Summary
Detta protokoll beskriver isolering och kultur av muntliga keratinocyter härrör från vuxna mus gommen. En utvärderingsmetod med immunostaining rapporteras också.
Abstract
I åratal har de flesta studier med keratinocyter utförts med hjälp av epidermala keratinocyter hos människa och mus. Nyligen har orala keratinocyter uppmärksammats på grund av deras unika funktion och egenskaper. De upprätthåller homeostas av det orala epitelet och fungerar som resurser för tillämpningar i regenerativa terapier. In vitro-studier som använder orala primära keratinocyter från vuxna möss har dock begränsats på grund av bristen på ett effektivt och väletablerat kulturprotokoll. Här isolerades muntliga primära keratinocyter från gommen vävnader av vuxna möss och odlades i en kommersiell lågkalcium medium kompletteras med en chelexed-serum. Under dessa förhållanden bibehölls keratinocyter i ett proliferativt eller stamcellsliknande tillstånd, och deras differentiering hämmades även efter ökade passager. Markör uttryck analys visade att odlade muntliga keratinocyter uttryckte basalcell markörer p63, K14 och α6-integrin och var negativa för differentieringsmarkören K13 och fibroblast markören PDGFRα. Denna metod producerade livskraftiga och odlingsbara celler som är lämpliga för nedströms applikationer i studien av muntliga epitelial stamcellsfunktioner in vitro.
Introduction
Det orala epitelet fungerar som en första barriär för att skydda kroppen från miljöbelastningar, inklusive kemiska eller fysiska skador och bakteriella och virala infektioner1,2. Munslemhinnan består av ett yttre skikt av stratifierat skivepitel som består av keratinocyter och underliggande bindväv som kallas laminapropria, som huvudsakligen består av fibroblaster och den extracellulära matrisen. Musens munslemhinnor kan i stort sett delas in i tre undertyper: masticatory (hård gom och gingiva), specialiserad (dorsal tunga) och foder (buccal slemhinnor, ventral tunga, mjuk smak, läppar) slemhinnor2,3 (figur 1A). Det orala epitelet är keratiniserat i masticatory och specialiserad slemhinnan och icke-keratinized i fodret slemhinnan. Trots sin anatomiska plats liknar det orala epitelet huden epidermis genom att det består av tätt packade epitelceller med varierande grad av differentiering: basala skikt som innehåller odifferentierade celler; spinous, granulat och cornified lager som bildar keratinized epitel, eller mellanliggande och ytliga lager som bildar icke-keratinized epitelium4. Transgena musmodeller har underlättat studien av orala epitelstamcellers cellulära och molekylära egenskaper i gommen, buccal slemhinnan, tungan och gingiva5,6,7,8,9,10,11. De flesta av dessa studier används dock främst in vivo mus experiment. Cellodlingssystem användes vanligtvis inte på grund av brist på etablerade och effektiva protokoll.
Ett in vitro-odlingssystem kan användas för molekylär och biokemisk analys av stamcellsregulatorer, cellbaserade analyser och läkemedelsscreening. För närvarande har protokoll för kulturen av primära keratinocyter i huden epidermis utvecklats, där basala keratinocyter framgångsrikt kan isoleras och odlas för kliniska och forskningsändamål12,13,14,15. 1980 visade Hennings et al. att en låg kalciumkoncentration (< 0,09 mM Ca2+) i odlingsmediet underlättade spridning och underhöll celler i ett odifferentierat tillstånd. En högre nivå av kalcium främjade cell differentiering och minskad spridning16. Därefter har odlingsmetoder för neonatal och vuxna murin epidermal keratinocyter etablerats och tillämpas i stor utsträckning på många musmodeller med olika genetisk bakgrund för in vitro-studier17,18,19. Även om hud och oral epithelia har gemensamma egenskaper, visar de också inneboende skillnader, t.ex. i deras keratiniseringsstatus, omsättningshastighet, genuttryck och sårläkningsförmåga3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Även om mänskliga muntliga keratinocyt kultur har framgångsrikt utförts27,28,29, publikationer på musen muntliga keratinocyte kultur30,31,32 är begränsade på grund av den lilla storleken på målvävnaden och de distinkta egenskaperna hos cellerna jämfört med huden epidermal keratinocyter. Detta protokoll beskriver isolering och långsiktiga kultur tekniker för musen primära muntliga keratinocyter.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna från Institutional Animal Experiment Committee vid Kumamoto University och University of Tsukuba.
