Summary
Yöntemin amacı, fare modellerinde hipertermi veya ısıya bağlı nöbetleri taramaktır. Protokol, yüksek vücut sıcaklığının nöbetlere yol açıp açmadığını belirlemek için vücut sıcaklığının sürekli izlenmesi ile özel olarak inşa edilmiş bir odanın kullanımını açıklar.
Abstract
Transgenik fare modellerinin, epilepsi de dahil olmak üzere insan nörolojik bozukluklarının çeşitli yönlerini incelemede güçlü araçlar olduğu kanıtlanmıştır. SCN1A ile ilişkili genetik epilepsiler, penetransı ve klinik değişkenliği eksik olan geniş bir nöbet bozukluğu spektrumunu oluşturur. SCN1A mutasyonları, basit, kendi kendini sınırlayan ateşle ilişkili ateşli nöbetler (FS), ateşli nöbetler artı (GEFS +) ile orta düzeyde genetik epilepsiden daha şiddetli Dravet Sendromuna (DS) kadar çok çeşitli nöbet fenotipine neden olabilir. FS, genetik epilepsisi olmayan 6-7 yaş altı çocuklarda yaygın olarak görülmekle birlikte, GEFS+ hastalarında FS yetişkinliğe kadar görülmeye devam etmektedir. Geleneksel olarak, deneysel FS, hayvanı bir kuru hava akışına veya ısıtma lambalarına maruz bırakarak farelerde indüklenmiştir ve vücut ısısındaki değişim oranı genellikle iyi kontrol edilmez. Burada, dijital bir sıcaklık kontrol cihazı ve ısıtılmış cebri havayı test arenasına sıcaklık kontrollü bir şekilde gönderebilen ısıtıcı donanımlı bir elektrikli fan ile donatılmış pleksiglas bir ön cepheye sahip özel yapım bir ısıtma odasını tarif ediyoruz. Odaya yerleştirilen ve rektal prob ile izlenen bir farenin vücut ısısı, oda içindeki sıcaklık artırılarak tekrarlanabilir bir şekilde 40-42 °C'ye yükseltilebilir. Isıtma periyodu boyunca hayvanların sürekli görsel olarak izlenmesi, vahşi tip çöp arkadaşlarında davranışsal nöbetlere neden olmayan bir vücut sıcaklığında FS mutasyonu taşıyan farelerde ısıya bağlı nöbetlerin indüklendiğini göstermektedir. Hayvanlar odadan kolayca çıkarılabilir ve vücut ısısını hızla normale döndürmek için bir soğutma yastığına yerleştirilebilir. Bu yöntem, epilepsi fare modellerinde ısıya bağlı nöbetlerin ortaya çıkması için basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir tarama protokolü sağlar.
Introduction
Amerika Birleşik Devletleri'nde dördüncü en yaygın nörolojik bozukluk ailesi olan epilepsi1, CNS'de tekrarlayan nöbetlere yol açan uyarıcı ve inhibitör sürücü dengesizliği ile karakterizedir. Febril nöbetler (FS) veya ateşe bağlı nöbetler genel popülasyonda, çoğunlukla 6-7 yaşına kadar 3 ay kadar erken çocuklarda ortaya çıkabilir. Bununla birlikte, genetik mutasyonları olan bazı bireylerde, çoğunlukla bir sodyum kanal geninde, FS 7 yaşından sonra yetişkinliğe kadar devam edebilir. Bu durum ateşli nöbetler artı veya FS + olarak adlandırılır. Genom dizilemesindeki hızlı gelişmeler, insan sodyum iyon kanalı geni SCN1A'da 1.300'den fazla mutasyon tespit etti ve bu da onu epilepsi mutasyonları için bir sıcak nokta haline getirdi. SCN1A mutasyonları, ateşli nöbetler (FS), ateşli nöbetler artı (GEFS +) ile genetik epilepsi ve Dravet Sendromu (DS) 2,3,4,5,6 dahil olmak üzere geniş bir nöbet bozukluğu spektrumu ile ilişkilendirilmiştir. SCN1A yanlış anlamlı mutasyonlarının yaklaşık% 20'si GEFS + 5,7,8'e yol açar. Çocukluk çağında kompleks veya uzamış FS'nin pediatrik öyküsü daha sonra temporal lob epilepsisi (TLE) 9,10,11 gibi daha zayıflatıcı epilepsi formlarına dönüşebilir. Dravet Sendromu, SCN1A'daki kesilme mutasyonları veya fonksiyon kaybı mutasyonları nedeniyle ortaya çıkar ve çocukluk çağında refrakter nöbetlere dönüşen ateşli nöbetlerin başlangıcı ile şiddetli bir inatçı epilepsi şeklidir ve sıklıkla bilişsel, gelişimsel ve motor bozukluklarla ilişkilidir2,5,12 . GEFS + ve / veya DS'li birçok birey ateşli nöbetler sergilediğinden, bu nöbet bozukluklarıyla daha iyi mücadele etmek için yeni tedaviler geliştirmek zorunlu hale gelir.
