prøver med Hoechst-oppløsning i 10 min og monter celler på glasssklier.
MERK: Hoechst-oppløsningen brukes til å farge cellenes kjerne. - Utfør prøveavbildning ved hjelp av et konfokalt mikroskop.
MERK: Lysstyrken og kontrasten justeres til lik intensitet ved hjelp av bilderedigeringsprogramvare.
Representative Results
Oversikt over disseksjonsprosessen og isolering av orale keratinocytter fra den voksne muspalmen
Dissosierte orale keratinocytter ble samlet inn fra den voksne muspalmen og dyrket i en tilpasset 20% chelexed-FBS. Musganen består av den harde ganen og den myke ganen (figur 1C). Prosedyren for isolering av mus oral keratinocytter er oppsummert i figur 1D. Ganevevet dissekeres og overføres til et medium som inneholder en antibiotika-antimykotisk løsning før det inkuberes i 0,025% trypsinoppløsning ved 4 °C over natten. Neste dag behandles ganevevet med trypsinhemmerløsning og komplett kulturmedium i like store mengder. Deretter skrapes vevet ved hjelp av et kirurgisk skalpellblad for å samle orale keratinocytter. Cellesuspensjonen filtreres gjennom en 100 μm cellesil og sentrifugeres. Cellene blir deretter sådd i Kollagen I-belagte 24-brønnsplater som inneholder 2 ml komplett kulturmedium + chelexed-FBS.
Representative resultater av vellykket isolasjon av mus oral keratinocytter
Primær oral keratinocytter vokste som monolayer og viste en brosteinsmorfologi (figur 2). Små keratinocyttkolonier var synlige ved 3-5 dager (figur 2A,B); Disse vokste seg større og dannet tette kolonier ved 1 uke med inkubasjon (figur 2C). Keratinocyttkolonier viste de typiske morfologiske egenskapene til basale keratinocytter, noe som indikerer deres sunne forhold. Humane orale keratinocytter forble undifferentiated for flere passasjer i hele kulturmediet som inneholder 0,06 mM Ca2 + 16,28. Den første passasjen ble utført ca. 2 uker fra den første platingen (figur 2D). Ved senere passasjer viste keratinocytter stabil vekst med en kortere kulturperiode (figur 2E-G). Keratinocytter sluttet å vokse hvis det oppstod betydelig fibroblasterforurensning under isolasjonsprosessen (figur 2H).
Isolert mus oral keratinocytter uttrykke basal celle markører
For å bekrefte statusen til primære orale keratinocytter ble det utført immunostaining ved hjelp av basale cellemarkører Keratin 14 (K14) og α6-integrin34. K14 og α6-integrin ble uttrykt i keratinocytter etter culturing (figur 3A,B). Cellene ble også farget med stamcellemarkør p63 for å bekrefte deres stemness. Tidlige passeringsceller (passasje 4) og sen passasje (passasje 7) viste etsartet uttrykk for p63 (figur 3C, D). Derimot viste keratinocytter behandlet med høyt kalsium (1,2 mM induksjon i 2 dager) redusert p63-uttrykk (figur 3E), noe som indikerer at høy kalsiumbehandling undertrykker stamcellerelaterte gener i primære keratinocytter som tidligere rapportert16. Differensieringsmarkøren Keratin 13 (K13) viste sjeldne eller ingen uttrykk i både tidlige og sene passasjer og signifikant uttrykk under høy kalsiumbehandling (figur 3F-H). For å teste muligheten for fibroblastforurensning i keratinocyttkulturen, ble farging ved hjelp av fibroblastmarkøren PDGFRα utført med samme sett med keratinocytter sammenlignet med musen embryonal fibroblast (MEFs). Det var ikke noe uttrykk for PDGFRα i keratinocyttkulturen, sammenlignet med det høye uttrykket observert i MEF-celler (figur 3I-3L). Disse resultatene indikerte at denne protokollen kunne isolere basale keratinocytter og vedlikeholde disse cellene i uavklart tilstand.