1. Beredning av reagenser och kulturmedier
- Förbered 40 ml keratinocytkulturmedium som innehåller 60 μM kalcium och 600 μL antibiotika-antimykotisk lösning. Förbered 20 ml 0,025% trypsin och 400 μL antibiotika-antimykotisk lösning.
- Tina trypsinhämningslösningen vid rumstemperatur och håll den vid 4 °C tills den används i steg 4.1.
OBS: Isoleringsreagenset är förberett för vävnadsisolering av fem möss.
- Tina trypsinhämningslösningen vid rumstemperatur och håll den vid 4 °C tills den används i steg 4.1.
- För att förbereda odlingsmedierna, ta 500 ml medium och tillsätt 5 ml av en tillväxttillskottslösning (se Materialtabell) (nedan kallat komplett medium) och 20% kalciumfattigt chelexed-fetalt bovinserum (FBS)33 (nedan kallat chelexed-FBS).
2. Dissekering av gomsvävnad från vuxen mus
- Offra en vuxen C57BL/6J-mus (antingen hane eller kvinna) genom livmoderhalscancer förskjutning i enlighet med anläggningens föreskrifter om djurens välbefinnande.
- Ta bort håret runt munnen med en rakapparat. Använd sax, skär från kinden mot käken, på båda sidor.
OBS: Musen måste sövas före offer. En bedövningsblandning av medetomidin, midazolam och butorfanol används (se Tabell över material).
- Ta bort håret runt munnen med en rakapparat. Använd sax, skär från kinden mot käken, på båda sidor.
- Använd tång för att öppna munnen brett och absorbera eventuellt blod med en bomullspinne. För att desinficera gommen, torka insidan av munnen med en bomullspinne som innehåller 10% povidone-jod.
- För att skörda mussmaken, använd först ett kirurgiskt skalpellblad för att göra ett marginellt snitt med full tjocklek längs gommen på maxillarytänderna. Dissekera sedan försiktigt hela gommen med hjälp av ett raspatorium.
OBS: Ett raspatorium är ett verktyg som används för att höja en mukoperiosteal klaff (se Materialtabell) (figur 1B). - Överför snabbt gommen vävnaden till en 15 mL rör som innehåller 4 ml komplett medium + antimykotisk lösning. Håll vävnaderna på is tills de är klara för inkubation.
OBS: För insamling från flera möss kan gomvävnader förvaras på is i upp till 4 timmar.
3. Förbehandling av gomvävnad
- I en laminär flödeshuv, överför vävnader till en 60 mm skål som innehåller 4 ml komplett medium + antibiotisk antimykotisk lösning.
- Använd korta, trubbiga tångar och ett skalpellblad, ta försiktigt bort eventuellt blod från vävnaderna. Tvätta vävnader 10 gånger i komplett medium.
- Överför vävnader till en 35 mm skål som innehåller 4 ml 0,025% trypsin + antimykotisk lösning, med epitelytan vänd nedåt.
OBS: Epitelytan, som böjer sig inåt, ska blötläggas i trypsinlösningen. lamina propria bör vända upp. Vävnaden ska plattas ut så mycket som möjligt för att inkuberas helt i trypsinlösningen. - Inkubera vävnader i 0,025% trypsin i ~ 16 h vid rumstemperatur i kulturhuven.
4. Insamling och odling av primärceller
- Använd ett par trubbiga tångar, ta bort vävnad från trypsinlösningen (i 35 mm skålen) och överför till trypsinhämmare i en 60 mm skål (4 ml per skål) med epitelytan vänd uppåt.
