Summary
Het doel van de methode is om te screenen op hyperthermie of door hitte geïnduceerde aanvallen in muismodellen. Het protocol beschrijft het gebruik van een op maat gemaakte kamer met continue monitoring van de lichaamstemperatuur om te bepalen of verhoogde lichaamstemperatuur leidt tot epileptische aanvallen.
Abstract
Transgene muismodellen hebben bewezen krachtige hulpmiddelen te zijn bij het bestuderen van verschillende aspecten van menselijke neurologische aandoeningen, waaronder epilepsie. De SCN1A-geassocieerde genetische epilepsieën omvatten een breed spectrum van epileptische aandoeningen met onvolledige penetrantie en klinische variabiliteit. SCN1A-mutaties kunnen resulteren in een grote verscheidenheid aan aanvalsfenotype, variërend van eenvoudige, zelfbeperkte koorts-geassocieerde koorts-geassocieerde koortsaanvallen (FS), matige genetische epilepsie met koortsstuitvallen plus (GEFS +) tot ernstiger Dravet-syndroom (DS). Hoewel FS vaak wordt gezien bij kinderen jonger dan 6-7 jaar die geen genetische epilepsie hebben, blijft FS bij GEFS + -patiënten voorkomen tot in de volwassenheid. Traditioneel zijn experimentele FS geïnduceerd bij muizen door het dier bloot te stellen aan een stroom droge lucht of verwarmingslampen, en de snelheid van verandering in lichaamstemperatuur wordt vaak niet goed gecontroleerd. Hier beschrijven we een op maat gemaakte verwarmingskamer, met een plexiglas front, die is uitgerust met een digitale temperatuurregelaar en een met verwarming uitgeruste elektrische ventilator, die verwarmde geforceerde lucht op een temperatuurgecontroleerde manier de testarena in kan sturen. De lichaamstemperatuur van een muis die in de kamer wordt geplaatst, bewaakt door een rectale sonde, kan op een reproduceerbare manier worden verhoogd tot 40-42 ° C door de temperatuur in de kamer te verhogen. Continue visuele monitoring van de dieren tijdens de verwarmingsperiode toont inductie van door warmte geïnduceerde aanvallen bij muizen die een FS-mutatie dragen bij een lichaamstemperatuur die geen gedragsaanvallen bij wilde nestgenoten uitlokt. Dieren kunnen eenvoudig uit de kamer worden verwijderd en op een koelkussen worden geplaatst om de lichaamstemperatuur snel weer normaal te maken. Deze methode voorziet in een eenvoudig, snel en reproduceerbaar screeningsprotocol voor het optreden van door hitte geïnduceerde aanvallen in epilepsiemuismodellen.
Introduction
Epilepsie, de vierde meest voorkomende familie van neurologische aandoeningen in de Verenigde Staten1, wordt gekenmerkt door een onbalans van exciterende en remmende drive in het CZS die leidt tot terugkerende aanvallen. Koortsstuipen (FS) of koortsgerelateerde aanvallen kunnen voorkomen in de algemene bevolking, meestal bij kinderen vanaf 3 maanden tot 6 -7 jaar oud. Bij sommige personen met genetische mutaties, meestal in een natriumkanaalgen, kan FS echter langer dan 7 jaar tot in de volwassenheid blijven bestaan. Deze aandoening wordt aangeduid als koortsstuipen plus of FS +. Snelle vooruitgang in genoomsequencing heeft meer dan 1.300 mutaties in het menselijke natriumionkanaalgen SCN1A geïdentificeerd, waardoor het een hotspot is voor epilepsiemutaties. SCN1A-mutaties zijn in verband gebracht met een breed spectrum van epileptische aandoeningen, waaronder koortsstuipen (FS), genetische epilepsie met koortsstuipen plus (GEFS +) en Dravet-syndroom (DS) 2,3,4,5,6. Ongeveer 20% van de SCN1A missense mutaties leidt tot GEFS+5,7,8. Pediatrische geschiedenis van complexe of langdurige FS in de kindertijd kan zich vervolgens ontwikkelen tot meer slopende vormen van epilepsie zoals temporale kwab epilepsie (TLE)9,10,11. Dravetsyndroom ontstaat als gevolg van truncation-mutaties of functieverliesmutaties in SCN1A en is een ernstige vorm van hardnekkige epilepsie, met het begin van koortsstuipen in de kindertijd die zich ontwikkelen tot refractaire aanvallen, en wordt vaak geassocieerd met cognitieve, ontwikkelings- en motorische stoornissen2,5,12 . Aangezien veel mensen met GEFS + en / of DS koortsstuipen vertonen, wordt het noodzakelijk om nieuwe therapieën te ontwikkelen om deze epileptische aandoeningen beter te bestrijden.
