Summary
Den nuværende protokol beskriver isolation og kultur af orale keratinocytter afledt af den voksne museske. En evalueringsmetode ved hjælp af immunstainning er også rapporteret.
Abstract
I årevis, de fleste undersøgelser, der involverer keratinocytter er blevet gennemført ved hjælp af menneske og mus hud epidermal keratinocytter. For nylig har orale keratinocytter tiltrukket sig opmærksomhed på grund af deres unikke funktion og egenskaber. De opretholder homøostase af den mundtlige epitel og tjene som ressourcer til ansøgninger i regenerative behandlinger. In vitro-undersøgelser , der bruger orale primære keratinocytter fra voksne mus, har imidlertid været begrænset på grund af manglen på en effektiv og veletableret kulturprotokol. Her blev orale primære keratinocytter isoleret fra ganenvæv fra voksne mus og dyrket i et kommercielt lavt calciummedium suppleret med et chelexed-serum. Under disse forhold blev keratinocytter opretholdt i en proliferativ eller stamcellelignende tilstand, og deres differentiering blev hæmmet selv efter øgede passager. Markørudtryksanalyse viste, at de dyrkede orale keratinocytter udtrykte de basale cellemarkører p63, K14 og α6-integrin og var negative for differentieringsmarkøren K13 og fibroblastmarkøren PDGFRα. Denne metode producerede levedygtige og kultbare celler, der var egnede til downstream-applikationer i studiet af orale epitelcellefunktioner in vitro.
Introduction
Den mundtlige epitel tjener som en første barriere i at beskytte kroppen mod miljømæssige belastninger, herunder kemiske eller fysiske skader og bakterielle og virale infektioner1,2. Den orale slimhinde består af et ydre lag af stratificeret pladeformet epitel, der består af keratinocytter og underliggende bindevæv kaldet lamina propria, som hovedsageligt består af fibroblaster og den ekstracellulære matrix. Musens mundslimhinden kan opdeles bredt i tre undertyper: mastiks (hård gane og gingiva), specialiseret (dorsal tunge) og foring (buccal slimhinde, ventral tunge, blød gane, læber) slimhinde2,3 (Figur 1A). Den mundtlige epitel er keratinized i mastiksatoriske og specialiserede slimhinde og ikke-keratinized i foring slimhinden. På trods af sin anatomiske placering ligner det orale epitel hudens epidermis, idet det består af tætpakkede epitelceller med varierende grader af differentiering: basale lag, der indeholder udifferentierede celler; spinøse, granulære og cornified lag, der danner keratiniseret epitel, eller mellemliggende og overfladiske lag, der danner ikke-keratiniseret epitel4. Transgene musemodeller har lettet studiet af orale epitelstamcellers cellulære og molekylære egenskaber i ganen, buccal slimhinden, tungen og gingiva5,6,7,8,9,10,11. Men de fleste af disse undersøgelser primært anvendes in vivo mus eksperimenter. Cellekultursystemer blev typisk ikke anvendt på grund af manglende etablerede og effektive protokoller.
En in vitro kultur system kan bruges til molekylær og biokemisk analyse af stamcelleregulatorer, celle-baserede assays, og lægemiddelscreening. I øjeblikket er protokoller for kulturen af primære keratinocytter af huden epidermis blevet udviklet, hvor basale keratinocytter med succes kan isoleres og dyrkes til kliniske og forskningsformål12,13,14,15. I 1980 viste Hennings et al., at en lav calciumkoncentration (< 0,09 mM Ca2+) i kulturmediet lettede spredningen og vedligeholdte celler i en udifferentieret tilstand. Et højere niveau af calcium fremmes celledifferentiering og reduceret spredning16. Efterfølgende er der etableret kulturmetoder for neonatale og voksne murine epidermale keratinocytter og anvendes bredt på mange musemodeller med forskellig genetisk baggrund for in vitro-undersøgelser17,18,19. Selvom hud og oral epithelia har fælles karakteristika, viser de også iboende forskelle, f.eks. i deres keratiniseringsstatus, omsætningshastighed, genekspression og sårhelingsevne3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Selv om menneskelige mundtlige keratinocyte kultur er blevet udført med succes27,28,29, publikationer om mus oral keratinocyt kultur30,31,32 er begrænset på grund af den lille størrelse af målet væv og de særlige egenskaber af cellerne i forhold til huden epidermal keratinocytter. Denne protokol beskriver isolation og langsigtede kultur teknikker af musen primære mundtlige keratinocytter.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne fra Den Institutionelle Dyreforsøgskomité på Kumamoto Universitet og Universitetet i Tsukuba.
