Summary
Het huidige protocol beschrijft de isolatie en cultuur van orale keratinocyten afgeleid van het volwassen muizengehemelte. Een evaluatiemethode met behulp van immunostaining wordt ook gemeld.
Abstract
Jarenlang zijn de meeste studies met keratinocyten uitgevoerd met behulp van epidermale keratinocyten van de huid van mens en muis. Onlangs hebben orale keratinocyten de aandacht getrokken vanwege hun unieke functie en kenmerken. Ze onderhouden de homeostase van het orale epitheel en dienen als middelen voor toepassingen in regeneratieve therapieën. In vitro studies die orale primaire keratinocyten van volwassen muizen gebruiken, zijn echter beperkt vanwege het ontbreken van een efficiënt en goed ingeburgerd kweekprotocol. Hier werden orale primaire keratinocyten geïsoleerd uit de gehemelteweefsels van volwassen muizen en gekweekt in een commercieel calciumarm medium aangevuld met een chelex-serum. Onder deze omstandigheden werden keratinocyten in een proliferatieve of stamcelachtige toestand gehouden en hun differentiatie werd geremd, zelfs na verhoogde passages. Markerexpressieanalyse toonde aan dat de gekweekte orale keratinocyten de basale celmarkers p63, K14 en α6-integrine tot expressie brachten en negatief waren voor de differentiatiemarker K13 en de fibroblastmarker PDGFRα. Deze methode produceerde levensvatbare en kweekbare cellen die geschikt zijn voor downstream-toepassingen in de studie van orale epitheelstamcelfuncties in vitro.
Introduction
Het orale epitheel dient als een eerste barrière bij het beschermen van het lichaam tegen omgevingsstress, waaronder chemische of fysieke schade en bacteriële en virale infecties1,2. Het mondslijmvlies bestaat uit een buitenste laag gelaagd plaveiselepitheel dat bestaat uit keratinocyten en onderliggend bindweefsel, de lamina propria genaamd, dat voornamelijk bestaat uit fibroblasten en de extracellulaire matrix. Het mondslijmvlies van de muis kan grofweg worden onderverdeeld in drie subtypen: kauw (hard gehemelte en gingiva), gespecialiseerd (dorsale tong) en voering (buccale mucosa, ventrale tong, zacht gehemelte, lippen) slijmvlies2,3 (figuur 1A). Het orale epitheel is verhoornd in het kauw- en gespecialiseerde slijmvlies en niet-verhoornd in het slijmvlies. Ondanks de anatomische locatie is het orale epitheel vergelijkbaar met de huidepitheel in die zin dat het bestaat uit dicht opeengepakte epitheelcellen met verschillende gradaties van differentiatie: basale lagen die ongedifferentieerde cellen bevatten; spineuze, korrelige en verhoornde lagen die verhoornd epitheel vormen, of tussenliggende en oppervlakkige lagen die niet-verhoornd epitheel vormen4. Transgene muismodellen hebben de studie van de cellulaire en moleculaire kenmerken van orale epitheelstamcellen in het gehemelte, buccale mucosa, tong en gingiva5 vergemakkelijkt,6,7,8,9,10,11. De meeste van deze studies gebruikten echter voornamelijk in vivo muisexperimenten. Celkweeksystemen werden meestal niet gebruikt vanwege een gebrek aan gevestigde en efficiënte protocollen.
Een in vitro kweeksysteem kan worden gebruikt voor de moleculaire en biochemische analyse van stamcelregulatoren, celgebaseerde testen en screening van geneesmiddelen. Momenteel zijn protocollen voor de kweek van primaire keratinocyten van de huidepidemis ontwikkeld, waarin basale keratinocyten met succes kunnen worden geïsoleerd en gekweekt voor klinische en onderzoeksdoeleinden12,13,14,15. In 1980 toonden Hennings et al. aan dat een lage calciumconcentratie (< 0,09 mM Ca2+) in het kweekmedium proliferatie vergemakkelijkte en cellen in een ongedifferentieerde toestand hield. Een hoger calciumgehalte bevorderde celdifferentiatie en verminderde proliferatie16. Vervolgens zijn kweekmethoden voor neonatale en volwassen murine epidermale keratinocyten vastgesteld en op grote schaal toegepast op tal van muismodellen met verschillende genetische achtergronden voor in vitro studies17,18,19. Hoewel huid en orale epithelia gemeenschappelijke kenmerken hebben, vertonen ze ook intrinsieke verschillen, bijvoorbeeld in hun keratinisatiestatus, omloopsnelheid, genexpressie en wondgenezend vermogen3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Hoewel de menselijke orale keratinocytenkweek met succes is uitgevoerd27,28,29, zijn publicaties over de orale keratinocytencultuur van muizen30,31,32 beperkt vanwege de kleine omvang van het doelweefsel en de verschillende kenmerken van de cellen in vergelijking met huidepidemale keratinocyten. Dit protocol beschrijft de isolatie- en langetermijnkweektechnieken van primaire orale keratinocyten van muizen.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Experiment Committee aan de Kumamoto University en de University of Tsukuba.