Diermodellen van SCN1A-geassocieerde epilepsie zijn van onschatbare waarde gebleken bij het karakteriseren van verschillende soorten aanvallen (koorts versus gegeneraliseerd) en het ontleden van het neuronale mechanisme van het genereren van aanvallen13,14,15,16,17,18. Hoewel de studie van spontane aanvallen via EEG /EMG-opnames in knaagdierhersenen goed is ingeburgerd en een zeer nuttig hulpmiddel is, hebben slechts enkele studies geprobeerd koortsstuipen na te bootsen in muismodellen14,16,19,20,21,22,23 . Eerdere studies hebben een straal verwarmde droge lucht gebruikt, of een methacrylaatcilinder uitgerust met een thermisch systeem, of warmtelampen met een temperatuurregelaar in afgesloten testarena's9,16,21,22,23,24 om aanvallen via hyperthermie te induceren. Om de lichaamstemperatuur in een meer gecontroleerde omgeving te verhogen, maakt het hier beschreven protocol gebruik van een op maat gemaakte kamer met een temperatuurgeregeld verwarmingssysteem dat reproduceerbare snelheden van toename van de lichaamstemperatuur van een muis in de kamer mogelijk maakt. De warmtekamer was opgebouwd uit hout (lengte 40 cm x breedte 34 cm x hoogte 31 cm) en was voorzien van een digitale temperatuurregelaar met een K thermokoppel. Een kleine axiale ventilator uitgerust met een verwarming op het achterpaneel van de kamer leidt verwarmde lucht in de kamer, geregeld door een digitale temperatuurregelaar. Dit geforceerde luchtverwarmingssysteem stelt u in staat om de snelheid waarmee de kamertemperatuur stijgt te regelen. (Figuur 1A,B). Het K-thermokoppel in de houten warmtekamer stuurt feedback naar de digitale temperatuurregelaar om tijdens de test constante temperaturen in de doos te handhaven. Door de temperatuur op de digitale temperatuurregelaar in te stellen, kan de elektrische ventilator verwarmde geforceerde lucht door ventilatieopeningen sturen om de kamer gelijkmatig te verwarmen (figuur 1A). Het voorpaneel van de warmtekamer is een helder plexiglas blad om eenvoudige video-opname van de proeven mogelijk te maken.
Volwassen (P30-P40) muizen, heterozygoot voor een missense mutatie in SCN1A die ervoor zorgt dat GEFS + en een gelijk aantal wild-type nestgenoten als controlegroep dienen, werden voor elk experiment geselecteerd. Dieren, zowel mannelijk als vrouwelijk, die in deze studies werden gebruikt, wogen ten minste 15 g omdat wilde muizen die minder wogen gevoeliger waren voor door hitte geïnduceerde aanvallen dan zwaardere dieren van dezelfde leeftijd. In de pilotstudie werden zowel mutante als wild-type muizen waargenomen om de koelere hoeken van de kamer aan de achterkant op te zoeken en daar gedurende langere tijd te blijven. Om dit te omzeilen, werd de effectieve vloergrootte in de testarena van de warmtekamer teruggebracht tot een lengte van 16,5 cm x breedte 21,5 cm x hoogte 27,5 cm door een houten blok B (afmetingen 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) aan de rechterkant van de kamer te plaatsen (figuur 1A). De warmtekamer is opgebouwd uit 1,9 cm dik multiplex (lengte 40 cm x breedte 34 cm x hoogte 31 cm) bedekt met wit laminaat en voorzien van een digitale temperatuurregelaar met een K thermokoppel. Het laminaatoppervlak van de kamerwanden is ondoordringbaar en kan gemakkelijk tussen de proeven door worden ontsmet door af te vegen met 70% ethanol. De temperatuur van de warmtekamer werd aanvankelijk ingesteld op 50 °C en voorverwarmd gedurende ten minste 1 uur voor het begin van het experiment, om een uniforme verwarming in de kamer te garanderen. Elke muis was uitgerust met een rectale thermometer voor continue monitoring van de lichaamstemperatuur tijdens het experiment. Een enkele muis werd tegelijk in de kamer geplaatst en de temperatuur werd tussen de 1e en 10e minuut op 50 °C gehouden. De temperatuur werd vervolgens verhoogd tot 55 °C voor de 11e-20e minuut en uiteindelijk verhoogd tot 60 °C voor de 21e-30e minuut. Dit resulteerde in een reproduceerbare snelheid van toename van de lichaamstemperatuur van de muis (figuur 2A). Elke proef werd op video opgenomen en gedragsanalyse werd offline uitgevoerd.
Het verwarmingsprotocol kan eenvoudig worden gewijzigd om de begintemperatuur van de warmtekamer en de snelheid waarmee de kamer wordt verwarmd te wijzigen, wat op zijn beurt verandert hoe snel de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de test wordt verhoogd. Deze methode biedt dus meer flexibiliteit ten opzichte van traditionele methoden bij het opzetten van de gedragsschermen met door hitte geïnduceerde aanvallen. Het hitte-geïnduceerde aanvalsprotocol kan ook worden gebruikt om te screenen op anti-epileptica die mutante muizen beter bestand maken tegen door hitte geïnduceerde aanvallen of de drempeltemperatuur verhogen waarbij aanvallen worden waargenomen. Evenzo kunnen gunstige effecten van beperkende dieetregimes zoals keto-dieet op door hitte geïnduceerde aanvallen worden onderzocht bij normale chow-gevoede versus keto-gevoede muizen.