1. Forberedelse af reagenser og kulturmedier
- Der fremstilles 40 ml keratinocytkulturmedium, der indeholder 60 μM calcium og 600 μL antibiotisk antimykotisk opløsning. Der fremstilles 20 mL 0,025 % trypsin og 400 μL antimykotisk opløsning.
- Optø trypsinhæmningsopløsningen ved stuetemperatur, og hold den ved 4 °C, indtil den anvendes i trin 4.1.
BEMÆRK: Isolationsreagensen er forberedt til vævsisolation af fem mus.
- Optø trypsinhæmningsopløsningen ved stuetemperatur, og hold den ved 4 °C, indtil den anvendes i trin 4.1.
- For at forberede kulturmedierne skal du tage 500 mL medium og tilføje 5 mL af en væksttilskudsløsning (se Materialetabel) (i det følgende benævnt komplet medium) og 20% calciumudtømt chelexed-føtalt kvægserum (FBS)33 (i det følgende benævnt chelexed-FBS).
2. Dissektion af ganevæv fra voksen mus
- Ofre en voksen C57BL/6J mus (enten mand eller kvinde) ved cervikal dislokation i overensstemmelse med anlæggets regler om dyrevelfærd.
- Fjern håret omkring munden med en barbermaskine. Brug en saks, skåret fra kinden mod kæben, på begge sider.
BEMÆRK: Musen skal bedøves før offer. Der anvendes en bedøvelsesblanding af medetomidin, midazolam og butorphanol (se Materialetabel).
- Fjern håret omkring munden med en barbermaskine. Brug en saks, skåret fra kinden mod kæben, på begge sider.
- Brug vetskerne til at åbne munden bredt og absorbere blod ved hjælp af en vatpind. For at desinficere ganen skal du tørre indersiden af munden med en vatpind indeholdende 10% povidone-jod.
- For at høste muse ganen skal du først bruge et kirurgisk skalpelblad til at lave et marginalt snit i fuld tykkelse langs ganen på maxillarytænderne. Derefter dissekerer du forsigtigt hele ganen ved hjælp af et raspatorium.
BEMÆRK: Et raspatorium er et værktøj, der bruges til at hæve en mucoperiosteal flap (se Materialetabel) (figur 1B). - Overfør hurtigt ganevævet til et 15 mL rør, der indeholder 4 mL komplet medium + antibiotisk-antimykotisk opløsning. Hold vævene på is, indtil de er klar til inkubation.
BEMÆRK: Ved opsamling fra flere mus kan ganevæv opbevares på is i op til 4 timer.
3. Forbehandling af ganevæv
- I en laminar flow hætte, overføre væv til en 60 mm skål, der indeholder 4 mL af komplet medium + antibiotisk-antimykotisk opløsning.
- Brug korte, stumpe sammentr vil og en skalpelblad, forsigtigt fjerne noget blod fra vævene. Vask væv 10 gange i komplet medium.
- Overfør væv til en 35 mm skål, der indeholder 4 mL 0,025% trypsin + antibiotisk-antimykotisk opløsning, med epiteloverfladen nedad.
BEMÆRK: Epiteloverfladen, som kurver indad, skal gennemblødes i trypsinopløsningen; lamina propria skal vende op. Vævet skal flades så meget som muligt for at blive inkuberet helt i trypsinopløsningen. - Inkubere væv i 0,025% trypsin for ~ 16 timer ved stuetemperatur i kultur hætte.
4. Indsamling og kultur af primære celler
- Brug et par stumpe sammenkr vil du fjerne væv fra trypsinopløsningen (i 35 mm skålen) og overføre til trypsinhæmmeropløsning i en 60 mm skål (4 mL pr. skål) med epiteloverfladen vendt op.