1. Bereiding van reagentia en kweekmedia
- Bereid 40 ml keratinocytenkweekmedium met 60 μM calcium en 600 μL antibiotisch-antimycotische oplossing. Bereid 20 ml 0,025% trypsine en 400 μL antibiotisch-antimycotische oplossing.
- Ontdooi de trypsineremmingsoplossing bij kamertemperatuur en houd deze op 4 °C tot gebruik in stap 4.1.
OPMERKING: Het isolatiereagens is voorbereid voor de weefselisolatie van vijf muizen.
- Ontdooi de trypsineremmingsoplossing bij kamertemperatuur en houd deze op 4 °C tot gebruik in stap 4.1.
- Neem voor de bereiding van de kweekmedia 500 ml medium en voeg 5 ml groeisupplementoplossing (zie materiaaltabel) (hierna "volledig medium" genoemd) en 20% calciumarm chelex-foetaal runderserum (FBS)33 (hierna chelex-FBS genoemd) toe.
2. Dissectie van gehemelteweefsel van volwassen muis
- Offer een volwassen C57BL/6J-muis (mannelijk of vrouwelijk) op door cervicale dislocatie in overeenstemming met de voorschriften van de faciliteit met betrekking tot dierenwelzijn.
- Verwijder het haar rond de mond met een scheerapparaat. Met behulp van een schaar, gesneden van de wang naar de kaak, aan beide zijden.
OPMERKING: De muis moet worden verdoofd voordat hij wordt opgeofferd. Een verdovend mengsel van medetomidine, midazolam en butorphanol wordt gebruikt (zie Tabel met materialen).
- Verwijder het haar rond de mond met een scheerapparaat. Met behulp van een schaar, gesneden van de wang naar de kaak, aan beide zijden.
- Gebruik een tang om de mond wijd te openen en eventueel bloed te absorberen met behulp van een wattenstaafje. Om het gehemelte te desinfecteren, veegt u de binnenkant van de mond af met een wattenstaafje met 10% povidon-jodium.
- Om het muizengehemelte te oogsten, gebruikt u eerst een chirurgisch scalpelmes om een marginale incisie van volledige dikte langs de gehemeltezijde van de maxillaire tanden te maken. Ontleed vervolgens zorgvuldig het hele gehemelte met behulp van een raspatorium.
OPMERKING: Een raspatorium is een hulpmiddel dat wordt gebruikt om een mucoperiosteale flap te verheffen (zie Tabel met materialen) (figuur 1B). - Breng het gehemelteweefsel snel over naar een buis van 15 ml met 4 ml volledig medium + antibiotisch-antimycotische oplossing. Houd de weefsels op ijs totdat ze klaar zijn voor incubatie.
OPMERKING: Voor het verzamelen van meerdere muizen kunnen gehemelteweefsels tot 4 uur op ijs worden bewaard.
3. Voorbehandeling van gehemelteweefsel
- Breng in een laminaire stroomkap weefsels over naar een schaal van 60 mm met 4 ml volledig medium + antibiotisch-antimycotische oplossing.
- Gebruik een korte, stompe tang en een scalpelmesje om voorzichtig bloed uit de weefsels te verwijderen. Was tissues 10 keer in volledig medium.
- Breng weefsels over in een schaal van 35 mm met 4 ml 0,025% trypsine + antibiotisch-antimycotische oplossing, met het epitheeloppervlak naar beneden gericht.
OPMERKING: Het epitheeloppervlak, dat naar binnen buigt, moet worden gedrenkt in de trypsine-oplossing; de lamina propria moet naar boven gericht zijn. Het weefsel moet zoveel mogelijk worden afgeplat om volledig in de trypsine-oplossing te worden geïncubeerd. - Incubeer weefsels in 0,025% trypsine gedurende ~ 16 uur bij kamertemperatuur in de kweekkap.