Figuur 1: Beschrijving van de op maat gemaakte muiswarmtekamer. (A) Het voorpaneel van de houten muiswarmtekamer toont het zijbedieningspaneel met de Power ON/OFF-schakelaar die de digitale temperatuurregelaar, K-thermokoppel, de AAN/UIT-schakelaar van de ventilatorverwarming en de warmte-indicator inschakelt. De buitenafmetingen van de doos en de binnenste testarena worden weergegeven in cm. Een houten blok B dat wordt gebruikt om het oppervlak van de testarena effectief te verminderen, wordt ook getoond. De bodem van de testarena is bedekt met cob bedding om te voorkomen dat muizen direct in contact komen met verwarmde houten oppervlakken. (B) Het achterpaneel van de warmtekamer toont de ventilator die op de bovenste ventilatieopening is gemonteerd en het netsnoer om elektriciteit naar de kamer te leveren. Dit cijfer is aangepast van figuur 3 in Das et al., 2021, eNeuro14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Universiteit van Californië, Irvine.
1. Voorbereiding op de warmte-geïnduceerde aanvalstest
- Schakel de aan/uit-knop op de warmtekamer in, gevolgd door de knop Warmte aan .
- Stel de temperatuur van de warmtekamer in op 50 °C met behulp van het toetsenbord op de digitale temperatuurregelaar.
- Wacht minimaal 1 uur om de kamer voor te verwarmen op 50 °C voordat u de eerste muis in de kamer brengt. Voorverwarmen zorgt voor een gelijkmatige verwarming in de kamer.
- Bekleed de vloer van de warmtekamer van de muis met kolfbedden.
- Monteer een video-opnamecamera voor de warmtekamer voor het opnemen van elke door hitte geïnduceerde aanvalstestproef.
- Bekleed een petrischaaltje met een diameter van 140 mm met dikke lagen tissuepapier en plaats het op ijs om als koelkussen te dienen.
OPMERKING: Aan het einde van de test wordt de individuele muis overgebracht op het vooraf geprechilleerde koelkussen om hun verhoogde lichaamstemperatuur te verlagen.
2. De muis voorbereiden op een door hitte geïnduceerde epileptische aanvalstest
- Selecteer 10 volwassen muizen (P30-P40), 5 die de epilepsie veroorzakende mutatie dragen en 5 van de wild-type nestgenoten voor hitte-geïnduceerde aanval screeningstest.
OPMERKING: Wild-type muizen, die geen epilepsie veroorzakende mutatie herbergen, vertonen geen door hitte geïnduceerde aanvallen bij temperaturen onder 44 ° C en dienen als de controlegroep. - Weeg elke muis die voor de screeningstest moet worden gebruikt en noteer het lichaamsgewicht. Alleen muizen met een gewicht van 15 g of meer mogen voor de test worden gebruikt.
- Scherm één muis tegelijk in de warmtekamer van de muis.
- Verdoof de muis kort gedurende 10-15 s met behulp van een paar druppels isofluraan op de bodem van een stolp.
- Haal het dier uit de stolp en leg het op een papieren handdoek.
- Zorg ervoor dat de muis volledig is verdoofd door te controleren of de muis niet reageert op een schadelijke teenknelpunt.
- Bestrijk de metalen punt van de rectale temperatuurvoeler met een smeermiddel (zoals vaseline) en steek deze voorzichtig in de muis op een diepte van minder dan of gelijk aan 2 cm.
- Bevestig de rectale sonde met tape aan de staart van de muis, zodat de sonde er tijdens de test niet uitkomt.
OPMERKING: U kunt het dier ook in een muisreparatiefronus plaatsen en de rectale temperatuursonde plaatsen. Zet het vast door aan de staart te plakken. - Zorg ervoor dat de rectale sonde is aangesloten op een multimeter die de interne lichaamstemperatuur van de muis weergeeft.
- Plaats het dier in een verse kooi bekleed met kolfstrooisel, d.w.z. de herstelkooi.
- Start een timer en wacht 5 minuten. Observeer de muis totdat deze volledig is hersteld van anesthesie en de muis actief en verzorgend is.
- Controleer tegelijkertijd de kerntemperatuur van de muis totdat deze stabiliseert bij 35-36 °C.
- Noteer aan het einde van 5 minuten de lichaamstemperatuur van de muis. Dit is de initiële lichaamstemperatuur op tijdstip "0" min.
OPMERKING: Als de kerntemperatuur van de muis lager is dan 35 °C, wacht dan op extra tijd voordat het dier herstelt van door anesthesie veroorzaakte onderkoeling. - Breng de individuele muis snel over naar de voorverwarmde muiskamer. Dit markeert de START van de experimentele proef. Er wordt slechts één muis tegelijk gescreend.