SCN1A ile ilişkili epilepsinin hayvan modellerinin, farklı nöbet tiplerini (ateşli ve genelleştirilmiş) karakterize etmede ve nöbet jenerasyonunun nöronal mekanizmasını diseke etmede paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır13,14,15,16,17,18. Kemirgen beyinlerinde EEG / EMG kayıtları yoluyla spontan nöbetlerin incelenmesi iyi kurulmuş ve çok yararlı bir araç olsa da, sadece birkaç çalışma fare modellerinde ateşli nöbetleri taklit etmeye çalışmıştır14,16,19,20,21,22,23 . Önceki çalışmalar, hipertermi yoluyla nöbetleri indüklemek için ısıtılmış kuru hava jeti veya termal sistemle donatılmış bir metakrilat silindiri veya kapalı test arenalarında sıcaklık kontrol cihazına sahip ısı lambaları9,16,21,22,23,24 kullanmıştır. Daha kontrollü bir ortamda vücut ısısını arttırmak için, burada açıklanan protokol, odanın içindeki bir farenin vücut sıcaklığında tekrarlanabilir artış oranlarına izin veren sıcaklık kontrollü bir ısıtma sistemine sahip özel yapım bir oda kullanır. Isı odası ahşaptan (uzunluk 40 cm x genişlik 34 cm x yükseklik 31 cm) inşa edildi ve bir K termokupllı dijital bir sıcaklık kontrol cihazı ile donatıldı. Odanın arka panelinde bir ısıtıcı ile donatılmış küçük bir eksenel fan, ısıtılmış havayı dijital bir sıcaklık kontrolörü tarafından düzenlenen odaya yönlendirir. Bu cebri hava ısıtma sistemi, oda sıcaklığının artma hızını kontrol etmeyi sağlar. (Şekil 1A,B). Ahşap ısı odasının içinde bulunan K termokupl, tahlil sırasında kutunun içindeki sabit sıcaklıkları korumak için dijital sıcaklık kontrol cihazına geri bildirim gönderir. Dijital sıcaklık kontrol cihazında sıcaklığın ayarlanması, elektrikli fanın odayı eşit şekilde ısıtmak için havalandırma deliklerinden ısıtılmış cebri hava göndermesini sağlar (Şekil 1A). Isı odasının ön paneli, denemelerin kolay video kaydını sağlamak için şeffaf bir pleksiglas levhadır.
SCN1A'da GEFS + 'ya neden olan yanlış anlamlı bir mutasyon için heterozigot olan yetişkin (P30-P40) fareler ve kontrol grubu olarak hizmet etmek için eşit sayıda vahşi tip çöp arkadaşı, her deney için seçildi. Bu çalışmalarda kullanılan hem erkek hem de dişi hayvanlar, en az 15 g ağırlığındaydı, çünkü daha az ağırlığa sahip vahşi tip fareler, aynı yaştaki daha ağır hayvanlara göre ısıya bağlı nöbetlere karşı daha hassastı. Pilot çalışmada, hem mutant hem de vahşi tip farelerin, odanın arkadaki daha serin köşelerini aradıkları ve uzun süre orada kaldıkları gözlendi. Bunu atlatmak için, ısı odası test arenasının içindeki etkili zemin boyutu, odanın sağ tarafına ahşap bir B bloğu (boyutlar 20 cm x 8cm x 7,2 cm) yerleştirilerek 16,5 cm x genişlik 21,5 cm x yükseklik 27,5 cm uzunluğa düşürülmüştür (Şekil 1A). Isı odası, beyaz laminatla kaplı 1,9 cm kalınlığında kontrplaktan (uzunluk 40 cm x genişlik 34 cm x yükseklik 31 cm) inşa edilmiş ve K termokupllı bir dijital sıcaklık kontrolörü ile donatılmıştır. Oda duvarlarının laminat yüzeyi geçirimsizdir ve denemeler arasında% 70 etanol ile silinerek kolayca sterilize edilebilir. Isı odasının sıcaklığı başlangıçta 50 ° C'ye ayarlandı ve odanın içinde eşit ısıtma sağlamak için deneyin başlamasından en az 1 saat önce önceden ısıtıldı. Her fareye, deney boyunca vücut sıcaklığının sürekli izlenmesi için bir rektal termometre takıldı. Odaya bir seferde tek bir fare yerleştirildi ve sıcaklık 1.-10. dakika arasında 50 ° C'de tutuldu. Sıcaklık daha sonra 11.-20. dakika için 55 ° C'ye yükseltildi ve son olarak 21.-30. dakika için 60 ° C'ye yükseltildi. Bu, fare vücut ısısında tekrarlanabilir bir artış oranına neden oldu (Şekil 2A). Her deneme videoya kaydedildi ve davranış analizi çevrimdışı olarak yapıldı.