- Brug sammenkrammer til at holde fast i kanten af ganen, skraber forsigtigt epitellaget af den underliggende lamina propria ved hjælp af et skalpelblad.
BEMÆRK: Bindevæv fordøjes ikke ved trypsin, så det ikke skrælles af under skrabning. - For at opsamle den maksimale mængde epitelceller fra væv skal vævet overføres til en anden 60 mm skål med 4 mL komplet medium og gentage skrabningstrinnet.
BEMÆRK: Sørg for at undgå at skrabe vævet med klingens spids. brug knivkanten i stedet. Skrabning udføres i 5-10 min pr. væv. - Placer en steril 100 μm celle si på toppen af en 50 mL koniske rør.
- Ved hjælp af en steril pipette overføres 2 mL trypsinopløsning (fra trin 4.1) til sien for at våd dens overflade.
- Ved hjælp af en pipette blandes celleaffjedringen i 60 mm skålen (fra trin 4.2-4.3) et par gange, og filtrer celler gennem den 100 μm cellesnive, der er udarbejdet i trin 4.4-4.5.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer. Der fremstilles 15 μL trypanblå opløsning, og der tilsættes 15 μL celleaffjedring (trin 4.6). Overfør 10 μL af den celle-trypan blå blanding til et hæmocytometer og tælle antallet af celler.
BEMÆRK: Et stykke muse gane kan give op til 1 million celler. - Under optællingen centrifugeres røret (fra trin 4.6) ved 100 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatanten med en pipette. Tilsæt 2 mL komplet medium + chelexed-FBS til røret. Resuspend celle pellet ved triturating flere gange ved hjælp af en 5 mL pipette.
- Plade 2-5 x 105 celler fra en mus til en brønd af en 24-brønd plade forbelagt med kollagen type I (se Tabel over materialer).
- Inkuberes cellerne ved 37 °C i 2 dage uden at ændre mediet.
- To dage efter såning, erstatte halvdelen af kulturmediet med det komplette medium + chelexed-FBS. Kontroller cellemorfologien under mikroskopet. Foderceller med komplet medium + chelexed-FBS hver anden dag.
BEMÆRK: Efter såning vil celler i forskellige størrelser blive observeret. Ca. 3-5 dage efter såning kan keratinocytter med en brosten morfologi (Figur 2) observeres. Det vil tage 1-2 ugers kultur, før den første passage kan udføres, og en efterfølgende 1-2 uger er nødvendig, før cellerne er klar til anden og tredje passager. Derefter vil cellerne vokse hurtigere og kan være forberedt på kryopræservering. Celler kan re-belagt til en brønd (af en 24-brønd plade) og en 6-brønd plade i henholdsvis første og anden passage. Den efterfølgende passage vil være afhængig af cellevæksten og densiteten. Et celleopdelingsforhold på 1:2 eller 1:3 kan bruges efter den tredje passage.
5. Keratinocyte passage
- Saml 2 mL af supernatanten fra kulturskålen og dispenseres i et 15 mL konisk rør (på is). Vask cellerne med steril 1x PBS to gange.
BEMÆRK: Når cellerne når ca. 70%-80% sammenløb, er de klar til passage. - Tilsæt 1 mL af 0,05% trypsin-EDTA til fadet til den ene brønd af en 6-brønds plade.
- Inkubation i 5-15 min ved 37 °C; kontrollere efter 5 minutter for at se, om cellerne løsner sig fra fadet.
- Neutralisere reaktionen ved hjælp af 1 mL trypsin hæmning opløsning og 2 mL af komplet kultur medium + chelexed-FBS ved blid pipettering. Overfør derefter celleaffjedringen til det samme 15 mL koniske rør som i trin 5.1.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirere supernatanten med en pipette og genbruge cellepillen i 1 mL komplet kulturmedium.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Dernæst plade 1 mL af celle suspension i en ny 24- eller 6-brønd kultur plade.