3. Warmte-geïnduceerde aanvalstest
- Nadat u de muis voorzichtig op de vloer van de voorverwarmde warmtekamer van de muis hebt geplaatst, sluit u de deur van plexiglas en start u de camera voor video-opname van het experiment.
- Start de stopwatch. Registreer de lichaamstemperatuur van de muis van de rectale thermometer met intervallen van 1 minuut voor de duur van het experiment.
- Verhoog met regelmatige tussenpozen de temperatuur van de warmtekamer van de muis zodanig dat de lichaamstemperatuur van de muis toeneemt met een snelheid van 0,25-0,5 °C / min.
OPMERKING: Snelle verhogingen van de lichaamstemperatuur kunnen leiden tot een hitteberoerte of de dood en moeten worden vermeden. - Volgens dit protocol verhoogt u de temperatuur van de warmtekamer van de muis elke 10 minuten met 5 °C, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Stel na 9,5 min de temperatuur van de warmtekamer in op 55 °C, om de temperatuur van de warmtekamer te stabiliseren tot 55 °C door de 10e minuut zoals weergegeven op het digitale temperatuurdisplay.
- Verhoog op dezelfde manier de temperatuur tot 60 °C bij 19,5 min om de temperatuur van de warmtekamer te stabiliseren tot 60 °C in de 20e minuut. Elke screeningsproef voor aanvallen duurt 30 minuten.
- Als de muis een aanval heeft (vocaliseert, knikt het hoofd, voorpoot clonus, achterpotenverlenging, op zijn zij valt of gegeneraliseerde tonische / clonische convulsies ervaart), noteer dan de volgende informatie.
- Registreer de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de aanval (aanvalsdrempeltemperatuur) van de rectale temperatuurthermometer.
- Noteer de kenmerken van het aanvalsgedrag, zoals hoofdknikken, voorpoot clonus, extensie van de achterpoten, opzij vallen en / of gegeneraliseerde tonische / clonische aanvallen (GTCS) die door de muis worden weergegeven.
- Pak de muis snel maar voorzichtig uit de kamer en plaats deze op het koelkussen dat in stap 1.6 is voorbereid.
OPMERKING: Als een muis Racine schaal 5 aanvallen ervaart en ongecontroleerde sprongen vertoont, kan het moeilijk zijn om het dier uit de warmtekamer op te pakken en over te brengen naar het koelkussen buiten. Een typische door hitte geïnduceerde aanval duurt echter tussen 30 s en 60 s.Daarom moet de muis uit de warmtekamer worden gehaald en binnen 60 s na het begin van de door hitte geïnduceerde aanvalsepisode op het koelkussen worden geplaatst. - Wacht tot de lichaamstemperatuur van de muis is gedaald tot 36-37 °C, voordat u deze overbrengt naar een herstelkooi. Slechts één muis wordt tegelijkertijd in een herstelkooi geplaatst.
OPMERKING: Meng muizen die nog moeten worden gebruikt voor warmte-geïnduceerde screening niet met de muis die al het warmte-geïnduceerde epileptische aanvalsexperiment heeft ervaren. - Knip voorzichtig en voorzichtig de tape tussen de muizenstaart en de rectale sondedraad met een schaar om de rectale sonde van de muis te verwijderen.
- Veeg de metalen punt van de rectale sonde schoon met 70% alcohol en doekjes van zacht weefsel om deze klaar te houden voor de volgende proef.
- Blijf de muis in de herstelkooi observeren totdat deze de normale activiteit hervat (lopen, verzorgen, enz.), Voordat u de muis terugbrengt naar zijn thuiskooi. Dit markeert het EINDE van de experimentele proef voor deze muis.
- Noteer de dierstatus na de test - levend en hersteld van de testsessie of dood. Aanvallen met hoge intensiteit waarbij ongecontroleerde sprongen en gegeneraliseerde tonische / clonische aanvallen soms kunnen leiden tot de dood van de muis.
- Als een muis binnen de observatieperiode van 30 minuten geen door hitte veroorzaakte aanvallen ervaart of als de lichaamstemperatuur van de muis 44 °C bereikt, verwijdert u de muis uit de warmtekamer en plaatst u deze op het koelkussen totdat de lichaamstemperatuur van de muis terugkeert naar 36-37 °C.
- Stel de temperatuur van de warmtekamer van de muis in op 50 °C en laat deze in evenwicht brengen totdat de weergavetemperatuur op de digitale temperatuurregelaar 50 °C aangeeft.
- Wissel cob bedding tussen individuele muis proeven.
- Bereid de volgende muis voor op screeningsonderzoek zoals beschreven in sectie 2 en herhaal de stappen uit sectie 3.