Isıtma protokolü, ısı odasının başlangıç sıcaklığını ve odanın ısıtılma hızını değiştirmek için kolayca değiştirilebilir, bu da tahlil sırasında farenin vücut sıcaklığının ne kadar hızlı yükseldiğini değiştirir. Bu nedenle, bu yöntem, ısıya bağlı nöbetleri içeren davranışsal ekranların kurulmasında geleneksel yöntemlere göre daha fazla esneklik sağlar. Isıya bağlı nöbet protokolü, mutant fareleri ısıya bağlı nöbetlere karşı daha dirençli hale getiren veya nöbetlerin gözlendiği eşik sıcaklığını artıran anti-epileptik ilaçları taramak için de kullanılabilir. Benzer şekilde, keto diyeti gibi kısıtlayıcı diyet rejimlerinin ısıya bağlı nöbetler üzerindeki yararlı etkileri, normal chow-fed vs keto ile beslenen farelerde incelenebilir.
Şekil 1: Özel yapım fare ısı odasının açıklaması. (A) Ahşap fare ısı odasının ön paneli, dijital sıcaklık kontrol cihazını, K termokuplını, fan ısıtıcısının AÇIK/KAPALI anahtarını ve ısı göstergesini açan Güç AÇIK/KAPALI anahtarını içeren yan kontrol panelini gösterir. Kutunun dış boyutları ve iç test arenası cm cinsinden gösterilmiştir. Test arenası yüzeyini etkili bir şekilde azaltmak için kullanılan ahşap bir B bloğu da gösterilmiştir. Test arenasının dibi, farelerin ısıtılmış ahşap yüzeylerle doğrudan temas etmesini önlemek için koçan yatakları ile kaplıdır. (B) Isı odasının arka paneli, üst havalandırma deliğine monte edilmiş fanı ve odaya elektrik sağlamak için güç kablosunu gösterir. Bu rakam, Das ve ark., 2021, eNeuro14'teki Şekil 3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Kaliforniya Üniversitesi, Irvine'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Isıya bağlı nöbet tahlili için hazırlık
- Isı odasındaki Güç Aç düğmesini, ardından Isıyı Aç düğmesini açın.
- Dijital sıcaklık kontrol cihazındaki tuş takımını kullanarak ısı odasının sıcaklığını 50 °C'ye ayarlayın.
- İlk fareyi hazneye sokmadan önce odayı 50 °C'de ısıtmak için en az 1 saat bekleyin. Ön ısıtma, oda içinde eşit ısıtma sağlar.
- Fare ısı odasının zeminini koçan yataklarıyla hizalayın.
- Isıya bağlı her nöbet testi denemesini kaydetmek için ısı odasının önüne bir video kayıt kamerası takın.
- 140 mm çapında bir Petri kabını kalın kağıt mendil tabakalarıyla hizalayın ve soğutma yastığı olarak kullanılmak üzere buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Tahlilin sonunda, yüksek vücut ısısını düşürmeye yardımcı olmak için her bir fare, önceden soğutulmuş soğutma yastığına aktarılacaktır.
2. Fareyi ısıya bağlı nöbet tahlili için hazırlama
- Isıya bağlı nöbet tarama testi için 10 yetişkin fareyi (P30-P40), mutasyona neden olan epilepsiyi taşıyan 5'i ve vahşi tip çöp arkadaşlarından 5'ini seçin.
NOT: Mutasyona neden olan herhangi bir epilepsi barındırmayan vahşi tip fareler, 44 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda ısıya bağlı nöbetler göstermez ve kontrol grubu olarak görev yapar. - Tarama testi için kullanılacak her fareyi tartın ve vücut ağırlığını kaydedin. Tahlil için sadece 15 g veya daha ağır fareler kullanılmalıdır.
- Fare ısı odasında her seferinde bir fareyi tarayın.
- Bir çan kavanozunun dibinde birkaç damla izofluran kullanarak fareyi 10-15 s için kısaca uyuşturun.
- Hayvanı çan kavanozundan çıkarın ve bir kağıt havluya yerleştirin.
- Farenin zararlı bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediğini kontrol ederek farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- Rektal sıcaklık probunun metal ucunu bir yağlayıcı (petrol jölesi gibi) ile kaplayın ve fareye 2 cm'den daha az veya 2 cm'ye eşit bir derinlikte yavaşça yerleştirin.
- Rektal probu farenin kuyruğuna bantla sabitleyin, böylece test sırasında prob çıkmaz.
NOT: Alternatif olarak, hayvanı bir fare tutucu konisine yerleştirin ve rektal sıcaklık probunu yerleştirin. Kuyruğa bantlayarak sabitleyin. - Rektal probun, farenin iç vücut sıcaklığını gösteren bir multimetreye bağlı olduğundan emin olun.
- Hayvanı koçan yataklarıyla kaplı taze bir kafese, yani kurtarma kafesine yerleştirin.
- Bir zamanlayıcı başlatın ve 5 dakika bekleyin. Anesteziden tamamen kurtulana ve fare aktif ve tımar edene kadar fareyi gözlemleyin.