4. Verzameling en kweek van primaire cellen
- Verwijder met één stompe tang weefsel uit de trypsine-oplossing (in de schotel van 35 mm) en breng over op trypsineremmeroplossing in een schaal van 60 mm (4 ml per schotel) met het epitheeloppervlak naar boven gericht.
- Gebruik een tang om de rand van het gehemelte vast te houden en schraap de epitheellaag voorzichtig van de onderliggende lamina propria met behulp van een scalpelmes.
OPMERKING: Bindweefsel wordt niet verteerd door trypsine, dus het bladdert niet af tijdens het schrapen. - Om de maximale hoeveelheid epitheelcellen uit weefsels te verzamelen, brengt u het weefsel over in een andere schaal van 60 mm met een volledig medium van 4 ml en herhaalt u de schraapstap.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het weefsel niet schraapt met de punt van het mes; gebruik in plaats daarvan de rand van het mes. Schrapen wordt uitgevoerd gedurende 5-10 minuten per weefsel. - Plaats een steriele celzeef van 100 μm op de bovenkant van een conische buis van 50 ml.
- Breng met behulp van een steriele pipet 2 ml trypsine-oplossing (vanaf stap 4.1) over in de zeef om het oppervlak nat te maken.
- Meng met behulp van een pipet de celsuspensie in de 60 mm schaal (uit stap 4.2-4.3) een paar keer en filter cellen door de 100 μm celzeef bereid in stappen 4.4-4.5.
- Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Bereid 15 μL trypan blauwe oplossing en voeg 15 μL celsuspensie toe (stap 4.6). Breng 10 μL van het cel-trypan blauwe mengsel over naar een hemocytometer en tel het aantal cellen.
OPMERKING: Een stuk muizengehemelte kan tot 1 miljoen cellen opleveren. - Centrifugeer tijdens het tellen de buis (vanaf stap 4.6) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 100 x g .
- Aspirateer het supernatant met een pipet. Voeg 2 ml volledig medium + chelexed-FBS toe aan de buis. Resuspend de celkorrel door meerdere keren te tritureren met behulp van een pipet van 5 ml.
- Plaat 2-5 x 105 cellen van één muis in één put van een 24-putplaat voorgecoat met collageentype I (zie Tabel met materialen).
- Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 2 dagen zonder het medium te veranderen.
- Vervang twee dagen na het zaaien de helft van het kweekmedium door het volledige medium + chelexed-FBS. Controleer de celmorfologie onder de microscoop. Voer cellen met volledig medium + chelexed-FBS om de 2 dagen.
OPMERKING: Na het zaaien worden cellen van verschillende groottes waargenomen. Ongeveer 3-5 dagen na het zaaien kunnen keratinocyten met een geplaveide morfologie (figuur 2) worden waargenomen. Het duurt 1-2 weken van de kweek voordat de eerste passage kan worden uitgevoerd en een volgende 1-2 weken is nodig voordat de cellen klaar zijn voor de tweede en derde passage. Daarna zullen cellen sneller groeien en kunnen ze worden voorbereid op cryopreservatie. Cellen kunnen worden omgevormd tot één put (van een 24-putplaat) en een 6-putplaat in respectievelijk de eerste en tweede passage. De daaropvolgende passage zal afhankelijk zijn van de celgroei en -dichtheid. Een celsplitsingsverhouding van 1:2 of 1:3 kan worden gebruikt na de derde passage.
5. Keratinocyten passage
- Verzamel 2 ml van het supernatant uit de kweekschaal en doseer in een conische buis van 15 ml (op ijs). Was de cellen tweemaal met steriele 1x PBS.
OPMERKING: Wanneer de cellen ongeveer 70% -80% confluentie bereiken, zijn ze klaar voor passage. - Voeg 1 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan het gerecht in de put van een bord met 6 putten.
- Incubeer gedurende 5-15 minuten bij 37 °C; controleer na 5 minuten of de cellen loskomen van de schaal.
- Neutraliseer de reactie met behulp van 1 ml trypsine-remmingsoplossing en 2 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS door zacht pipetteren. Breng vervolgens de celsuspensie over in dezelfde conische buis van 15 ml als in stap 5.1.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op met een pipet en resuspend de celkorrel in 1 ml volledig kweekmedium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Vervolgens plaat 1 ml van de celsuspensie in een nieuwe 24- of 6-well kweekplaat.