4. Euthanaseren van de dieren
- Hoewel de meeste dieren herstellen na door hitte geïnduceerde aanvallen, ondergaan in onze ervaring een paar van de muizen SUDEP (Sudden Unexplained Death in EPilepsy) in hun thuiskooi binnen 24-48 uur na hitte-geïnduceerde aanvallen. Na het afronden van de screening op alle muizen individueel voor warmte-geïnduceerde aanvallen na de 30 minuten durende studie, euthanaseer alle muizen volgens de IACUC-richtlijnen van de instelling.
5. Analyse van de warmte-geïnduceerde aanvalsgegevens
- Na het voltooien van de screening van een cohort dieren, berekent u het percentage muizen in een bepaald genotype dat aanvallen vertoont met behulp van de volgende formule:
- Schat de gemiddelde aanvalsdrempeltemperatuur van muizen binnen een bepaald genotype door het gemiddelde te nemen van de aanvalsdrempeltemperatuur van alle muizen (genoteerd in stap 3.7) in dat genotype die door hitte geïnduceerde aanvallen vertonen.
- Terwijl u nog steeds blind bent voor de identiteit en het genotype, speelt u de video-opnamen van elk van de muizen af tijdens de door hitte geïnduceerde aanvalstestscreening op een computerscherm om de ernst van de aanvallen te scoren.
- Geef scores aan individuele muizen die door hitte geïnduceerd aanvalsgedrag vertonen met behulp van de gemodificeerde Racine-schaal13 zoals beschreven in eerdere studies13,14. Zie tabel 1 voor nadere bijzonderheden.
- Als een muis, terwijl hij door hitte veroorzaakte aanvallen ervaart, alleen hoofdknikken vertoont, geef hem dan een score van 2. Als een muis een aanvalsepisode begint met knikkend hoofd, maar ook voorpoot clonus vertoont, omvallen en / of springen, geef hem dan een score van 5.
- Noteer de maximale score voor elke muis met behulp van de aangepaste Racine-schaal13 zoals hierboven beschreven.
- Plot een spreidingsgrafiek van maximale Racine-scores die door alle muizen in een bepaald genotype worden vertoond.
- Vergelijk statistisch maximale Racine-scores tussen verschillende muisgroepen als een methode om de ernst van gedragsaanvallen zoals door hitte geïnduceerde aanvallen te bepalen.
OPMERKING: Racine-scores zijn nuttig om de kenmerken van aanvallen tussen verschillende mutante muizengroepen of genotypen te vergelijken. Verwacht wordt dat de wild-type muizen geen hitte-geïnduceerde aanvallen zouden ondergaan en niet in aanmerking zouden hoeven te komen voor Racine-scorevergelijkingen. - Voer op basis van experimenteel ontwerp een geschikte statistische analyse uit om te bepalen of het percentage muizen dat aanvallen vertoont tussen wild-type en mutante muizen, en hun gemiddelde drempelwaarden voor aanvallen significant van elkaar verschillen.
| Racine Score | Kenmerken van de aanval | ||
| 0 | Geen aanvallen | ||
| 1 | Mond- en gezichtsbewegingen | ||
| 2 | Hoofd knikken | ||
| 3 | Voorpoot clonus, meestal één ledemaat | ||
| 4 | Voorpoot clonus met opfok | ||
| 5 | Gegeneraliseerde tonisch-clonische aanval, opfokken, springen, omvallen | ||
Tabel 1: Racine scores.
Representative Results
Diermodellen met mutaties in koortsachtige aanvallen zullen naar verwachting warmte-geïnduceerde aanvallen ondergaan bij verhoogde lichaamstemperaturen die geen aanvallen veroorzaken bij de wild-type nestgenoten. SCN1A-mutaties zijn in verband gebracht met koortsstuipen, waaronder K1270T GEFS+ patiënten, die zowel koortsachtige als koortsige gegeneraliseerde aanvallen vertonen7. We screenden CRISPR gegenereerde SCN1A K1270T GEFS + mutante muizen die onlangs in een studie14 zijn beschreven voor het optreden van hitte-aanvallen in twee genetische achtergronden - aanvalsresistente 129X1 / SvJ (129X1) en aanvalsgevoelige C57BL / NJ (B6N) achtergronden. Leeftijd gematchte wild-type nestgenoten in de warmtekamer van de muis die geen GEFS + mutaties bevatten en dus naar verwachting geen warmte-geïnduceerde aanvallen vertonen, dienden als de controlegroep. De snelheid van de verandering van de lichaamstemperatuur in de loop van de tijd werd geëvalueerd door de gemiddelde lichaamstemperatuur van muizen uit te zetten die elke minuut tijdens de test werd geregistreerd. Er was geen verschil in de snelheid van verandering van lichaamstemperatuur tussen heterozygote mutante muizen en wild-type nestgenoten getest in respectievelijke 129X1 en B6N genetische achtergronden (figuur 2B, C). Dit suggereert dat thermoregulatie niet is veranderd in K1270T GEFS + heterozygote mutante muizen.
