Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבות של קרטינוציטים אוראליים הנגזרים מחך העכבר הבוגר. כמו כן, דווח על שיטת הערכה באמצעות חיסונים.
Abstract
במשך שנים, רוב המחקרים מעורבים קרטינוציטים נערכו באמצעות קרטינוציטים אפידרמיס עור אדם ועכבר. לאחרונה, קרטינוציטים אוראליים משכו תשומת לב בגלל תפקידם הייחודי ומאפייניו. הם שומרים על הומאוסטזיס של אפיתל הפה ומשמשים משאבים עבור יישומים טיפולים רגנרטיביים. עם זאת, במחקרים במבחנה המשתמשים קרטינוציטים ראשוניים אוראליים מעכברים בוגרים הוגבלו בשל היעדר פרוטוקול תרבות יעיל ומבוסס היטב. כאן, קרטינוציטים ראשוניים אוראליים היו מבודדים מרקמות החיך של עכברים בוגרים ותרבית במדיום מסחרי דל סידן בתוספת סרום כלקס. בתנאים אלה, קרטינוציטים נשמרו במצב שגשוג או דמוי תאי גזע, וההבחנה שלהם התעכבה גם לאחר מעברים מוגברים. ניתוח ביטוי סמן הראה כי קרטינוציטים אוראליים מתורבתים ביטאו את סמני התאים הבזליים p63, K14 ו- α6-integrin והיו שליליים עבור סמן הבידול K13 ואת הסמן פיברובלסט PDGFRα. שיטה זו ייצרה תאים בני קיימא וניתנים לתחנות המתאימים ליישומים במורד הזרם בחקר תפקודי תאי גזע אפיתל אוראליים במבחנה.
Introduction
האפיתל האוראלי משמש כמחסום ראשון בהגנה על הגוף מפני לחצים סביבתיים, כולל נזק כימי או פיזי וזיהומים חיידקיים ויראליים1,2. רירית הפה כוללת שכבה חיצונית של אפיתל קשקשים שכבתי המורכב מקריטינוציטים ורקמת חיבור הבסיסית הנקראת לאמינה פרופריה, המורכבת בעיקר מפיברובלסטים ומטריצת חוץ תאית. רירית הפה של העכבר יכולה להיות מחולקת באופן רחב לשלושה תת-סוגים: מסטיקורי (חיך קשה וגינגיבה), מתמחה (לשון הגב) ובטנה (רירית הבוקל, לשון גחון, חיך רך, שפתיים) רירית2,3 (איור 1A). האפיתל האוראלי הוא קרטין במסטיקטוריה ורירית מיוחדת ולא קרטין ברירית הרירית. למרות מיקומו האנטומי, האפיתל האוראלי דומה לאפידרמיס העור בכך שהוא מורכב מתאי אפיתל ארוזים היטב בדרגות שונות של בידול: שכבות בזאליות המכילות תאים לא מובחנים; שכבות קוצניות, גרגיריות וקרניות היוצרות אפיתל קרטין, או שכבות ביניים ושטחיות היוצרות אפיתל לא קרטין4. מודלים של עכבר מהונדס הקלו על המחקר של תכונות תאי גזע אפיתל אוראליים של חיך, רירית buccal, הלשון, ו gingiva5,6,7,8,9,10,11. עם זאת, רוב המחקרים האלה משמשים בעיקר בניסויים עכבר vivo. מערכות תרבית תאים לא הועסקו בדרך כלל בשל היעדר פרוטוקולים מבוססים ויעילים.
מערכת תרבית במבחנה יכולה לשמש לניתוח מולקולרי וביוכימי של רגולטורים של תאי גזע, בדיקות מבוססות תאים והקרנת סמים. נכון לעכשיו, פרוטוקולים לתרבות של קרטינוציטים ראשוניים של אפידרמיס העור פותחו, שבו קרטינוציטים בזאלי יכול להיות מבודד בהצלחה ותרבית למטרות קליניות ומחקריות12,13,14,15. בשנת 1980, הנינגס ואח ' הראו כי ריכוז סידן נמוך (< 0.09 mM Ca2+) במדיום התרבות הקל על התפשטות ותאים מתוחזקים במצב לא מובחן. רמה גבוהה יותר של בידול תאים מקודם סידן והתפשטות מופחתת16. לאחר מכן, מתודולוגיות תרבות עבור ילודים ומבוגרים מורין אפידרמיס קרטינוציטים הוקמו ויושמה באופן נרחב על מודלים עכבר רבים עם רקע גנטי שונה עבור מחקרי במבחנה17,18,19. למרות אפיתליה העור אוראלי חולקים מאפיינים משותפים, הם גם מראים הבדלים מהותיים, למשל, במצב הקראטיניזציה שלהם, שיעור המחזור, ביטוי גנים, ויכולת ריפוי פצעים3,11,20,21,22,23,24,25,26.