- Använd tång för att hålla fast vid gommens kant och skrapa försiktigt epitelskiktet från den underliggande laminapropria med hjälp av ett skalpellblad.
OBS: Bindväv smälts inte av trypsin, så det skalar inte av under skrapning. - För att samla maximal mängd epitelceller från vävnader, överför vävnaden till en annan 60 mm skål med 4 ml komplett medium och upprepa skrapsteget.
OBS: Se till att undvika att skrapa vävnaden med bladets spets; använd bladets kant istället. Skrapning utförs i 5-10 min per vävnad. - Placera en steril 100 μm cellsil på toppen av ett koniskt rör på 50 ml.
- Använd en steril pipett och överför 2 ml trypsinlösning (från steg 4.1) till silen för att blöta dess yta.
- Blanda cellupphängningen i 60 mm skålen (från steg 4.2-4.3) några gånger med hjälp av en pipett och filtrera cellerna genom cellsilen på 100 μm som bereds i steg 4,4-4,5.
- Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer. Förbered 15 μL trypanblå lösning och tillsätt 15 μL cellfjädring (steg 4.6). Överför 10 μL av den cell-trypan blå blandningen till en hemocytometer och räkna antalet celler.
OBS: En bit mussmak kan ge upp till 1 miljon celler. - Centrifugera röret (från steg 4.6) vid 100 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten med en pipett. Tillsätt 2 ml komplett medium + chelexed-FBS till röret. Resuspend cellpelleten genom att triturera flera gånger med en 5 mL pipett.
- Platta 2-5 x 105 celler från en mus till en brunn på en 24-välplatta förbelagd med kollagentyp I (se Materialtabell).
- Inkubera cellerna vid 37 °C i 2 dagar utan att byta medium.
- Två dagar efter sådd, ersätt hälften av odlingsmediet med det kompletta mediet + chelexed-FBS. Kontrollera cellmorfologin under mikroskopet. Mata celler med komplett medium + chelexed-FBS varannan dag.
OBS: Efter sådd kommer celler av olika storlekar att observeras. Cirka 3-5 dagar efter sådd kan keratinocyter med kullerstensmorfologi (figur 2) observeras. Det tar 1-2 veckors kultur innan den första passagen kan utföras och en efterföljande 1-2 veckor är nödvändig innan cellerna är redo för den andra och tredje passagen. Därefter kommer cellerna att växa snabbare och kan förberedas för kryopreservation. Celler kan ompläteras till en brunn (av en 24-välplatta) respektive en 6-välplatta i den första respektive andra passagen. Den efterföljande passagen kommer att vara beroende av cellens tillväxt och densitet. Ett celldelningsförhållande på 1:2 eller 1:3 kan användas efter den tredje passagen.
5. Keratinocyte passage
- Samla 2 ml av supernatanten från odlingsrätten och dispensera i ett koniskt rör på 15 ml (på is). Tvätta cellerna med steril 1x PBS två gånger.
OBS: När cellerna når ungefär 70%-80% sammanflöde är de redo för passage. - Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA till skålen till en brunn på en 6-väl tallrik.
- Inkubera i 5-15 min vid 37 °C; kontrollera efter 5 min för att se om cellerna lossnar från skålen.
- Neutralisera reaktionen med 1 ml trypsinhämningslösning och 2 ml komplett odlingsmedium + chelexed-FBS genom skonsam pipettering. Överför sedan cellfjädringen till samma koniska rör på 15 ml som i steg 5.1.
- Centrifugera cellfjädringen vid 100 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera supernatanten med en pipett och återanvänd cellpelleten i 1 ml komplett odlingsmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Därefter platta 1 ml av cellfjädringen till en ny 24- eller 6-väl kulturplatta.
OBS: Några av cellerna från de tidiga passagerna kan frysas i en blandning av 70% komplett odlingsmedium + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 kryovialer av celler kan samlas in från en sammanflödeskulturplatta.
6. Cryopreservation och återhämtning av keratinocyter
- Cellfrysning
- Odla keratinocyter till 80-90% confluency.