Alle heterozygote mutante muizen van 129X1 (n = 15) of B6N (n = 9) genetische achtergronden vertoonden warmte-geïnduceerde aanvallen (figuur 2D). Geen van de wild-type muizen in de 129X1 verrijkte achtergrond (n = 13) vertoonde warmte-geïnduceerde aanvallen (figuur 2D). Daarentegen vertoonde een derde van de geteste muizen (n = 3 van de 9 muizen) in de aanvalsgevoelige B6N-achtergrond hitte-geïnduceerde aanvallen. Statistische vergelijking toont aan dat het percentage heterozygote mutante muizen met warmte-geïnduceerde aanvallen significant hoger was dan hun respectieve wild-type tegenhanger muizen in zowel de 129X1 als B6N genetische achtergronden (Figuur 2D, Fisher's exacte test, 129X1 p < 0,0001; B6NJ p = 0,009). De gemiddelde aanvalsdrempeltemperatuur tussen de heterozygote mutante muizen in 129X1 en B6N genetische achtergronden was vergelijkbaar. 129X1 mutante muizen hebben een gemiddelde aanvalsdrempeltemperatuur van 42,6 ± 0,20 °C, wat niet significant verschilde van de gemiddelde aanvalsdrempeltemperatuur van 42,7 ± 0,06 °C gezien bij B6N-muizen (Figuur 2E; tweezijdige ongepaarde Student's t-test, p = 0,782). Het is belangrijk op te merken dat de gemiddelde aanvalsdrempeltemperatuur van drie B6N-wildtype muizen die warmte-geïnduceerde aanvallen vertoonden 43,7 ± 0,08 °C was en significant hoger dan de gemiddelde aanvalsdrempel van 42,7 ± 0,06 °C weergegeven door B6N heterozygote mutante muizen (Figuur 2E, tweezijdige ongepaarde Student's t-test, p < 0,0001).
De plexiglas voorkant van de kamer maakt het mogelijk om tijdens de test continue video-opnames te maken die later kunnen worden gebruikt om te scoren voor de ernst van de aanvallen bij elke muis op een aangepaste Racine-schaal zoals eerder beschreven14,20. Tijdens een typische test vertoonden heterozygote mutante muizen warmte-geïnduceerde aanvallen met vocalisatie en / of hoofdknikken (Racine-score 2) en snel overgaan naar forelimb clonus, opzij vallen, springen, achterlimbextensie en / of gegeneraliseerde tonische / clonische aanvallen (Racine scoort 3-5) wanneer de lichaamstemperatuur ongeveer 42 ° C bereikte. De maximale Racine-score vertegenwoordigt het meest ernstige hitte-geïnduceerde aanvalsgedrag bij de gemuteerde muizen. De maximale Racine-score van heterozygote mutante muizen in 129X1 verrijkte achtergrond (n = 15) verschilt niet van heterozygote mutante muizen in B6N (n = 9) genetische achtergrond (figuur 2F; Mann-Whitney test, p > 0,9999). Dit suggereert dat warmte-geïnduceerde aanvalsgedragskenmerken in K1270T GEFS + mutante muizen onafhankelijk zijn van de stamachtergrond.
Alles bij elkaar tonen de gegevens aan dat alle gemuteerde muizen warmte-geïnduceerde aanvallen vertonen met een vergelijkbare frequentie, aanvalsdrempeltemperatuur en gedragsmatige ernst van aanvallen op een spanningsonafhankelijke manier. De meeste nestgenoten van het wilde type vertonen dergelijke aanvallen niet bij of onder 44 °C. Ongeveer een derde van de wild-type controlemuizen in een aanvalsgevoelige B6N-achtergrond vertoonde hitte-geïnduceerde aanvallen (mogelijk als gevolg van genetische achtergrondeffecten), maar de aanvalsdrempeltemperatuur was significant hoger in vergelijking met mutante muizen op dezelfde achtergrond. Deze resultaten suggereren dat gemuteerde muizen met een B6N genetische achtergrond gevoelig zijn voor door hitte geïnduceerde aanvallen bij lagere temperatuurdrempels als gevolg van de SCN1A GEFS + -mutatie die ze herbergen. Met behulp van dit protocol kan men dus warmte-geïnduceerde aanvallen bij epilepsiemutante muizen evalueren en onderscheid maken van wild-type nestgenootmuizen, die ofwel geen door hitte geïnduceerde aanvallen ondergaan of warmteaanvallen vertonen bij aanzienlijk hogere temperaturen.