OPMERKING: Sommige cellen uit de vroege passages kunnen worden ingevroren in een mengsel van 70% volledig kweekmedium + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 cryovialen van cellen kunnen worden verzameld uit één confluentcultuurplaat.
6. Cryopreservatie en herstel van keratinocyten
- Cel bevriezen
- Groei keratinocyten tot 80% -90% confluentie.
OPMERKING: Laat cellen niet overgroeien, omdat dit hun proliferatiestatus en levensvatbaarheid zou kunnen verminderen. - Behandel de keratinocyten in de schaal met 0,05% trypsine-EDTA, zoals beschreven in stappen 5.1-5.5.
- Tel de keratinocyten met behulp van een hemocytometer. Bereid cryovialen voor op basis van berekende celaantallen om de overdracht van 1 x 106 cellen / ml naar elke injectieflacon mogelijk te maken.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in een 10 ml oplossing van 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% volledig kweekmedium (9 ml volledig medium + chelexed-FBS en 1 ml DMSO).
- Doseer de cellen in cryovialen bij 1 ml suspensie per injectieflacon. Plaats de injectieflacons 's nachts in een cryogene opslagcontainer bij -80 °C. Breng de injectieflacons de volgende dag over in een tank met vloeibare stikstof.
- Groei keratinocyten tot 80% -90% confluentie.
- Celherstel
- Verwijder een cryovial uit de tank met vloeibare stikstof en ontdooi gedeeltelijk bij kamertemperatuur. Meng in een buis van 15 ml 1 ml van de celsuspensie met 3 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS.
- Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 100 x g en 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 1 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS.
- Verdeel de celsuspensies in nieuwe 60 mm collageen I-gecoate kweekschalen. Vervang het kweekmedium om de 2-3 dagen en passeer de cellen eenmaal samenvloeiend.
7. Immunofluorescente kleuring
- Kweek orale keratinocyten op vierkante coverslips (22 mm x 22 mm) in 6-well platen (5 x 105 cellen/put) gedurende 2 dagen.
- Fixeer keratinocyten in een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) en PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u drie keer wordt gewassen met 1x PBS.
- Permeabiliseer cellen in een oplossing van 0,1% Triton in PBS. Incubeer cellen in blokkerend reagens (2,5% geitenserum, 2,5% ezelserum) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie 's nachts met primaire antilichamen (zie Tabel met materialen) bij 4 °C.
OPMERKING: Primaire antilichamen werden gebruikt bij de volgende verdunningen: konijn anti-K14 (1:1000), rat α6-integrine (1:100), konijn anti-p63 (1:500), konijn anti-K13 (1:100) en geit anti-PDGFRα (1:100). - Was monsters in een oplossing van 0,1% Triton in PBS, gevolgd door incubatie met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De secundaire antilichamen (Alexa 488 of 555) werden gebruikt bij een verdunning van 1:300. - Counterstain alle monsters met Hoechst oplossing gedurende 10 minuten en monteer cellen op glazen dia's.
OPMERKING: Hoechst-oplossing wordt gebruikt om de kernen van cellen te kleuren. - Voer monsterbeeldvorming uit met behulp van een confocale microscoop.
OPMERKING: De helderheid en het contrast worden aangepast aan dezelfde intensiteit met behulp van beeldbewerkingssoftware.
Representative Results
Overzicht van het dissectieproces en de isolatie van orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte
Gedissocieerde orale keratinocyten werden verzameld uit het volwassen muizengehemelte en gekweekt in een aangepaste 20% chelexed-FBS. Het muizengehemelte bestaat uit het harde gehemelte en het zachte gehemelte (figuur 1C). De procedure voor de isolatie van orale keratinocyten van muizen is samengevat in figuur 1D. Het gehemelteweefsel wordt ontleed en overgebracht naar een medium dat een antibiotisch-antimycotische oplossing bevat voordat het wordt geïncubeerd in 0,025% trypsine-oplossing bij 4 °C gedurende de nacht. De volgende dag wordt het gehemelteweefsel behandeld met trypsineremmeroplossing en volledig kweekmedium in gelijke volumes. Vervolgens worden de weefsels geschraapt met behulp van een chirurgisch scalpelmes om orale keratinocyten te verzamelen. De celsuspensie wordt gefilterd door een celzeef van 100 μm en gecentrifugeerd. De cellen worden vervolgens gezaaid in collageen I-gecoate 24-well platen met 2 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS.