למרות שתרבות הקרטינוציטים האוראלית האנושית בוצעה בהצלחה27,28,29, פרסומים על תרבית קרטינוציט אוראלי עכבר30,31,32 מוגבלים בשל הגודל הקטן של רקמת היעד והמאפיינים הייחודיים של התאים בהשוואה לקרטינוציטים אפידרמיס העור. פרוטוקול זה מתאר את טכניקות הבידוד והתרבות לטווח ארוך של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים של עכבר.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות הוועדה לניסוי בעלי חיים מוסדית באוניברסיטת קומאמוטו ובאוניברסיטת צוקובה.
1. הכנת ריאגנטים ומדיה תרבותית
- הכן 40 מ"ל של מדיום תרבות קרטינוציטים המכיל 60 מיקרומטר של סידן ו 600 μL של פתרון אנטיביוטי-אנטי-ממיקוטי. הכן 20 מ"ל של 0.025% טריפסין ו 400 μL של פתרון אנטיביוטי-אנטי-ממיקוטי.
- להפשיר את פתרון עיכוב טריפסין בטמפרטורת החדר ולשמור אותו ב 4 °C (5 °F) עד לשימוש בשלב 4.1.
הערה: ריאגנט הבידוד מוכן לבידוד רקמות של חמישה עכברים.
- להפשיר את פתרון עיכוב טריפסין בטמפרטורת החדר ולשמור אותו ב 4 °C (5 °F) עד לשימוש בשלב 4.1.
- כדי להכין את המדיה התרבותית, לקחת 500 מ"ל של בינוני ולהוסיף 5 מ"ל של פתרון תוספת צמיחה (ראה טבלה של חומרים) (להלן המכונה בינוני מלא) ו 20% סרום בקר chelexed-עובר מרוקן סידן (FBS)33 (להלן המכונה chelexed-FBS).
2. ניתוח רקמת חיך מעכבר מבוגר
- להקריב עכבר C57BL/6J מבוגר (זכר או נקבה) על ידי פריקת צוואר הרחם בהתאם לתקנות המתקן הנוגעות לרווחת בעלי החיים.
- הסר את השיער סביב הפה עם מכונת גילוח. באמצעות מספריים, לחתוך מן הלחי לכיוון הלסת, משני הצדדים.
הערה: העכבר צריך להיות מרדים לפני הקרבה. תערובת הרדמה של מדטומינדין, מידזולם, ו butorphanol משמש (ראה טבלה של חומרים).
- הסר את השיער סביב הפה עם מכונת גילוח. באמצעות מספריים, לחתוך מן הלחי לכיוון הלסת, משני הצדדים.
- השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הפה לרווחה ולספוג כל דם באמצעות צמר גפן. כדי לחטא את החיך, לנגב את החלק הפנימי של הפה עם צמר גפן המכיל 10% povidone-יוד.
- כדי לקצור את חיך העכבר, ראשית, להשתמש בלהב אזמל כירורגי כדי לבצע חתך שולי בעובי מלא לאורך צד החיך של השיניים מקסילרי. לאחר מכן, לנתח בזהירות את החיך כולו באמצעות raspatorium.
הערה: פטל הוא כלי המשמש להעלאת דש רירית (ראו טבלת חומרים) (איור 1B). - העבר במהירות את רקמת החיך לצינור 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של פתרון בינוני + אנטי-אנטי-מיקרוטי מלא. שמור את הרקמות על קרח עד מוכן דגירה.
הערה: לאיסוף מעכברים מרובים, רקמות חיך עשוי להישמר על קרח עד 4 שעות.