OBS: Låt inte celler växa över, eftersom detta kan minska deras spridningsstatus och livskraft. - Behandla keratinocyterna i skålen med 0,05% trypsin-EDTA, enligt beskrivningen i steg 5,1-5,5.
- Räkna keratinocyterna med hjälp av en hemocytometer. Förbered cryovials baserat på beräknade cellnummer för att möjliggöra överföring av 1 x 106 celler/ml till varje flaska.
- Centrifugera cellfjädringen vid 100 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i en 10 ml-lösning på 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% komplett odlingsmedium (9 ml komplett medium + chelexed-FBS och 1 ml DMSO).
- Dispensera cellerna i kryovialer vid 1 ml suspension per injektionsflaska. Placera injektionsflaskan i en kryogen förvaringsbehållare över natten vid -80 °C. Överför injektionsflaskan till en flytande kvävetank följande dag.
- Odla keratinocyter till 80-90% confluency.
- Cellåterställning
- Ta bort en kryovial från den flytande kvävetanken och tina delvis vid rumstemperatur. Blanda 1 ml av cellfjädringen med 3 ml komplett odlingsmedium + chelexed-FBS i ett 15 ml-rör.
- Centrifugera blandningen i 5 min vid 100 x g och 4 °C. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml komplett odlingsmedium + chelexed-FBS.
- Plätera cellfjädringarna till nya 60 mm kollagen I-belagda odlingsrätter. Byt ut odlingsmediet var 2-3 dag och passage cellerna när de har konfluent.
7. Immunofluorescent färgning
- Odla orala keratinocyter på fyrkantiga täcken (22 mm x 22 mm) i 6-brunnsplattor (5 x 105 celler/brunn) i 2 dagar.
- Fixera keratinocyter i en lösning på 4% paraformaldehyd (PFA) och PBS i 20 min vid rumstemperatur innan du tvättar tre gånger med 1x PBS.
- Permeabilisera celler i en lösning på 0,1% Triton i PBS. Inkubera celler i blockerande reagens (2,5% getserum, 2,5% åsneserum) i 1 h vid rumstemperatur, följt av inkubation över natten med primära antikroppar (se Materialtabell) vid 4 °C.
OBS: Primära antikroppar användes vid följande utspädningar: kanin anti-K14 (1:1000), råtta α6-integrin (1:100), kanin anti-p63 (1:500), kanin anti-K13 (1:100) och get anti-PDGFRα (1:100). - Tvätta prover i en lösning på 0,1% Triton i PBS, följt av inkubation med sekundära antikroppar i 1 h vid rumstemperatur.
OBS: De sekundära antikropparna (Alexa 488 eller 555) användes vid en utspädning på 1:300. - Mottain alla prover med Hoechst lösning i 10 min och montera celler på glasrutschbanor.
OBS: Hoechst-lösningen används för att fläcka cellernas kärnor. - Utför provavbildning med hjälp av ett konfokalt mikroskop.
OBS: Ljusstyrkan och kontrasten justeras till lika intensitet med hjälp av bildredigeringsprogram.
Representative Results
Översikt över dissekeringsprocessen och isolering av orala keratinocyter från den vuxna muspalten
Dissociated muntliga keratinocyter samlades från vuxna mus gommen och odlades i en anpassad 20% chelexed-FBS. Mussmaken består av den hårda gommen och den mjuka gommen (figur 1C). Förfarandet för isolering av mus muntliga keratinocyter sammanfattas i figur 1D. Gommen vävnad dissekeras och överförs till ett medium som innehåller en antibiotisk-antimykotisk lösning innan inkuberas i 0,025% trypsinlösning vid 4 °C över natten. Följande dag behandlas gommen vävnaden med trypsinhämmare lösning och komplett odlingsmedium i lika volymer. Därefter skrapas vävnaderna med hjälp av ett kirurgiskt skalpellblad för att samla orala keratinocyter. Cellupphängningen filtreras genom en 100 μm cellsil och centrifugeras. Cellerna sås sedan i kollagen I-belagda 24-brunnsplattor som innehåller 2 ml komplett odlingsmedium + chelexed-FBS.