Figuur 2: Mutante muizen vertonen hitte-geïnduceerde aanvallen. (A) Het verwarmingsprotocol voor gedragsscreening van door hitte geïnduceerde aanvallen bij muizen. (B-C) Gemiddelde lichaamstemperatuur van muizen in de loop van de tijd in wild-type (Scn1a +/+ - zwarte driehoeken) en heterozygote mutant (Scn1aKT / + - oranje cirkels) muizen in twee genetische achtergronden 129X1 en B6N, respectievelijk. (D) Percentage muizen met warmte-geïnduceerde aanvallen in beide genetische achtergronden. Wildtype (Scn1a+/+) en heterozygote (Scn1aKT/+) muizen worden vertegenwoordigd door respectievelijk zwarte en oranje balken. Heterozygote mutanten in 129X1 en B6N achtergronden worden weergegeven in respectievelijk oranje massieve balken en oranje balken met zwarte strepen. (E) Temperatuurdrempel voor aanvallen op warmte-geïnduceerde aanvallen bij wildtype (Scn1a+/+) en heterozygote mutant (Scn1aKT/+) muizen in beide stammen. (F) Spreidingsverdeling van maximale Racine-scores van door hitte geïnduceerde aanvallen vertoond door heterozygote (Scn1aKT/+) muizen in beide genetische achtergronden. Elke stip vertegenwoordigt de maximale Racine-score in een enkele muis. Het aantal dieren in elk genotype wordt tussen haakjes weergegeven. Gegevens die in panelen B-F worden getoond, zijn gemiddeld ± S.E.M. Dit cijfer is aangepast van figuur 3 in Das et al., 2021, eNeuro14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
We beschrijven een eenvoudig en effectief protocol om te screenen op het optreden van door hitte geïnduceerde aanvallen bij muizen, het gedragsequivalent van koortsstuipen bij menselijke patiënten. De test evalueert verschillende parameters - waaronder het percentage muizen dat aanvallen vertoont, de aanvalsdrempel, de ernst van aanvallen op een Racine-schaal, om de gevoeligheid van controle- en testmuisgroepen te vergelijken met verhogingen van de lichaamstemperatuur.
Een cruciale stap in dit protocol is het verhogen van de warmte in de kamer terwijl de lichaamstemperatuur van de muis continu wordt bewaakt. Het is absoluut noodzakelijk dat de maximale lichaamstemperatuur die de muizen in deze testen zullen ervaren 44 ° C is, omdat wilde dieren warmte-geïnduceerde aanvallen kunnen ondergaan bij lichaamstemperaturen >44 ° C. Voorbehandeling met algemene anesthesie of analgetica kan de kerntemperatuur van dieren verlagen of de thermoregulatie verstoren, wat op zijn beurt de gegevensverzameling van de aanvalsdrempeltemperatuur zou verstoren. Muizen onder dit screeningsprotocol konden dus niet van deze middelen worden voorzien tijdens het proefvenster van 30 minuten. Alle procedures moeten worden goedgekeurd door het IACUC-comité van de instelling. Om een continue monitoring van de kerntemperatuur van de muis tijdens de test te garanderen, plakt u de rectale temperatuursonde veilig vast aan de staart van de muizen. Als tijdens de test blijkt dat de lichaamstemperatuur van de muis gedurende langere tijd onveranderd blijft, zelfs na het verhogen van de temperatuur van de muiskamer, zorg er dan voor dat de rectale temperatuursonde niet uit de muis is gekomen of losjes aan de staart is bevestigd.
Genetische achtergrond van muismodellen kan de gevoeligheid voor de SCN1A-mutatie en farmacologisch geïnduceerde aanvallen beïnvloeden18,25,26,27. Zoals besproken in de bovenstaande resultaten, kan de genetische achtergrond van de muizen hun gevoeligheid voor hitte-geïnduceerde aanvallen beïnvloeden. Scn1a K1270T GEFS + mutante muizen werden getest in twee genetische achtergronden - 129X1 en B6NJ, en een klein percentage wild-type muizen (33%) in de aanvalsgevoelige B6NJ-achtergrond, werden ook waargenomen om hitte-geïnduceerde aanvallen te ondergaan. In vergelijking met de heterozygote mutant Scn1aKT/+ muizen ondervonden de B6NJ wild-type muizen echter warmte-geïnduceerde aanvallen bij een significant hogere temperatuurdrempel. Dit bevestigt dat de genetische mutatie (Scn1a K1270T) die werd geïntroduceerd door CRISPR knock-in de mutante muizen vatbaarder maakt voor door hyperthermie geïnduceerde aanvallen.