3. טיפול מקדים ברקמת החיך
- במכסה המנוע לזרימה למינאר, להעביר רקמות לצלחת 60 מ"מ המכיל 4 מ"ל של מדיום מלא + פתרון אנטי-אנטי-מיקרוטי.
- באמצעות מלקחיים קצרים וקהים ולהב אזמל, להסיר בעדינות כל דם מן הרקמות. לשטוף רקמות 10 פעמים במדיום מלא.
- העבר רקמות לצלחת 35 מ"מ המכילה 4 מ"ל של 0.025% טריפסין + פתרון אנטיביוטי-אנטי-ממיקוטי, כאשר משטח האפיתל פונה כלפי מטה.
הערה: משטח האפיתל, המתעקל פנימה, צריך להיות ספוג בתמיסת טריפסין; הלמינה פרופריה צריכה להתמודד עם הפנים כלפי מעלה. הרקמה צריכה להיות שטוחה ככל האפשר כדי להיות דגירה לחלוטין בתמיסת טריפסין. - רקמות דגירה ב 0.025% טריפסין עבור ~ 16 שעות בטמפרטורת החדר בשכונת התרבות.
4. איסוף ותרבות של תאים ראשוניים
- באמצעות זוג אחד של מלקחיים קהים, להסיר רקמה מפתרון טריפסין (בצלחת 35 מ"מ) ולהעביר לתמיסת מעכב טריפסין בצלחת 60 מ"מ (4 מ"ל לצלחת) עם משטח האפיתל פונה כלפי מעלה.
- באמצעות מלקחיים כדי להחזיק בקצה החיך, לגרד בעדינות את שכבת האפיתל את propria למינה הבסיסית באמצעות להב אזמל.
הערה: רקמת חיבור אינה מתעכלת על ידי טריפסין, ולכן היא אינה מתקלף במהלך גירוד. - כדי לאסוף את הכמות המרבית של תאי אפיתל מרקמות, להעביר את הרקמה לתוך צלחת נוספת 60 מ"מ עם 4 מ"ל בינוני מלא ולחזור על שלב גירוד.
הערה: הקפד להימנע מגרד את הרקמה עם קצה הלהב; השתמש בקצה הלהב במקום. גירוד מבוצע במשך 5-10 דקות לכל רקמה. - מניחים מסננת תאי 100 מיקרומטר סטרילית על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל.
- באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר 2 מ"ל של פתרון טריפסין (בשלב 4.1) לתוך מסננת כדי להרטיב את פני השטח שלה.
- באמצעות פיפטה, מערבבים את מתלה התא בצלחת 60 מ"מ (משלבים 4.2-4.3) כמה פעמים ומסננים תאים דרך מסננת התאים 100 מיקרומטר שהוכנה בשלבים 4.4-4.5.
- ספירת מספר התאים באמצעות המוציטים. הכן 15 μL של פתרון כחול טריפן ולהוסיף 15 μL של השעיית תא (שלב 4.6). העבר 10 μL של תערובת כחולה cell-trypan להמוציטומטר ולספור את מספר התאים.
הערה: חתיכה אחת של חיך העכבר יכולה להניב עד מיליון תאים. - בעת הספירה, צנטריפוגה הצינור (מ שלב 4.6) ב 100 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאף את סופרנטנט עם פיפטה. הוסף 2 מ"ל של מדיום מלא + chelexed-FBS לצינור. resuspend גלולה התא על ידי טריטוריה מספר פעמים באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
- צלחת 2-5 x 105 תאים מעכבר אחד לבאר אחת של צלחת 24-well מצופה מראש עם קולגן סוג I (ראה טבלה של חומרים).
- לדגור על התאים ב 37 °C (55 °F) במשך 2 ימים מבלי לשנות את המדיום.
- יומיים לאחר הזריעה, להחליף חצי מדיום התרבות עם מדיום מלא + chelexed-FBS. בדוק את מורפולוגיית התא מתחת למיקרוסקופ. להאכיל תאים עם מדיום מלא + chelexed-FBS כל יומיים.