- Aynı zamanda, farenin çekirdek vücut sıcaklığını 35-36 ° C'de stabilize olana kadar izleyin.
- 5 dakika sonunda, farenin vücut sıcaklığını not edin. Bu, "0" dakika zamanındaki ilk vücut sıcaklığıdır.
NOT: Farenin çekirdek vücut ısısı 35 ° C'nin altındaysa, hayvanın anesteziye bağlı hipotermiden kurtulması için ek süre bekleyin. - Tek bir fareyi hızlı bir şekilde, önceden ısıtılmış fare odasına aktarın. Bu, deneme denemesinin BAŞLANGICINI işaret eder. Belirli bir anda yalnızca bir fare taranır.
3. Isıya bağlı nöbet testi
- Fareyi önceden ısıtılmış fare ısı odasının zeminine yavaşça yerleştirdikten sonra, pleksiglas kapıyı kapatın ve deneyi video kaydı için kamerayı başlatın.
- Kronometreyi başlatın. Farenin vücut sıcaklığını rektal termometreden deney süresince 1 dakikalık aralıklarla kaydedin.
- Düzenli aralıklarla, fare ısı odasının sıcaklığını, farenin vücut sıcaklığının 0.25-0.5 °C / dak oranında artacağı şekilde artırın.
NOT: Vücut ısısındaki hızlı artışlar sıcak çarpmasına veya ölüme neden olabilir ve bundan kaçınılmalıdır. - Bu protokolü takiben, fare ısı odasının sıcaklığını Şekil 2A'da gösterildiği gibi her 10 dakikada bir 5 °C artırın.
- 9,5 dakikada, ısı odasının sıcaklığını 55 ° C'ye ayarlayın, böylece ısı odasının sıcaklığını dijital sıcaklık ekranında gösterildiği gibi 10. dakikada 55 ° C'ye sabitleyin.
- Benzer şekilde, ısı odasının sıcaklığını 20. dakikada 60 ° C'ye sabitlemek için sıcaklığı 19,5 dakikada 60 ° C'ye yükseltin. Her nöbet tarama denemesi 30 dakika sürer.
- Farenin nöbeti varsa (ses çıkarır, başını sallar, ön ayak klonusu, arka bacak uzantısı, yan tarafına düşer veya genelleştirilmiş tonik / klonik konvülsiyonlar yaşarsa), aşağıdaki bilgileri kaydedin.
- Nöbet sırasında farenin vücut sıcaklığını (nöbet eşik sıcaklığı) rektal sıcaklık termometresinden kaydedin.
- Baş sallama, ön ayak klonusu, arka ekstremite uzantısı, yana düşme ve / veya fare tarafından görüntülenen genelleştirilmiş tonik / klonik nöbetler (GTCS) gibi nöbet davranış özelliklerini kaydedin.
- Fareyi odadan hızlı ama nazik bir şekilde alın ve adım 1.6'da hazırlanan soğutma yastığına yerleştirin.
NOT: Bir fare Racine ölçeği 5 nöbetleri yaşıyorsa ve kontrolsüz atlama sergiliyorsa, hayvanı ısı odasından almak ve dışarıdaki soğutma pedine aktarmak zor olabilir. Bununla birlikte, tipik bir ısıya bağlı nöbet 30 s ila 60 s arasında sürer.Bu nedenle, fare ısı odasından çıkarılmalı ve ısıya bağlı nöbet bölümünün başlamasından sonraki 60 s içinde soğutma yastığına yerleştirilmelidir. - Bir kurtarma kafesine aktarmadan önce fare vücut sıcaklığının 36-37 ° C'ye düşmesini bekleyin. Kurtarma kafesine aynı anda yalnızca bir fare yerleştirilir.
NOT: Isıya bağlı tarama için henüz kullanılmamış fareleri, ısıya bağlı nöbet deneyi denemesini zaten yaşamış olan fareyle karıştırmayın. - Rektal probu fareden çıkarmak için hafifçe ve dikkatlice fare kuyruğu ile rektal prob teli arasındaki bandı bir çift makasla kesin.
- Rektal probun metal ucunu %70 alkol ve yumuşak doku mendilleriyle silerek bir sonraki denemeye hazır tutun.
- Fareyi ev kafesine döndürmeden önce fareyi normal aktiviteye (yürüme, tımar vb.) devam edene kadar kurtarma kafesinde gözlemlemeye devam edin. Bu, bu fare için deneme denemesinin SONUNU işaret eder.
- Hayvan durumunu canlı tahlilinden sonra kaydedin ve test oturumundan veya ölüden kurtulun. Kontrolsüz atlama ve genelleştirilmiş tonik / klonik nöbetleri içeren yüksek yoğunluklu nöbetler bazen farenin ölümüyle sonuçlanabilir.
- Bir fare 30 dakikalık gözlem süresi içinde ısıya bağlı nöbetler yaşamazsa veya farenin vücut ısısı 44 ° C'ye ulaşırsa, fareyi ısı odasından çıkarın ve farenin vücut sıcaklığı 36-37 ° C'ye dönene kadar soğutma pedine yerleştirin.