BEMÆRK: Nogle af cellerne fra de tidlige passager kan fryses i en blanding af 70% komplet kulturmedium + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 cryovials af celler kan indsamles fra en sammenløbet kulturplade.
6. Kryopræservering og genopretning af keratinocytter
- Cellefrysning
- Dyrk keratinocytter til 80%-90% sammenløb.
BEMÆRK: Lad ikke cellerne vokse til, da dette kan reducere deres spredningsstatus og levedygtighed. - Behandl keratinocytterne i fadet med 0,05% trypsin-EDTA, som beskrevet i trin 5.1-5.5.
- Tæl keratinocytterne ved hjælp af et hæmocytometer. Forbered kryovialer baseret på beregnede celletal for at give mulighed for overførsel af 1 x 106 celler / mL til hvert hætteglas.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 100 x g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i en 10 mL opløsning på 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% komplet kulturmedium (9 mL komplet medium + chelexed-FBS og 1 mL DMSO).
- Hæld cellerne i kryovialer ved 1 minut suspension pr. hætteglas. Sæt hætteglassene i en kryogen opbevaringsbeholder natten over ved -80 °C. Overfør hætteglassene til en flydende nitrogentank den følgende dag.
- Dyrk keratinocytter til 80%-90% sammenløb.
- Cellegenoprettelse
- Fjern en cryovial fra den flydende nitrogentank og optø delvist ved stuetemperatur. I et 15 mL rør blandes 1 mL af celleaffjedringen med 3 mL komplet kulturmedium + chelexed-FBS.
- Centrifugering blandingen i 5 min ved 100 x g og 4 °C. Kassér supernatanten og genbrug pelleten i 1 mL komplet kulturmedium + chelexed-FBS.
- Plade celle suspensioner i nye 60 mm Kollagen I-belagt kultur retter. Udskift kulturmediet hver 2-3 dage og passage cellerne, når de er sammenløbet.
7. Immunofluorescent farvning
- Kultur orale keratinocytter på firkantede coverslips (22 mm x 22 mm) i 6-brønds plader (5 x 105 celler / brønd) i 2 dage.
- Fix keratinocytter i en opløsning på 4% paraformaldehyd (PFA) og PBS i 20 min ved stuetemperatur før vask tre gange med 1x PBS.
- Permeabilize celler i en opløsning på 0,1% Triton i PBS. Inkuber celler i blokerende reagens (2,5 % gedeserum, 2,5 % æselserum) i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation natten over med primære antistoffer (se Materialetabellen) ved 4 °C.
BEMÆRK: Primære antistoffer blev anvendt ved følgende fortyndinger: kanin anti-K14 (1:1000), rotte α6-integrin (1:100), kanin anti-p63 (1:500), kanin anti-K13 (1:100) og ged anti-PDGFRα (1:100). - Vask prøver i en opløsning på 0,1% Triton i PBS, efterfulgt af inkubation med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: De sekundære antistoffer (Alexa 488 eller 555) blev brugt ved en fortynding i 1:300. - Counterstain alle prøver med Hoechst opløsning i 10 min og montere celler på glas dias.
BEMÆRK: Hoechst opløsning bruges til at plette kerner af celler. - Udfør prøvebilleddannelse ved hjælp af et konfokalt mikroskop.
BEMÆRK: Lysstyrken og kontrasten justeres til samme intensitet ved hjælp af billedredigeringssoftware.
Representative Results
Oversigt over dissektionsprocessen og isolering af orale keratinocytter fra den voksne muse gane
Dissocierede orale keratinocytter blev indsamlet fra den voksne muse gane og kultiveret i en tilpasset 20% chelexed-FBS. Muse ganen består af den hårde gane og den bløde gane (Figur 1C). Proceduren for isolering af mus oral keratinocytter er opsummeret i figur 1D. Ganenvævet dissekeres og overføres til et medie, der indeholder en antibiotisk-antimykotisk opløsning, før det inkuberes i 0,025% trypsinopløsning ved 4 °C natten over. Den følgende dag behandles ganevævet med trypsinhæmmeropløsning og komplet kulturmedium i lige store mængder. Efterfølgende skrabes vævene ved hjælp af et kirurgisk skalpelblad til at indsamle orale keratinocytter. Celleaffjedringen filtreres gennem en 100 μm cellestive og centrifugeres. Cellerne er derefter seedet i Kollagen I-belagt 24-brønd plader, der indeholder 2 mL af komplet kultur medium + chelexed-FBS.