הערה: לאחר זריעה, תאים בגדלים שונים נצפו. כ-3-5 ימים לאחר הזריעה, ניתן להבחין בקרטינוציטים עם מורפולוגיה מרוצפת אבן (איור 2). זה ייקח 1-2 שבועות של תרבות לפני המעבר הראשון יכול להתבצע ו 1-2 שבועות הבאים יש צורך לפני התאים מוכנים למעבר השני והשלישי. לאחר מכן, התאים יגדלו מהר יותר ועשויים להיות מוכנים לשימור קריופ. תאים יכולים להיות מצופים מחדש לבאר אחת (של צלחת 24-well) וצלחת 6-באר במעבר הראשון והשני, בהתאמה. המעבר הבא יהיה תלוי בצמיחת התא ובצפיפות. ניתן להשתמש ביחס פיצול תא של 1:2 או 1:3 לאחר הקטע השלישי.
5. מעבר קרטינוציט
- לאסוף 2 מ"ל של supernatant מן צלחת התרבות ולחלק לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל (על קרח). לשטוף את התאים עם PBS סטרילי 1x פעמיים.
הערה: כאשר התאים מגיעים למפגש של כ-70%-80%, הם מוכנים למעבר. - הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למנה לבאר אחת של צלחת 6-well.
- דגירה במשך 5-15 דקות ב 37 °C (5 °F); בדוק לאחר 5 דקות כדי לראות אם התאים מתנתקים מהמנה.
- לנטרל את התגובה באמצעות 1 מ"ל של פתרון עיכוב טריפסין ו 2 מ"ל של מדיום תרבות מלאה + chelexed-FBS על ידי pipetting עדין. לאחר מכן, להעביר את השעיית התא לתוך אותו צינור חרוטי 15 מ"ל כמו בשלב 5.1.
- צנטריפוגה השעיית התא ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). שאפו את supernatant עם pipette ו resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיום תרבות מלאה.
- תספור את התאים באמצעות המוצ'ימומטר. לאחר מכן, צלחת 1 מ"ל של השעיית התא לתוך צלחת תרבות חדשה 24 או 6-well.
הערה: חלק מהתאים מהמעברים המוקדמים יכולים להיות קפואים בתערובת של 70% מדיום תרבות מלא + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 cryovials של תאים ניתן לאסוף מצלחת תרבות אחת.
6. שימור קריופרה והתאוששות של קרטינוציטים
- הקפאת תאים
- הגדל קרטינוציטים ל-80%-90% השפעה.
הערה: אל תאפשר לתאים לגדול יתר על המידה, שכן הדבר עשוי להפחית את מצב ההתפשטות שלהם ואת הכדאיות שלהם. - לטפל קרטינוציטים בצלחת עם 0.05% טריפסין-EDTA, כמתואר בשלבים 5.1-5.5.
- תספור את הקרטינוציטים באמצעות המוציטים. הכן cryovials המבוסס על מספרי תאים מחושבים כדי לאפשר העברה של 1 x 106 תאים / מ"ל לכל מקטורן.
- צנטריפוגה השעיית התא ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא בפתרון 10 מ"ל של 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% בינוני תרבות מלאה (9 מ"ל של מדיום מלא + chelexed-FBS ו 1 מ"ל של DMSO).
- מחלקים את התאים לתוך cryovials ב 1 מ"ל של השעיה לכל מקטורן. מניחים את הבקבוקונים במיכל אחסון קריוגני למשך הלילה ב -80 מעלות צלזיוס. מעבירים את הבקבוקונים למיכל חנקן נוזלי למחרת.
- הגדל קרטינוציטים ל-80%-90% השפעה.
- שחזור תאים
- מוציאים קריוביאלי ממיכל החנקן הנוזלי ומפשירים חלקית בטמפרטורת החדר. בצינור 15 מ"ל, לערבב 1 מ"ל של השעיית התא עם 3 מ"ל של מדיום תרבות מלאה + chelexed-FBS.
- צנטריפוגות התערובת במשך 5 דקות ב 100 x גרם ו 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 1 מ"ל של מדיום תרבות מלאה + chelexed-FBS.
- צלחת התלי התא לתוך מנות תרבות קולגן I חדש 60 מ"מ מצופה. החלף את המדיום התרבותי כל 2-3 ימים ועבר את התאים פעם אחת.