- Fare ısı odasının sıcaklığını 50 ° C'ye sıfırlayın ve dijital sıcaklık kontrol cihazındaki ekran sıcaklığı 50 ° C'yi gösterene kadar dengelenmesini sağlayın.
- Koçanı yataklarını tek tek fare denemeleri arasında değiştirin.
- Bölüm 2'de açıklandığı gibi tarama denemesi için bir sonraki fareyi hazırlayın ve bölüm 3'teki adımları yineleyin.
4. Hayvanları ötenazi
- Çoğu hayvan ısıya bağlı nöbetler sonrası iyileşse de, deneyimlerimize göre, farelerin birkaçı, ısıya bağlı nöbetlerin 24-48 saati içinde ev kafeslerinde SUDEP (EPilepsy'de Ani Açıklanamayan Ölüm) geçirir. 30 dakikalık denemeyi takiben ısıya bağlı nöbetler için tüm fareler üzerinde ayrı ayrı taramayı tamamladıktan sonra, kurumun IACUC kurallarına göre tüm fareleri ötenazi yapın.
5. Isıya bağlı nöbet verilerinin analiz edilmesi
- Bir hayvan kohortunun taranmasını tamamladıktan sonra, aşağıdaki formülü kullanarak nöbetleri gösteren belirli bir genotipteki farelerin yüzdesini hesaplayın:
- Belirli bir genotip içindeki farelerin ortalama nöbet eşiği sıcaklığını, ısıya bağlı nöbetler sergileyen genotipteki tüm farelerin (adım 3.7'de belirtilen) nöbet eşiği sıcaklığının ortalamasını alarak tahmin edin.
- Kimlik ve genotipe hala kör olmakla birlikte, nöbet nöbetlerinin ciddiyetini belirlemek için ısıya bağlı nöbet tahlili taraması sırasında farenin her birinin video kayıtlarını bir bilgisayar ekranında tekrar oynatın.
- Önceki çalışmalarda açıklandığı gibi modifiye edilmiş Racine ölçeğini13 kullanarak ısıya bağlı nöbet davranışı sergileyen bireysel farelere puanlar verin13,14. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
- Bir fare, ısıya bağlı nöbetler yaşarken, sadece başını sallıyorsa, 2 puan verin. Bir fare başını sallayarak bir nöbet atağı başlatırsa, ancak aynı zamanda ön ayak klonusu sergilerse, üzerine düşerse ve / veya zıplarsa, 5 puan verin.
- Yukarıda açıklandığı gibi değiştirilmiş Racine scale13'ü kullanarak her fare için maksimum puanı kaydedin.
- Belirli bir genotipteki tüm fareler tarafından sergilenen maksimum Racine skorlarının bir dağılım grafiğini çizin.
- Isıya bağlı nöbetler gibi davranışsal nöbetlerin şiddetini belirlemek için bir yöntem olarak farklı fare grupları arasındaki maksimum Racine skorlarını istatistiksel olarak karşılaştırın.
NOT: Rasinin skorları, farklı mutant fare grupları veya genotipleri arasındaki nöbet özelliklerini karşılaştırmak için yararlıdır. Vahşi tip farelerin ısıya bağlı nöbetlere maruz kalmaması ve Racine skor karşılaştırmaları için dikkate alınması gerekmemesi beklenmektedir. - Deneysel tasarıma dayanarak, vahşi tip ve mutant fareler arasında nöbet geçiren farelerin yüzdesinin ve ortalama nöbet eşiği sıcaklık değerlerinin birbirinden önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için uygun istatistiksel analiz yapın.
| Racine Skor | Nöbet özellikleri | ||
| 0 | Nöbet yok | ||
| 1 | Ağız ve yüz hareketleri | ||
| 2 | Başını sallama | ||
| 3 | Ön ayak klonu, genellikle bir uzuv | ||
| 4 | Yetiştirme ile ön ayak klonusu | ||
| 5 | Genelleştirilmiş tonik-klonik nöbet, yetiştirme, atlama, devrilme | ||
Tablo 1: Racine skorları.