Representativa resultat av framgångsrik isolering av mus orala keratinocyter
Primära muntliga keratinocyter växte som en monolayer och visade en kullersten morfologi (figur 2). Små keratinocytkolonier var synliga vid 3-5 dagar (figur 2A, B); dessa växte större och bildade snäva kolonier vid 1 veckas inkubation (figur 2C). Keratinocyt kolonier visade de typiska morfologiska funktionerna i basala keratinocyter, vilket anger deras hälsosamma villkor. Mänskliga muntliga keratinocyter förblev odifferentierade för flera passager i hela kulturmediet som innehåller 0,06 mM Ca2 +16,28. Den första passagen utfördes ungefär 2 veckor från den första plätering (figur 2D). Vid senare passager uppvisade keratinocyter stabil tillväxt med en kortare kulturperiod (figur 2E-G). Keratinocyter slutade växa om betydande fibroblaster förorenades under isoleringsprocessen (figur 2H).
Isolerade mus orala keratinocyter uttrycker basalcellsmarkörer
För att bekräfta statusen för primära muntliga keratinocyter utfördes immunstaining med hjälp av basalcellsmarkörerna Keratin 14 (K14) och α6-integrin34. K14 och α6-integrin uttrycktes i keratinocyter efter odling (figur 3A, B). Cellerna var också färgade med stamcellsmarkör p63 för att bekräfta deras stemness. Tidiga passage (passage 4) och sen passage (passage 7) celler visade enhetligt uttryck för p63 (figur 3C,D). Keratinocyter som behandlats med högt kalcium (1, 2 mM induktion i 2 dagar) uppvisade däremot minskat p63-uttryck (figur 3E), vilket tyder på att hög kalciumbehandling undertrycker stamcellsrelaterade gener i primära keratinocyter som tidigare rapporterats16. Differentieringsmarkören Keratin 13 (K13) visade sällsynta eller inga uttryck i både tidiga och sena passager och betydande uttryck under hög kalciumbehandling (figur 3F-H). För att testa risken för fibroblastkontaminering i keratinocytkulturen utfördes färgning med fibroblastmarkören PDGFRα med samma uppsättning keratinocyter jämfört med mus embryonal fibroblast (MEFs). det fanns inget uttryck för PDGFRα i keratinocyte odlingen, jämfört med det höga uttrycket som observerats i MEF celler (figur 3I-3L). Dessa resultat anges att detta protokoll framgångsrikt kunde isolera basala keratinocyter och upprätthålla dessa celler i det odifferentierade tillståndet.
Figur 1: Översikt över dissekeringsförfarandet och isolering av mus orala keratinocyter. A) Schematisk representation av munhålan för musen. B) Instrument som används för att dissekera gommen och isolera musmusala keratinocyter. (C) Brightfield bild av mus gommen. Skalstång: 100 μm. (D) Sammanfattning av protokollet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa resultat av framgångsrik isolering av mus muntliga keratinocyter. (A-G) Tidskurs bilder av odlade primära muntliga keratinocyter vid 3 dagar (A), 5 dagar (B), 1 vecka (C) och 2 veckor (D) av kultur efter isolering. Morfologier av mus orala keratinocyter efter de första (E), andra (F) och tredje (G) passagerna visas. (H) Exempel på fibroblastkontaminering i mus oral keratinocytkultur. Skalstång: 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Isolerade mus orala keratinocyter uttrycker basalcellsmarkörer. (A-B) Representativa bilder av immunofluorescent färgning av K14 (A; röd) och α6-integrin (B; grön) i passage 4. (C-E) Representativa bilder av immunofluorescent färgning av p63 (grön) i passage 4 (C), passage 7 (D) och hög kalciumbehandling (E). (F-H) Immunostaining bilder av K13 (grön) i passage 4 (F), passage 7 (G) och hög kalciumbehandling (H). (I-L) Immunostaining bilder av PDGFRα (röd) i passage 4 (I), passage 7 (J), hög kalciumbehandling (K) och MEFs (L). Kärnor är färgade med Hoechst (blå). Skalningsstaplar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Primära keratinocyter isolerade från human- eller mushud epidermis har använts i många år i forskning och kliniska tillämpningar12,13,15,18,27,28,29. Däremot har få protokoll upprättats för att isolera och odla primära muntliga keratinocyter från vuxna möss30,31,32. Denna studie använde ett kommersiellt komplett odlingsmedium och chelexed-FBS för att upprätthålla keratinocyter i ett proliferativt eller stamcellsliknande tillstånd. Detta kultursystem kan användas i molekylära och biokemiska analyser för att ytterligare förstå funktionerna i orala epitelala stamceller och deras relaterade sjukdomar.