7. כתמים חיסוניים
- תרבית קרטינוציטים אוראליים על כיסויים מרובעים (22 מ"מ x 22 מ"מ) בלוחות 6-well (5 x 105 תאים / טוב) במשך יומיים.
- תקן קרטינוציטים בתמיסה של 4% paraformaldehyde (PFA) ו- PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני הכביסה שלוש פעמים עם PBS 1x.
- פרמזייליזציה תאים בפתרון של 0.1% טריטון ב- PBS. תאי דגירה בחסימת ריאגנט (2.5% סרום עזים, סרום חמור 2.5% ) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ואחריו דגירה לילית עם נוגדנים ראשוניים (ראה טבלה של חומרים) ב 4 °C (5 °F).
הערה: נוגדנים ראשוניים שימשו בדילול הבא: ארנב אנטי K14 (1:1000), חולדה α6-integrin (1:100), ארנב אנטי p63 (1:500), ארנב אנטי K13 (1:100), ו עיזים נגד PDGFRα (1:100). - לשטוף דגימות בתמיסה של 0.1% טריטון ב- PBS, ואחריו דגירה עם נוגדנים משניים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
הערה: הנוגדנים המשניים (Alexa 488 או 555) שימשו בדילול של 1:300. - תתקן את כל הדגימות עם תמיסת Hoechst במשך 10 דקות ולהרכיב תאים על מגלשות זכוכית.
הערה: פתרון Hoechst משמש להכתים את הגרעינים של תאים. - בצע הדמיה לדוגמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: הבהירות והחדות מותאמות לעוצמה שווה באמצעות תוכנת עריכת תמונות.
Representative Results
סקירה כללית של תהליך הניתוק והבידוד של קרטינוציטים אוראליים מחך העכבר הבוגר
קרטינוציטים אוראליים מנותקים נאספו מחך העכבר הבוגר ולתרבות בהתאמה אישית של 20% chelexed-FBS. חיך העכבר מורכב מהחך הקשה והחך הרך (איור 1C). ההליך לבידוד של קרטינוציטים אוראליים של העכבר מסוכם באיור 1D. רקמת החיך נותחה ומועברת למדיה המכילה פתרון אנטיביוטי-אנטי-מיקרוטי לפני שהיא דוגרת בתמיסת טריפסין של 0.025% ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, רקמת החיך מטופלת עם פתרון מעכב טריפסין ומדיום תרבות מלא בנפחים שווים. לאחר מכן, הרקמות מגרדות באמצעות להב אזמל כירורגי כדי לאסוף קרטינוציטים אוראליים. ההשעיה התא מסוננת באמצעות מסננת תאים 100 מיקרומטר וצנטריפוגה. לאחר מכן, התאים נזרעים בלוחות מצופים קולגן I המכילים 2 מ"ל של מדיום תרבית שלמה + chelexed-FBS.
תוצאות מייצגות של בידוד מוצלח של קרטינוציטים אוראלי עכבר
קרטינוציטים אוראליים ראשוניים גדלו כמונו-שכבתית והציגו מורפולוגיה מרוצפת אבן (איור 2). מושבות קרטינוציטים קטנות נראו ב-3-5 ימים (איור 2A, B); אלה גדלו ויצרו מושבות הדוקות בשבוע אחד של דגירה (איור 2C). מושבות קרטינוציטים הציגו את התכונות המורפולוגיות האופייניות של קרטינוציטים בסיסיים, המציין את מצבם הבריא. קרטינוציטים אוראליים אנושיים נותרו ללא נטישה במשך מספר קטעים במדיום התרבות השלם המכיל 0.06 mM Ca2 +16,28. הקטע הראשון בוצע כשבועיים מהחישוב הראשוני (איור 2D). בקטעים מאוחרים יותר, קרטינוציטים הציגו צמיחה יציבה עם תקופה קצרה יותר של תרבות (איור 2E-G). קרטינוציטים הפסיקו לגדול אם במהלך תהליך הבידוד אירע זיהום פיברובלסטים משמעותי (איור 2H).