Representatieve resultaten van de succesvolle isolatie van orale keratinocyten bij muizen
Primaire orale keratinocyten groeiden als een monolaag en vertoonden een geplaveide morfologie (figuur 2). Kleine keratinocytenkolonies waren zichtbaar na 3-5 dagen (figuur 2A,B); deze werden groter en vormden strakke kolonies na 1 week incubatie (figuur 2C). Keratinocytenkolonies vertoonden de typische morfologische kenmerken van basale keratinocyten, wat wijst op hun gezonde omstandigheden. Menselijke orale keratinocyten bleven ongedifferentieerd gedurende verschillende passages in het volledige kweekmedium dat 0,06 mM Ca2+16,28 bevatte. De eerste passage werd ongeveer 2 weken na de eerste beplating uitgevoerd (figuur 2D). Bij latere passages vertoonden keratinocyten een stabiele groei met een kortere periode van kweek (figuur 2E-G). Keratinocyten stopten met groeien als significante fibroblastenbesmetting optrad tijdens het isolatieproces (figuur 2H).
Geïsoleerde orale keratinocyten van muizen drukken basale celmarkers uit
Om de status van primaire orale keratinocyten te bevestigen, werd immunostaining uitgevoerd met behulp van de basale celmarkers Keratin 14 (K14) en α6-integrin34. K14 en α6-integrine kwamen tot expressie in keratinocyten na het kweken (figuur 3A,B). De cellen werden ook gekleurd met stamcelmarker p63 om hun stamheid te bevestigen. Vroege passage (passage 4) en late passage (passage 7) cellen vertoonden uniforme expressie van p63 (figuur 3C,D). Daarentegen vertoonden keratinocyten behandeld met een hoog calciumgehalte (1,2 mM inductie gedurende 2 dagen) een verminderde p63-expressie (figuur 3E), wat aangeeft dat een hoge calciumbehandeling stamcelgerelateerde genen in primaire keratinocyten onderdrukt, zoals eerder gemeld16. De differentiatiemarker Keratine 13 (K13) vertoonde zeldzame of geen expressie in zowel vroege als late passages en significante expressie onder behandeling met een hoog calciumgehalte (figuur 3F-H). Om de mogelijkheid van fibroblastbesmetting in de keratinocytencultuur te testen, werd kleuring met behulp van de fibroblastmarker PDGFRα uitgevoerd met dezelfde set keratinocyten in vergelijking met embryonale fibroblasten (MEF's) bij muizen. Er was geen expressie van PDGFRα in de keratinocytencultuur, vergeleken met de hoge expressie waargenomen in MEF-cellen (figuur 3I-3L). Deze resultaten gaven aan dat dit protocol met succes basale keratinocyten kon isoleren en deze cellen in de ongedifferentieerde toestand kon houden.
Figuur 1: Overzicht van de dissectieprocedure en isolatie van orale keratinocyten bij muizen. (A) Schematische weergave van de mondholte van de muis. (B) Instrumenten die worden gebruikt om het gehemelte te ontleden en orale keratinocyten van muizen te isoleren. (C) Brightfield-afbeelding van het muizenpalet. Schaalbalk: 100 μm. (D) Samenvatting van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van de succesvolle isolatie van orale keratinocyten bij muizen. (A-G) Tijdsverloopbeelden van gekweekte primaire orale keratinocyten na 3 dagen (A), 5 dagen (B), 1 week (C) en 2 weken (D) kweek na isolatie. Morfologieën van orale keratinocyten van muizen na de eerste (E), tweede (F) en derde (G) passages worden getoond. (H) Voorbeeld van fibroblastbesmetting in orale keratinocytencultuur bij muizen. Schaalbalk: 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geïsoleerde orale keratinocyten van muizen drukken basale celmarkers uit. (A-B) Representatieve beelden van immunofluorescente kleuring van K14 (A; rood) en α6-integrine (B; groen) in passage 4. (C-E) Representatieve beelden van immunofluorescente kleuring van p63 (groen) in passage 4 (C), passage 7 (D) en hoge calciumbehandeling (E). (F-H) Immunostaining beelden van K13 (groen) in passage 4 (F), passage 7 (G) en hoge calciumbehandeling (H). (I-L) Immunostaining beelden van PDGFRα (rood) in passage 4 (I), passage 7 (J), hoge calciumbehandeling (K) en MEF's (L). Kernen zijn gekleurd met Hoechst (blauw). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Primaire keratinocyten geïsoleerd uit de epidermis van de menselijke of muizenhuid worden al vele jaren gebruikt in onderzoek en klinische toepassingen12,13,15,18,27,28,29. Daarentegen zijn er weinig protocollen opgesteld om primaire orale keratinocyten van volwassen muizen te isoleren en te kweken30,31,32. De huidige studie gebruikte een commercieel volledig kweekmedium en chelexed-FBS om keratinocyten in een proliferatieve of stamcelachtige toestand te houden. Dit kweeksysteem kan worden gebruikt in moleculaire en biochemische testen om de kenmerken van orale epitheelstamcellen en hun gerelateerde ziekten verder te begrijpen.