Er zijn verschillende voordelen van het aannemen van dit protocol, die hieronder worden samengevat. Ten eerste, in tegenstelling tot het gebruik van een stroom droge lucht of verwarmde lampen, biedt een temperatuurgecontroleerde geforceerde lucht die in een afgesloten ruimte is opgesteld, de experimentator meer controle over het opwarmen van de testarena met een gewenste snelheid. De stappen in het verwarmingsprotocol kunnen eenvoudig worden aangepast om de starttemperatuur, de duur van elke stap, enz. te verhogen / verlagen om oudere muizen te screenen die zwaardere of grotere knaagdieren zoals ratten zijn. Ten tweede geeft continue monitoring van de lichaamstemperatuur van de muis via de bijgevoegde rectale sonde waardevolle informatie over de snelheid van de verandering van de lichaamstemperatuur in individuele muizen, gedurende de hele test. Hierdoor kan de experimentator nauwlettend observeren dat de snelheid van temperatuurverandering in de muis niet hoger is dan 0,25-0,5 ° C / min (wat stressvol kan zijn voor de dieren), bij het aanpassen van dit protocol aan andere testarena's. Belangrijk is dat de snelheid van verandering van lichaamstemperatuur in de loop van de tijd in verschillende muizengroepen licht kan werpen op hun vermogen om te thermoreguleren en nuttig kan zijn om te begrijpen of koortsachtige aanvallen die mutaties veroorzaken ook de thermoregulatie bij muizen veranderen. Ten derde zorgt continue monitoring van de lichaamstemperatuur ervoor dat de temperatuurmetingen van de aanvalsdrempel met behulp van dit protocol nauwkeurig zijn, omdat ze gelijktijdig worden geregistreerd met de eerste aanval die door de muis wordt ervaren. Als de lichaamstemperatuur van het dier niet continu wordt gecontroleerd of de aanvalsdrempeltemperatuur wordt gemeten nadat het dier uit de testarena is gehaald, kunnen de drempelwaarden voor aanvallen variëren vanwege de tijd die nodig is om de muizen na aanvallen te behandelen. Ten slotte omzeilt deze methode de noodzaak om invasieve methoden te gebruiken om koorts te induceren (door pathogenen te injecteren) bij muizen om koortsstuipen bij menselijke patiënten na te bootsen.
Een van de beperkingen van dit protocol is dat het moeilijk is om juveniele (minder dan P30 in leeftijd) muizen te screenen op hitte-geïnduceerde aanvallen. Het protocol is ontwikkeld om te screenen op gevoeligheid van volwassen muizen (P30-P40 en hoger) voor door hitte of hyperthermie geïnduceerde aanvallen. In onze ervaring hebben de jongere wild-type muizen, vooral die met een gewicht van minder dan 15 g, meer kans om door hitte geïnduceerde aanvallen te ondergaan, wat te wijten kan zijn aan onderontwikkelde thermoregulatiemechanismen, fysiologische thermische stress of een combinatie van beide. Daarom is het niet ideaal om het hitte-geïnduceerde aanvalsscherm uit te voeren op juveniele muizen met behulp van dit protocol.
Toekomstige studies die EEG-monitoring combineren terwijl de muis wordt blootgesteld aan door hitte geïnduceerde aanvallen, kunnen licht werpen op EEG-aanvalspatronen van door hitte geïnduceerde aanvallen, vergelijkbaar met een eerdere studie19. Neuronale activiteit in specifieke gebieden in de hersenen van de muis kan worden getraceerd door optogenetische benaderingen en immunohistochemische studies te combineren na het oogsten van het hersenweefsel. Ook kunnen de effecten van beperkende diëten zoals keto-dieet op het verminderen van koortsstuipen worden geëvalueerd door keto-gevoede muizen en normale chow-gevoede muizen te onderwerpen aan een door hitte geïnduceerd aanvalsprotocol. Evenzo kunnen screeningsparadigma's voor epilepsiegeneesmiddelen worden ontwikkeld om kandidaat-anti-epileptica te testen en te identificeren die door hitte geïnduceerde aanvallen verbeteren of onderdrukken in gemedicaliseerde of behandelde muizen in vergelijking met voertuiggevoede of controlemuizen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
We willen Connor J. Smith bedanken voor zijn hulp bij het bouwen van de aangepaste muiswarmtekamer. We erkennen de hulp van O'Dowd-lableden, Lisha Zeng en Andrew Salgado voor het standaardiseren van het verwarmingsprotocol tijdens de vroege stadia van de testontwikkeling. We bedanken ook Danny Benavides en Kumar Perinbam voor het video-opnemen van delen van de experimentele procedure voor het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie (NS083009) toegekend aan D.O.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
| Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
| Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |
References
- Hirtz, D., et al. How common are the 'common' neurologic disorders. Neurology. 68, 326-337 (2007).
- Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).
- Mantegazza, M., Broccoli, V. SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models. Epilepsia. 60, (2019).
- Stafstrom, C. E. Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy. Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).
- Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).
- Wei, F., et al. Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy. Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).
- Abou-Khalil, B., et al. Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation. Neurology. 57, 2265-2272 (2001).
- Zhang, Y. -H., et al. Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum. Neurology. 89, 1210-1219 (2017).
- Patterson, K. P., et al. Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor. Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).
- Rossi, M. A. SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment. Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).
- Zhang, Y., et al. Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet. Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).
- Meng, H., et al. The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype. Human Mutation. 36, 573-580 (2015).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Das, A., et al. Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS. eNeuro. , (2021).
- Kalume, F., et al. Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome. Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).
- Martin, M. S., et al. Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities. Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).
- Rubinstein, M., et al. Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion. Brain. 138, 2219-2233 (2015).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).
- Dutton, S. B. B., et al. Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants. Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).
- Cheah, C. S., et al. Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).
- Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).
- Ricobaraza, A., et al. Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice. Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).
- Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S.
- Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome. Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).
- Mistry, A. M., et al. Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice. Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).
- Ogiwara, I., et al. Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation. Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).