Figur 1: Oversikt over disseksjonsprosedyren og isolering av mus orale keratinocytter. (A) Skjematisk representasjon av musens munnhule. (B) Instrumenter som brukes til å dissekere ganen og isolere mus oral keratinocytter. (C) Brightfield bilde av musen gane. Skalastang: 100 μm. (D) Sammendrag av protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av vellykket isolasjon av mus oral keratinocytter. (A-G) Tidskursbilder av kultivert primær oral keratinocytter ved 3 dager (A), 5 dager (B), 1 uke (C) og 2 uker (D) kultur etter isolasjon. Morfologier av mus oral keratinocytter etter de første (E), andre (F) og tredje (G) passasjer vises. (H) Eksempel på fibroblastforurensning i mus oral keratinocyttkultur. Skalalinje: 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Isolerte mus orale keratinocytter uttrykker basale cellemarkører. (A-B) Representative bilder av immunfluorescerende farging av K14 (A; rød) og α6-integrin (B; grønn) i passasje 4. (C-E) Representative bilder av immunfluorescerende farging av p63 (grønn) i passasje 4 (C), passasje 7 (D) og høy kalsiumbehandling (E). (F-H) Immundempende bilder av K13 (grønn) i passasje 4 (F), passasje 7 (G) og høy kalsiumbehandling (H). (I-L) Immundempende bilder av PDGFRα (rød) i passasje 4 (I), passasje 7 (J), høy kalsiumbehandling (K) og MEF-er (L). Nuclei er farget med Hoechst (blå). Skalastenger: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Primære keratinocytter isolert fra humane eller mus hud epidermis har blitt brukt i mange år i forskning og kliniske applikasjoner12,13,15,18,27,28,29. Til sammenligning er det etablert få protokoller for å isolere og dyrke primære orale keratinocytter fra voksne mus30,31,32. Den nåværende studien brukte et kommersielt komplett kulturmedium og chelexed-FBS for å opprettholde keratinocytter i en proliferativ eller stamcellelignende tilstand. Dette kultursystemet kan brukes i molekylære og biokjemiske analyser for å forstå egenskapene til orale epitelceller og deres relaterte sykdommer ytterligere.
Flere kritiske trinn er inkludert i denne protokollen. For det første er trypsinkonsentrasjonen og inkubasjonstiden avgjørende for å produsere levedyktige celler for etterfølgende kulturer. Vi brukte konsekvent 0,025% trypsinløsninger og 16 timers inkubasjonsperioder i kammerhetten ved romtemperatur. Hvis ikke inkuberes i tilstrekkelig tid, vil keratinocytter ikke riktig dissosiere fra vevet, noe som resulterer i et lavere sluttcelleutbytte. For det andre påvirker mild pipettering av cellefjæringen på den andre dagen spesielt celle levedyktighet. Skraping bør forsiktig starte fra epitelsiden og ikke overstige 10 min per vevsprøve. Til slutt inneholder den første isolerte cellesuspensjonen fibroblaster og andre celletyper; Disse uønskede cellene vil vanligvis begynne å forsvinne i etterfølgende kulturer.
Potensielle begrensninger ble identifisert under celleisolasjon og kultur. I sjeldne tilfeller kan fibroblaster bli forurenset under isolasjonsprosessen, og fibroblaster kan hemme veksten av keratinocytter i etterfølgende passasjer (figur 2H). Det er nødvendig å velge et kommersielt medium som inneholder en fibroblast veksthemmer for å eliminere slik forurensning i kulturen. Fordi musganen og andre orale slimhinner har relativt små størrelser, kan det opprinnelige celleutbyttet fra en mus være lavt. Derfor er hele kulturperioden i denne protokollen - til kryopreserveringsstadiet - lengre enn det for primære hud keratinocytter. Isolerte orale keratinocytter brukes best innen 10 passasjer, da mer utvidede kulturperioder kan endre celleegenskapene og senke antall stamceller.
Den nåværende metoden viste at mus oral keratinocytter viste en tettpakket, brosteinsmorfologi og dannet monolayerkolonier under proliferative forhold. De viste også høyt uttrykk for basalmarkørene α6-integrin, K14 og stamcellemarkør p63. I fremtidige studier, i tillegg til immunfluorescensfarging, vil RNA-sekvensering, RT-PCR og vestlige blotteranalyser bli brukt til å verifisere cellulær heterogenitet og renhet av orale keratinocytter, noe som ytterligere vil forbedre vår forståelse av arten av disse cellene.
Etter 2-3 passasjer var orale keratinocytter stabile nok til å brukes i ytterligere funksjonelle eksperimenter. Viktigst, denne kulturprotokollen kan kombineres med transgene muselinjer, inkludert gen knockout, Cre-loxP, og tet-induserbare systemer, og kan også brukes i cellulære og molekylære analyser. Dermed gir den nåværende protokollen forskere en grunnleggende og effektiv metode som kan brukes til å forstå oral keratinocytt stamcellebiologi videre.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (til A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (til A.S.), AMED under Grant Number JP21gm6110016 og 21bm0704067 (til A.S.), og forskningsstipend fra Takeda Science Foundation (til A.S.). Vi takker Center for Animal Resources and Development ved Kumamoto University og Animal Resource Center ved University of Tsukuba for deres utmerkede musepleie. Vi takker IRCMS kjerneanlegg ved Kumamoto University for sin støtte til konfikal avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