In dit protocol zijn verschillende kritische stappen opgenomen. Ten eerste zijn de trypsineconcentratie en de incubatietijd essentieel bij het produceren van levensvatbare cellen voor volgende culturen. We gebruikten consequent 0,025% trypsine-oplossingen en 16 uur incubatietijd in de kamerkap bij kamertemperatuur. Indien niet gedurende voldoende tijd geïncubeerd, zouden keratinocyten niet goed dissociëren van het weefsel, wat resulteert in een lagere uiteindelijke celopbrengst. Ten tweede beïnvloedt het voorzichtig pipetteren van de celsuspensie op de tweede dag met name de levensvatbaarheid van de cel. Het schrapen moet voorzichtig beginnen vanaf de epitheliale kant en niet langer zijn dan 10 minuten per weefselmonster. Ten slotte bevat de eerste geïsoleerde celsuspensie fibroblasten en andere celtypen; deze ongewenste cellen zullen meestal beginnen te verdwijnen in volgende culturen.
Mogelijke beperkingen werden geïdentificeerd tijdens celisolatie en kweek. In zeldzame gevallen kunnen fibroblasten besmet zijn tijdens het isolatieproces en kunnen de fibroblasten de groei van keratinocyten in volgende passages remmen (figuur 2H). Het is noodzakelijk om een commercieel medium te selecteren dat een fibroblastgroeiremmer bevat om dergelijke besmetting in de cultuur te elimineren. Omdat het muizengehemelte en andere mondslijmvliezen relatief kleine afmetingen hebben, kan de initiële celopbrengst van één muis laag zijn. Daarom is de hele kweekperiode van dit protocol - tot het cryopreservatiestadium - langer dan die voor primaire huidkeratinocyten. Geïsoleerde orale keratinocyten kunnen het beste binnen 10 passages worden gebruikt, omdat langere kweekperioden de celeigenschappen kunnen veranderen en het aantal stamcellen kunnen verlagen.
De huidige methode toonde aan dat orale keratinocyten van muizen een dicht opeengepakte, geplaveide morfologie vertoonden en monolaagkolonies vormden onder proliferatieve omstandigheden. Ze vertoonden ook een hoge expressie van de basale markers α6-integrine, K14 en stamcelmarker p63. In toekomstige studies zullen, naast immunofluorescentiekleuring, RNA-sequencing, RT-PCR en western blot-analyses worden gebruikt om de cellulaire heterogeniteit en zuiverheid van orale keratinocyten te verifiëren, wat ons begrip van de aard van deze cellen verder zal verbeteren.
Na 2-3 passages waren orale keratinocyten stabiel genoeg om te worden gebruikt in verdere functionele experimenten. Belangrijk is dat dit kweekprotocol kan worden gecombineerd met transgene muislijnen, waaronder gen knock-out, Cre-loxP en tet-induceerbare systemen, en kan ook worden gebruikt in cellulaire en moleculaire assays. Het huidige protocol biedt onderzoekers dus een fundamentele en efficiënte methode die kan worden gebruikt om de orale keratinocytenstamcelbiologie verder te begrijpen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (aan A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (aan A.S.), AMED onder Grant Number JP21gm6110016 en 21bm0704067 (aan A.S.), en onderzoeksbeurzen van de Takeda Science Foundation (aan A.S.). We bedanken het Center for Animal Resources and Development aan de Kumamoto University en het Animal Resource Center aan de University of Tsukuba voor hun uitstekende muisverzorging. We bedanken de IRCMS-kernfaciliteit aan de Kumamoto University voor zijn ondersteuning bij confocale beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