Repræsentative resultater af en vellykket isolering af mus oral keratinocytter
Primære orale keratinocytter voksede som monolag og viste en brostensbelagt morfologi (figur 2). Små keratinocytkolonier var synlige på 3-5 dage (figur 2A, B); disse voksede sig større og dannede stramme kolonier ved 1 uges inkubation (figur 2C). Keratinocyte kolonier viste de typiske morfologiske træk ved basale keratinocytter, hvilket indikerer deres sunde forhold. Menneskelige orale keratinocytter forblev udifferentierede i flere passager i det komplette kulturmedium, der indeholder 0,06 mM Ca2 +16,28. Den første passage blev udført ca. 2 uger fra den oprindelige belægning (figur 2D). Ved senere passager udviste keratinocytter stabil vækst med en kortere kulturperiode (Figur 2E-G). Keratinocytter holdt op med at vokse, hvis der opstod betydelig fibroblastersforurening under isolationsprocessen (Figur 2H).
Isolerede mus mundtlige keratinocytter udtrykke basal celle markører
For at bekræfte status for primære orale keratinocytter blev immunstaining udført ved hjælp af de basale cellemarkører Keratin 14 (K14) og α6-integrin34. K14 og α6-integrin blev udtrykt i keratinocytter efter dyrkning (figur 3A, B). Cellerne var også plettet med stamcellemarkør p63 for at bekræfte deres stilk. Tidlige passage (passage 4) og sen passage (passage 7) celler viste ensartet udtryk for p63 (Figur 3C,D). I modsætning hertil udviste keratinocytter behandlet med højt calcium (1,2 mM induktion i 2 dage) nedsat p63 udtryk (figur 3E), hvilket indikerer, at høj calciumbehandling undertrykker stamcellerelaterede gener i primære keratinocytter som tidligere rapporteret16. Differentieringsmarkøren Keratin 13 (K13) viste sjældent eller intet udtryk i både tidlige og sene passager og signifikant udtryk under høj calciumbehandling (figur 3F-H). For at teste muligheden for fibroblastforurening i keratinocytkulturen blev farvning ved hjælp af fibroblastmarkøren PDGFRα udført med det samme sæt keratinocytter sammenlignet med museememnal fibroblast (MEFs). Der var ingen udtryk for PDGFRα i keratinocytkulturen sammenlignet med det høje udtryk, der blev observeret i MEF-celler (figur 3I-3L). Disse resultater viste, at denne protokol med succes kunne isolere basale keratinocytter og opretholde disse celler i udifferentieret tilstand.
Figur 1: Oversigt over dissektionsproceduren og isolering af mus oral keratinocytter. (A) Skematisk repræsentation af musens mundhule. (B) Instrumenter, der anvendes til at dissekere ganen og isolere mus oral keratinocytter. (C) Brightfield billede af musen gane. Skalalinje: 100 μm. (D) Oversigt over protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative resultater af en vellykket isolering af mus oral keratinocytter. (A-G) Time-kursus billeder af dyrkede primære mundtlige keratinocytter på 3 dage (A), 5 dage (B), 1 uge (C), og 2 uger (D) af kultur efter isolation. Morfologier af mus mundtlige keratinocytter efter den første (E), anden (F), og tredje (G) passager er vist. (H) Eksempel på fibroblast forurening i musen oral keratinocyt kultur. Skalalinje: 400 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Isolerede mus mundtlige keratinocytter udtrykke basal celle markører. (A-B) Repræsentative billeder af immunofluorescent farvning af K14 (A; rød) og α6-integrin (B; grøn) i passage 4. (C-E) Repræsentative billeder af immunfluorescent farvning af p63 (grøn) i passage 4 (C), passage 7 (D) og høj calciumbehandling (E). (Ny) Immunstainende billeder af K13 (grøn) i passage 4 (F), passage 7 (G) og høj calciumbehandling (H). (I-L) Immunstainende billeder af PDGFRα (rød) i passage 4 (I), passage 7 (J), høj calciumbehandling (K) og MEF'er (L). Kerner er plettet med Hoechst (blå). Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Primære keratinocytter isoleret fra menneske- eller musehud epidermis er blevet udnyttet i mange år i forskning og kliniske applikationer12,13,15,18,27,28,29. I modsætning hertil er der kun blevet etableret få protokoller for at isolere og dyrke primære orale keratinocytter fra voksne mus30,31,32. Den foreliggende undersøgelse brugte en kommerciel komplet kultur medium og chelexed-FBS til at opretholde keratinocytter i en proliferativ eller stamcelle-lignende tilstand. Dette kultursystem kan anvendes i molekylære og biokemiske analyser for yderligere at forstå funktionerne i orale epitelstamceller og deres relaterede sygdomme.