קרטינוציטים אוראליים מבודדים של עכבר מבטאים סמני תאי בזאלי
כדי לאשר את המצב של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים, חיסונים בוצעו באמצעות סמני התאים הבזליים קרטין 14 (K14) ו α6-integrin34. K14 ו-α6-integrin באו לידי ביטוי בקראטינוציטים לאחר פולחן (איור 3א, ב). התאים היו מוכתמים גם עם סמן תא גזע p63 כדי לאשר את גזענותם. מעבר מוקדם (מעבר 4) ומעבר מאוחר (מעבר 7) תאים הראו ביטוי אחיד של p63 (איור 3C,D). לעומת זאת, קרטינוציטים שטופלו בסידן גבוה (אינדוקציה של 1.2 מ"מ במשך יומיים) הציגו ירידה בביטוי p63 (איור 3E), מה שמצביע על כך שטיפול גבוה בסידן מדכא גנים הקשורים לתאי גזע בקראטינוציטים ראשוניים כפי שדווח בעבר16. סמן הבידול קרטין 13 (K13) הראה ביטוי נדיר או ללא ביטוי בקטעים מוקדמים ומאוחרים וביטוי משמעותי תחת טיפול בסידן גבוה (איור 3F-H). כדי לבדוק את האפשרות של זיהום פיברובלסט בתרבות קרטינוציט, כתמים באמצעות הסמן פיברובלסט PDGFRα בוצע עם אותו סט של קרטינוציטים לעומת פיברובלסט עוברי עכבר (MEFs). לא היה ביטוי של PDGFRα בתרבות הקרטינוציטים, בהשוואה לביטוי הגבוה שנצפו בתאי MEF (איור 3I-3L). תוצאות אלה הצביעו על כך שפרוטוקול זה יכול לבודד בהצלחה קרטינוציטים בזאליים ולשמור על תאים אלה במצב לא מובדל.
איור 1: סקירה כללית של הליך הניתוח והבידוד של קרטינוציטים דרך הפה של העכבר. (א) ייצוג סכמטי של חלל הפה של העכבר. (B) מכשירים המשמשים לנתח את החיך ולבודד קרטינוציטים אוראליים של העכבר. (ג) תמונת ברייטפילד של חיך העכבר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (D) סיכום הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות מייצגות של בידוד מוצלח של קרטינוציטים אוראליים של עכבר. (א-ג) תמונות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מתורבתים ב-3 ימים (A), 5 ימים (B), שבוע אחד (C) ושבועיים (D) של תרבות לאחר הבידוד. מורפורולוגיות של קרטינוציטים אוראליים של העכבר לאחר המעבר הראשון (E), השני (F) והשלישי (G) מוצגות. (ח) דוגמה לזיהום פיברובלסט בתרבות הקרטינוציטים האוראלית של העכבר. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קרטינוציטים אוראליים מבודדים של עכבר מבטאים סמני תאי בזאלי. (א-ב) תמונות מייצגות של כתמים חיסוניים של K14 (A; אדום) ו α6-integrin (B; ירוק) במעבר 4. (C-E) תמונות מייצגות של כתמים חיסוניים של p63 (ירוק) במעבר 4 (C), מעבר 7 (D) וטיפול בסידן גבוה (E). (פ-ה) תמונות חיסוניות של K13 (ירוק) במעבר 4 (F), מעבר 7 (G) וטיפול בסידן גבוה (H). (י-ל) תמונות חיסוניות של PDGFRα (אדום) במעבר 4 (I), מעבר 7 (J), טיפול בסידן גבוה (K) ו- MEFs (L). גרעינים מוכתמים בהוכסט (כחול). סרגלי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
קרטינוציטים ראשוניים מבודדים אפידרמיס עור אדם או עכבר נוצלו במשך שנים רבות במחקר ויישומים קליניים12,13,15,18,27,28,29. לעומת זאת, פרוטוקולים מעטים הוקמו כדי לבודד ולתרבות קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מעכברים בוגרים30,31,32. המחקר הנוכחי השתמש במדיום תרבות מלאה מסחרית ו chelexed-FBS כדי לשמור על קרטינוציטים במצב שגשוג או תאי גזע. מערכת תרבית זו יכולה להיות מועסקת במבחנים מולקולריים וביוכימיים כדי להבין עוד יותר את התכונות של תאי גזע אפיתל אוראלי ומחלות הקשורות שלהם.