Flera kritiska steg ingår i det här protokollet. För det första är trypsinkoncentrationen och inkubationstiden avgörande för att producera livskraftiga celler för efterföljande kulturer. Vi använde konsekvent 0,025% trypsinlösningar och 16 h inkubationsperioder i kammarhuven vid rumstemperatur. Om keratinocyter inte inkuberas tillräckligt länge skulle de inte separeras ordentligt från vävnaden, vilket resulterar i ett lägre slutligt cellutbyte. För det andra påverkar skonsam pipettering av cellupphängningen den andra dagen särskilt cellens livskraft. Skrapningen ska försiktigt börja från epitelsidan och inte överstiga 10 min per vävnadsprov. Slutligen innehåller den första isolerade cell suspensionen fibroblaster och andra celltyper; dessa oönskade celler börjar vanligtvis försvinna i efterföljande kulturer.
Potentiella begränsningar identifierades under cell isolering och kultur. I sällsynta fall kan fibroblaster kontamineras under isoleringsprocessen, och fibroblaster kan hämma tillväxten av keratinocyter i efterföljande passager (figur 2H). Det är nödvändigt att välja ett kommersiellt medium som innehåller en fibroblast tillväxthämmare för att eliminera sådan förorening i kulturen. Eftersom mussmaken och annan munslemhinnan har relativt små storlekar kan det ursprungliga cellutbytet från en mus vara lågt. Därför är hela kulturperioden för detta protokoll-tills kryopreservationstadiet-är längre än för primära huden keratinocyter. Isolerade orala keratinocyter används bäst inom 10 passager, eftersom mer längre kulturperioder kan ändra cellegenskaperna och minska antalet stamceller.
Den nuvarande metoden visade att musen muntliga keratinocyter uppvisade en tätt packad, kullersten morfologi och bildade monolayer kolonier under proliferative villkor. De visade också högt uttryck för de basala markörer α6-integrin, K14 och stamcellsmarkör p63. I framtida studier, förutom immunofluorescensfärgning, RNA-sekvensering, RT-PCR och västra blot analyser kommer att användas för att verifiera cellulär heterogenitet och renhet av muntliga keratinocyter, vilket ytterligare kommer att öka vår förståelse av arten av dessa celler.
Efter 2-3 passager var muntliga keratinocyter tillräckligt stabila för att användas i ytterligare funktionella experiment. Viktigt är att detta kulturprotokoll kan kombineras med transgena muslinjer, inklusive gen knockout, Cre-loxP och tet-inducible system, och kan också användas i cellulära och molekylära analyser. Således ger detta protokoll forskare en grundläggande och effektiv metod som kan användas för att förstå oral keratinocytstamcellbiologi ytterligare.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (till A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (till A.S.), AMED under Grant Number JP21gm6110016 och 21bm0704067 (till A.S.) och forskningsbidrag från Takeda Science Foundation (till A.S.). Vi tackar Centre for Animal Resources and Development vid Kumamoto University och Animal Resource Center vid University of Tsukuba för deras utmärkta musvård. Vi tackar IRCMS kärnanläggning vid Kumamoto University för dess stöd inom konfokal avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