Der er flere vigtige trin i denne protokol. For det første er trypsinkoncentrationen og inkubationstiden afgørende for at producere levedygtige celler til efterfølgende kulturer. Vi brugte konsekvent 0,025% trypsinopløsninger og 16 timers inkubationsperioder i kammerhætten ved stuetemperatur. Hvis keratinocytterne ikke inkuberes i tilstrækkelig lang tid, vil de ikke tage korrekt afstand fra vævet, hvilket resulterer i et lavere slutcelleudbytte. For det andet påvirker skånsom pipettering af celleaffjedringen på den anden dag især celleens levedygtighed. Skrabning bør forsigtigt starte fra epitelsiden og ikke overstige 10 min pr. vævsprøve. Endelig indeholder den første isolerede celleaffjedring fibroblaster og andre celletyper; disse uønskede celler vil normalt begynde at forsvinde i efterfølgende kulturer.
Potentielle begrænsninger blev identificeret under celleisolation og kultur. I sjældne tilfælde kan fibroblaster være forurenet under isolationsprocessen, og fibroblasterne kan hæmme væksten af keratinocytter i efterfølgende passager (Figur 2H). Det er nødvendigt at vælge et kommercielt medium, der indeholder en fibroblast væksthæmmer for at eliminere en sådan forurening i kulturen. Fordi muse ganen og andre mundslimhinden har relativt små størrelser, kan den oprindelige celleudbytte fra en mus være lav. Derfor er hele kulturperioden i denne protokol- indtil kryopræserveringsstadiet - længere end for primære hud keratinocytter. Isolerede orale keratinocytter bruges bedst inden for 10 passager, da mere udvidede kulturperioder kan ændre celleegenskaberne og sænke antallet af stamceller.
Den nuværende metode viste, at mus mundtlige keratinocytter udstillet en tæt pakket, brosten morfologi og dannede monolayer kolonier under proliferative forhold. De viste også højt udtryk for de basale markører α6-integrin, K14, og stamcellemarkør p63. I fremtidige undersøgelser, ud over immunofluorescence farvning, RNA-sekventering, RT-PCR, og vestlige blot analyser vil blive brugt til at kontrollere cellulære heterogenitet og renhed af orale keratinocytter, som yderligere vil øge vores forståelse af arten af disse celler.
Efter 2-3 passager var orale keratinocytter stabile nok til at blive brugt i yderligere funktionelle eksperimenter. Vigtigere, denne kultur protokol kan kombineres med transgene muselinjer, herunder gen knockout, Cre-loxP, og tet-inucible systemer, og kan også bruges i cellulære og molekylære assays. Således giver den nuværende protokol forskere en grundlæggende og effektiv metode, der kan bruges til at forstå oral keratinocyt stamcellebiologi yderligere.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (til A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (til A.S.), AMED under Grant Number JP21gm6110016 og 21bm0704067 (til A.S.) og forskningsstipendier fra Takeda Science Foundation (til A.S.). Vi takker Center for Animalske ressourcer og udvikling på Kumamoto University og Animal Resource Center på University of Tsukuba for deres fremragende mus pleje. Vi takker IRCMS kernefacilitet på Kumamoto University for sin støtte i confocal imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