מספר שלבים קריטיים כלולים בפרוטוקול זה. ראשית, ריכוז טריפסין וזמן הדגירה חיוניים לייצור תאים קיימא לתרבויות הבאות. השתמשנו בעקביות בפתרונות טריפסין 0.025% ובתקופות דגירה של 16 שעות במכסה המנוע של החדר בטמפרטורת החדר. אם לא דגירה במשך פרק זמן מספיק, קרטינוציטים לא יתנתקו כראוי מהרקמה, וכתוצאה מכך תפוקת תאים סופית נמוכה יותר. שנית, צנרת עדינה של השעיית התא ביום השני משפיעה במיוחד על הכדאיות של התא. גירוד צריך להתחיל בעדינות מהצד האפיתל ולא יעלה על 10 דקות לכל דגימת רקמה. לבסוף, השעיית התא המבודד הראשון מכילה פיברובלסטים וסוגי תאים אחרים; תאים לא רצויים אלה בדרך כלל יתחילו להיעלם בתרביות הבאות.
מגבלות פוטנציאליות זוהו במהלך בידוד תאים ותרבות. במקרים נדירים, פיברובלסטים עלולים להיות מזוהמים במהלך תהליך הבידוד, והפיברבלסטים עשויים לעכב את צמיחת הקרטינוציטים בקטעים הבאים (איור 2H). יש צורך לבחור מדיום מסחרי המכיל מעכב צמיחה פיברובלסט כדי לחסל זיהום כזה בתרבות. מכיוון שלחך העכבר ולרירית הפה יש גדלים קטנים יחסית, תפוקת התא הראשונית מעכבר אחד עשויה להיות נמוכה. לכן, כל תקופת התרבות של פרוטוקול זה - עד שלב cryopreservation - ארוכה מזו עבור קרטינוציטים ראשוניים בעור. קרטינוציטים אוראליים מבודדים משמשים בצורה הטובה ביותר בתוך 10 מעברים, כמו תקופות תרבות מורחבת יותר יכול לשנות את תכונות התא ולהוריד את מספר תאי הגזע.
השיטה הנוכחית הראתה כי קרטינוציטים אוראליים של עכבר הציגו מורפולוגיה ארוזה היטב, מרוצפת אבן ויצרו מושבות מונו-שכבתיות בתנאים שגשוג. הם גם הראו ביטוי גבוה של סמני בזאלי α6-integrin, K14, וסמן תא גזע p63. במחקרים עתידיים, בנוסף כתמים אימונופלואורסצנטיים, רצף RNA, RT-PCR, וניתוחי כתם מערבי ישמשו כדי לאמת את ההטרוגניות התאית ואת הטוהר של קרטינוציטים אוראליים, אשר ישפר עוד יותר את ההבנה שלנו של הטבע של תאים אלה.
לאחר 2-3 מעברים, קרטינוציטים אוראליים היו יציבים מספיק כדי לשמש בניסויים פונקציונליים נוספים. חשוב לציין, פרוטוקול תרבות זה יכול להיות משולב עם קווי עכבר מהונדסים, כולל נוקאאוט גנים, Cre-loxP, ומערכות tet-inducible, והוא יכול לשמש גם בדיקות תאיות ומולקולריות. לפיכך, הפרוטוקול הנוכחי מספק לחוקרים שיטה בסיסית ויעילה שניתן להשתמש בה כדי להבין עוד יותר את הביולוגיה של תאי הגזע של קרטינוציט אוראלי.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הענקת סיוע למחקר מדעי (B) (20H03266) (ל- A.S.), מענק בסיוע למדענים בתחילת הקריירה (18K14709) (ל- A.S.), AMED תחת מענק מספר JP21gm61110016 ו- 21bm0704067 (ל- A.S. ) ומענקי מחקר מקרן טקדה למדע (ל- A.S.). אנו מודים למרכז למשאבי בעלי חיים ופיתוח באוניברסיטת קומאמוטו ולמרכז למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת צוקובה על הטיפול המעולה בעכברים. אנו מודים למתקן הליבה של IRCMS באוניברסיטת קומאמוטו על תמיכתו בהדמיה קונפוקלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