Representative Results
Ateşli nöbet mutasyonlarına sahip hayvan modellerinin, vahşi tip çöp arkadaşlarında nöbetlere neden olmayan yüksek vücut sıcaklıklarında ısıya bağlı nöbetlere maruz kalması beklenir. SCN1A mutasyonları, hem ateşli hem de afebril jeneralize nöbetler sergileyen K1270T GEFS+ hastaları da dahil olmak üzere ateşli nöbetlerle ilişkilendirilmiştir7. CRISPR tarafından üretilen SCN1A K1270T GEFS + mutant fareleri, iki genetik arka planda ısı nöbetlerinin ortaya çıkması için yakın zamanda bir çalışmada14 tanımladık - nöbete dirençli 129X1 / SvJ (129X1) ve nöbete duyarlı C57BL / NJ (B6N) arka planları. Fare ısı odasında, herhangi bir GEFS + mutasyonu barındırmayan ve bu nedenle ısıya bağlı nöbetler sergilemesi beklenmeyen yaşla eşleşen vahşi tip çöp arkadaşları, kontrol grubu olarak görev yaptı. Zaman içindeki vücut ısısı değişim hızı, tahlil sırasında her dakika kaydedilen farelerin ortalama vücut ısısı çizilerek değerlendirildi. İlgili 129X1 ve B6N genetik arka planlarında test edilen heterozigot mutant fareler ile vahşi tip çöp arkadaşları arasında vücut ısısının değişim hızında fark yoktu (Şekil 2B, C). Bu, K1270T GEFS + heterozigot mutant farelerde termoregülasyonun değişmediğini göstermektedir.
129X1 (n = 15) veya B6N (n = 9) genetik arka plana sahip tüm heterozigot mutant fareler, ısıya bağlı nöbetler sergilemiştir (Şekil 2D). 129X1 zenginleştirilmiş arka plandaki vahşi tip farelerin hiçbiri (n = 13) ısıya bağlı nöbetler sergilememiştir (Şekil 2D). Buna karşılık, nöbete duyarlı B6N arka planında test edilen farelerin üçte biri (n = 9 fareden 3'ü) ısıya bağlı nöbetler sergiledi. İstatistiksel karşılaştırma, ısıya bağlı nöbetler sergileyen heterozigot mutant farelerin yüzdesinin, hem 129X1 hem de B6N genetik arka planlarında kendi vahşi tip muadili farelerden anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermektedir (Şekil 2D, Fisher'ın kesin testi, 129X1 p < 0.0001; B6NJ p = 0,009). 129X1 ve B6N genetik arka planlarındaki heterozigot mutant fareler arasındaki ortalama nöbet eşiği sıcaklığı benzerdi. 129X1 mutant farelerin ortalama nöbet eşiği sıcaklığı 42.6 ± 0.20 °C'dir, bu da B6N farelerde görülen 42.7 ± 0.06 °C'lik ortalama nöbet eşiği sıcaklığından anlamlı olarak farklı değildir (Şekil 2E; iki kuyruklu eşlenmemiş Student's t-testi, p = 0.782). Isıya bağlı nöbetler sergileyen üç B6N vahşi tip farenin ortalama nöbet eşiği sıcaklığının 43.7 ± 0.08 °C olduğunu ve B6N heterozigot mutant fareler tarafından görüntülenen 42.7 ± 0.06 °C'lik ortalama nöbet eşiğinden anlamlı derecede yüksek olduğunu belirtmek önemlidir (Şekil 2E, iki kuyruklu eşlenmemiş Öğrenci t-testi, p < 0.0001).
Odanın pleksiglas önü, daha önce açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir Raçin ölçeğinde her farede nöbet şiddetini puanlamak için daha sonra kullanılabilecek tahlil sırasında sürekli video kayıtları yapmayı mümkün kılar14,20. Tipik bir tahlil sırasında, heterozigot mutant fareler, seslendirme ve / veya baş sallama (Racine skoru 2) ile ısıya bağlı nöbetler gösterir ve vücut ısısı yaklaşık 42 ° C'ye ulaştığında hızla ön ayak klonusuna geçer, yan düşme, atlama, arka bacak uzatma ve / veya genelleştirilmiş tonik / klonik nöbetler (Racine skorları 3-5). Maksimum Racine skoru, mutant fareler arasında en şiddetli ısıya bağlı nöbet davranışını temsil eder. 129X1 zenginleştirilmiş arka planda (n = 15) heterozigot mutant farelerin maksimum Racine skoru, B6N (n = 9) genetik arka plandaki heterozigot mutant farelerden farklı değildir (Şekil 2F; Mann-Whitney testi, p > 0.9999). Bu, K1270T GEFS + mutant farelerde ısıya bağlı nöbet davranış özelliklerinin gerinim arka planından bağımsız olduğunu göstermektedir.
Birlikte ele alındığında, veriler tüm mutant farelerin benzer sıklıkta, nöbet eşik sıcaklığında ve davranışsal nöbet şiddetinde ısıya bağlı nöbetleri gerginlikten bağımsız bir şekilde sergilediğini göstermektedir. Vahşi tip çöp arkadaşlarının çoğu, 44 ° C'de veya altında bu tür nöbetler göstermez. Nöbete duyarlı bir B6N arka planındaki vahşi tip kontrol farelerinin yaklaşık üçte biri, ısıya bağlı nöbetler gösterdi (muhtemelen genetik arka plan etkileri nedeniyle), ancak nöbet eşiği sıcaklığı, aynı arka plandaki mutant farelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. Bu sonuçlar, B6N genetik arka planındaki mutant farelerin, barındırdıkları SCN1A GEFS + mutasyonu nedeniyle daha düşük sıcaklık eşiklerinde ısıya bağlı nöbetlere duyarlı olduklarını göstermektedir. Böylece, bu protokolü kullanarak, epilepsi mutant farelerde ısıya bağlı nöbetleri değerlendirebilir ve ısıya bağlı nöbetlere maruz kalmayan veya önemli ölçüde daha yüksek sıcaklıklarda ısı nöbetleri gösteren vahşi tip çöp arkadaşı farelerden ayırt edilebilir.
Şekil 2: Mutant fareler ısıya bağlı nöbetler sergiler. (A) Farelerde ısıya bağlı nöbetlerin davranışsal olarak taranması için ısıtma protokolü. (B-C) Sırasıyla 129X1 ve B6N olmak üzere iki genetik arka planda vahşi tip (Scn1a+/+ - siyah üçgenler) ve heterozigot mutant (Scn1aKT/+ - turuncu daireler) farelerde farelerin zaman içindeki ortalama vücut ısısı. (D) Her iki genetik arka planda ısıya bağlı nöbetler gösteren farelerin yüzdesi. Vahşi tip (Scn1a +/+) ve heterozigot (Scn1aKT / +) fareler sırasıyla siyah ve turuncu çubuklarla temsil edilir. 129X1 ve B6N arka planlarındaki heterozigot mutantlar sırasıyla turuncu katı çubuklarda ve siyah çizgili turuncu çubuklarda gösterilir. (E) Her iki suşta vahşi tip (Scn1a +/+) ve heterozigot mutant (Scn1aKT / +) farelerde ısıya bağlı nöbetlere nöbet sıcaklık eşiği. (F) Her iki genetik arka planda heterozigot (Scn1aKT / +) fareler tarafından sergilenen ısıya bağlı nöbetlerin maksimum Racine skorlarının saçılma dağılımı. Her nokta, tek bir farede maksimum Racine puanını temsil eder. Her genotipteki hayvan sayısı parantez içinde gösterilmiştir. B-F panellerinde gösterilen veriler ortalama ± S.E.M. Bu rakam, Das ve ark., 2021, eNeuro14'teki Şekil 3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
İnsan hastalarda ateşli nöbetlerin davranışsal eşdeğeri olan farelerde ısıya bağlı nöbetlerin oluşumunu taramak için basit ve etkili bir protokol tanımlamaktayız. Tahlil, kontrol ve test fare gruplarının vücut ısısındaki artışlara duyarlılığını karşılaştırmak için nöbet gösteren farelerin yüzdesi, nöbet eşiği, Racine ölçeğinde nöbetlerin şiddeti dahil olmak üzere çeşitli parametreleri değerlendirir.
Bu protokoldeki kritik bir adım, farenin vücut sıcaklığını sürekli izlerken odadaki ısıyı arttırmayı içerir. Farelerin bu tahlillerde yaşayacakları maksimum vücut sıcaklığının 44 ° C olması zorunludur, çünkü vahşi tip hayvanlar vücut sıcaklıklarında >44 ° C'de ısıya bağlı nöbetlere maruz kalabilirler. Genel anestezi veya analjeziklerle yapılan ön tedavi, hayvanların çekirdek vücut sıcaklığını azaltabilir veya termoregülasyona müdahale edebilir, bu da nöbet eşiği sıcaklık verilerinin toplanmasını karıştırır. Bu nedenle, bu tarama protokolü altındaki farelere, 30 dakikalık deneme süresi boyunca bu ajanlar sağlanamamıştır. Tüm prosedürler kurumun IACUC komitesi tarafından onaylanmalıdır. Tahlil sırasında farenin çekirdek vücut sıcaklığının sürekli izlenmesini sağlamak için, rektal sıcaklık probunu farelerin kuyruğuna güvenli bir şekilde bantlayın. Tahlil sırasında, fare odasının sıcaklığını arttırdıktan sonra bile fare vücut sıcaklığının uzun süre değişmeden kaldığı tespit edilirse, rektal sıcaklık probunun fareden çıkmadığından veya kuyruğa gevşek bir şekilde tutturulmadığından emin olun.
Fare modellerinin genetik arka planı, SCN1A mutasyonuna ve farmakolojik olarak indüklenen nöbetlere duyarlılığı etkileyebilir18,25,26,27. Yukarıdaki sonuçlarda tartışıldığı gibi, farelerin genetik arka planı, ısıya bağlı nöbetlere karşı duyarlılıklarını etkileyebilir. Scn1a K1270T GEFS + mutant fareler iki genetik arka planda test edildi - 129X1 ve B6NJ ve nöbete duyarlı B6NJ arka planındaki vahşi tip farelerin küçük bir yüzdesinin (% 33) de ısıya bağlı nöbetlere maruz kaldığı gözlendi. Bununla birlikte, heterozigot mutant Scn1aKT / + farelere kıyasla, B6NJ vahşi tip fareler, önemli ölçüde daha yüksek bir sıcaklık eşiğinde ısıya bağlı nöbetler yaşadı. Bu, CRISPR knock-in tarafından tanıtılan genetik mutasyonun (Scn1a K1270T), mutant fareleri hipertermiye bağlı nöbetlere karşı daha duyarlı hale getirdiğini doğrulamaktadır.
Bu protokolü benimsemenin aşağıda özetlenen birkaç avantajı vardır. İlk olarak, kuru hava akımının veya ısıtılmış lambaların kullanılmasından farklı olarak, kapalı bir alana yerleştirilmiş sıcaklık kontrollü bir cebri hava, deneyciye test arenasını istenen bir oranda ısıtmak üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Isıtma protokolündeki adımlar, sıçanlar gibi daha ağır veya daha büyük kemirgenler olan yaşlı fareleri taramak için başlangıç sıcaklığını, her adımın süresini vb. Artırmak / azaltmak için kolayca değiştirilebilir. İkincisi, ekli rektal prob aracılığıyla fare vücut sıcaklığının sürekli izlenmesi, tahlil boyunca bireysel faredeki vücut ısısı değişim oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bu, deneycinin, bu protokolü diğer test alanlarına uyarlarken, faredeki sıcaklık değişim hızının 0.25-0.5 ° C / dak'yı (hayvanlar için stresli olabilir) geçmediğini yakından gözlemlemesini sağlar. Önemli olarak, farklı fare gruplarında zaman içinde vücut ısısının değişim hızı, termoregülasyon yeteneklerine ışık tutabilir ve mutasyonlara neden olan ateşli nöbetlerin farelerde termoregülasyonu da değiştirip değiştirmediğini anlamak için yardımcı olabilir. Üçüncüsü, sürekli vücut ısısı izleme, bu protokolü kullanan nöbet eşiği sıcaklık ölçümlerinin doğru olmasını sağlar, çünkü bunlar fare tarafından yaşanan ilk nöbet nöbeti ile eşzamanlı olarak kaydedilir. Hayvanın vücut ısısı sürekli olarak izlenmiyorsa veya hayvanı test alanından çıkardıktan sonra nöbet eşiği sıcaklığı ölçülürse, nöbet sonrası fareleri ele almak için geçen süreye bağlı olarak nöbet eşiği değerleri değişebilir. Son olarak, bu yöntem, insan hastalarda ateşli nöbetleri taklit etmek için farelerde ateşi (patojenleri enjekte ederek) indüklemek için invaziv yöntemler kullanma ihtiyacını ortadan kaldırır.
Bu protokolün sınırlamalarından biri, genç (yaşları P30'dan az) fareleri ısıya bağlı nöbetler için taramanın zor olmasıdır. Protokol, yetişkin farelerin (P30-P40 ve üstü) ısıya veya hipertermiye bağlı nöbetlere duyarlılığını taramak için geliştirilmiştir. Deneyimlerimize göre, genç vahşi tip farelerin, özellikle 15 g'ın altında olanların, az gelişmiş termoregülasyon mekanizmaları, fizyolojik termal stres veya her ikisinin bir kombinasyonundan kaynaklanabilecek ısıya bağlı nöbetlere maruz kalma olasılığı daha yüksektir. Bu nedenle, bu protokolü kullanarak genç farelerde ısıya bağlı nöbet ekranını gerçekleştirmek ideal değildir.
Fareyi ısıya bağlı nöbetlere maruz bırakırken EEG izlemeyi birleştiren gelecekteki çalışmalar, önceki bir çalışmaya benzer şekilde, ısıya bağlı nöbetlerin EEG nöbet paternlerine ışık tutabilir19. Fare beynindeki belirli bölgelerdeki nöronal aktivite, beyin dokusunun toplanmasından sonra optogenetik yaklaşımlar ve immünohistokimya temelli çalışmaların birleştirilmesiyle izlenebilir. Ayrıca, keto diyeti gibi kısıtlayıcı diyetlerin ateşli nöbetleri azaltmadaki etkileri, keto ile beslenen farelerin ve normal chow-fed farelerin ısıya bağlı nöbet protokolüne tabi tutulmasıyla değerlendirilebilir. Benzer şekilde, epilepsi ilaç tarama paradigmaları, araçla beslenen veya kontrol edilen farelere kıyasla, ilaçla beslenen veya tedavi edilen farelerde ısıya bağlı nöbetleri iyileştiren veya baskılayan aday anti-epileptik ilaçları test etmek ve tanımlamak için geliştirilebilir.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Connor J. Smith'e özelleştirilmiş fare ısı odasının oluşturulmasındaki yardımı için teşekkür ederiz. O'Dowd laboratuvar üyeleri Lisha Zeng ve Andrew Salgado'nun tahlil geliştirmenin ilk aşamalarında ısıtma protokolünü standartlaştırma konusundaki yardımlarına teşekkür ederiz. Ayrıca Danny Benavides ve Kumar Perinbam'a el yazması için deneysel prosedürün bazı bölümlerini video kaydettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, D.O.D.'ye verilen NIH hibesi (NS083009) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
