Summary
Protokollet beskriver bildandet av robusta och biokompatibla DNA-laddade mikrokapslar som multiplexerade in vitro-biosensorer som kan spåra flera ligander.
Abstract
Vi introducerar ett protokoll för beredning av DNA-laddade mikrokapslar av silkesfibroin via monteringsmetoden Layer-by-Layer (LbL) på offersfäriska kärnor. Efter adsorption av ett primlager och DNA-plasmider underlättades bildandet av robusta mikrokapslar genom att inducera β-ark i silkes sekundära struktur under akut uttorkning av ett enda silkeskikt. Därför skedde skiktningen via flera vätebindningar och hydrofoba interaktioner. Vid adsorption av flerskiktade skal kan kärnskalstrukturerna funktionaliseras ytterligare med guldnanopartiklar (AuNP) och/eller antikroppar (IgG) för användning för fjärranalys och/eller riktad leverans. Justering av flera nyckelparametrar under sekventiell deponering av viktiga makromolekyler på kiseldioxidkärnor såsom närvaron av en polymerprimer, koncentrationen av DNA och silkeprotein, samt ett antal adsorberade skikt resulterade i biokompatibla, DNA-laddade mikrokapslar med variabel permeabilitet och DNA-belastning. Vid upplösning av kiseldioxidkärnor visade protokollet bildandet av ihåliga och robusta mikrokapslar med DNA-plasmider immobiliserade till kapselmembranets inre yta. Genom att skapa ett selektivt permeabelt biokompatibelt membran mellan DNA-plasmiderna och den yttre miljön bevarades DNA under långvarig lagring och spelade en viktig roll i det förbättrade utgångssvaret från rumsligt begränsade plasmider. DNA-mallarnas aktivitet och tillgänglighet testades under in vitro-transkription och translationsreaktioner (cellfria system). DNA-plasmider som kodar för RNA-upplysta aptamerer och riboswitchar aktiverades framgångsrikt med motsvarande analyter, vilket visualiserades under lokalisering av fluorescerande märkta RNA-transkript eller GFPa1-protein i skalmembranen.
Introduction
Området syntetisk biologi erbjuder unika möjligheter att utveckla avkänningsförmåga genom att utnyttja naturliga mekanismer som utvecklats av mikroorganismer för att övervaka deras miljö och potentiella hot. Det är viktigt att dessa avkänningsmekanismer vanligtvis är kopplade till ett svar som skyddar dessa mikroorganismer från skadlig exponering, reglerar genuttryck för att mildra negativa effekter eller förhindra intag av giftiga material. Det har gjorts betydande ansträngningar för att konstruera dessa mikroorganismer för att skapa helcellssensorer som utnyttjar dessa naturliga svar men omdirigerar dem för att känna igen nya mål och / eller producera en mätbar signal som kan mätas för kvantifieringsändamål (vanligtvis fluorescens)1,2. För närvarande tyder oro över användningen av genetiskt modifierade mikroorganismer (GMO), särskilt vid utsläpp i miljön eller människokroppen, på grund av läckage av hela celler eller en del av deras genetiska material, även om de är inkapslade i en polymermatris, att alternativa sätt att utnyttja dessa avkänningsmetoder behövs3.
Ett kraftfullt tillvägagångssätt för att utnyttja fördelarna med mikroorganismerbaserad avkänning utan att behöva oroa sig för utplacering av GMO är användningen av in vitro-transkriptions-/translationssystem (IVTT). Ur ett praktiskt perspektiv består IVTT-system av en blandning som innehåller de flesta cellkomponenterna i ett aktivt tillstånd som har "extraherats" från celler på olika sätt, inklusive ultraljudsbehandling, pärlslag eller andra4. Slutprodukten av denna process är en biokemisk reaktionsblandning som redan är optimerad för att utföra transkription och translation som kan användas för att testa olika sensorer i ett "öppet kärl" -format, utan de begränsningar som är förknippade med användningen av hela celler (membrandiffusion, transformationseffektivitet, celltoxicitet etc.). Viktigt är att olika sensorkomponenter kan tillsättas kvantitativt och deras effekt studeras med olika optiska och spektrometriska tekniker, som vi har visat5. Det har noterats att IVTT-systemens prestanda kan vara inkonsekvent; Nya studier har dock visat tillvägagångssätt för att standardisera deras förberedelse och karakterisering, vilket är till stor hjälp när man studerar deras prestanda i sensordesign6. Nyligen har många exempel på IVTT-system som används för att skapa pappersbaserade analyser genom lyofilisering av deras komponenter i pappersmatriser visats, inklusive detektion av tungmetalljoner, droger, kvorumavkänningselement och andra 7,8,9. Ett spännande applikationsutrymme för IVTT-baserade sensorer är deras användning i avkänningsapplikationer i olika typer av miljöer, inklusive mark, vatten och människokroppen. För att distribuera dessa IVTT-system till dessa utmanande miljöer måste en inkapslingsmetod implementeras för att innehålla IVTT-komponenterna och skydda dem från nedbrytning.
De vanligaste inkapslingsmetoderna för IVTT-system inkluderar användning av lipidkapslar, miceller, polymersomer och andra tätt slutna mikrobehållare10,11,12. En nackdel med detta tillvägagångssätt är behovet av att införliva antingen passiva eller aktiva mekanismer för att transportera material in och ut ur behållarna för att möjliggöra kommunikation med den yttre miljön och tillhandahålla avkänningsfunktioner. För att övervinna några av dessa problem rapporterar studien här en metod som ger ett enkelt men effektivt tillvägagångssätt för att kapsla in kodningsmaterialen för olika sensordesigner som ska uttryckas i IVTT-system. Detta tillvägagångssätt är baserat på användningen av Layer-by-Layer (LbL) deponering av en biopolymer i närvaro av plasmiderna av intresse för att skapa ihåliga mikrokapslar med hög porositet, vilket gör att det skyddade genetiska materialet kan interagera med de olika komponenterna i den valda IVTT. Studien visade att inkapslade plasmider kunde styra transkription och translation när de aktiverades i denna polymera matris, vilket visas med svaret från en plasmidkodad aptamer och en riboswitch till deras motsvarande mål. Dessutom skyddar denna LbL-beläggning plasmiderna i månader utan några speciella lagringsförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion av plasmidvektor.
- Konstruera en plasmidvektor (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) genom amplifiering av den kodande sekvensen av en teofyllinriboswitch (ThyRS) kopplad till GFPa1 från pJ201:23976-RS-GFPa1-vektor (designad och skapad av DNA2.0) och införande i E. coli-uttrycksvektor, pSAL13. Använd framåt (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') och omvända (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') primrar för att förstärka kodningssekvensen för ThyRS i kombination med GFPa1 och utför en PCR-reaktion i 50 μL volym med användning av DNA-polymeras enligt tillverkarens protokoll14.
- Bered en 1% agarosgel från 0,5 g agaros, 50 ml TAE-buffert (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) och 3 μL DNA-fläck.
- Blanda 5 μL alikvot av den PCR-förstärkta produkten med 5 μL RNas/DNase-fritt vatten och 2 μL 6x gelladdningsfärgämne och analysera med agarosgelelektrofores. Ladda en DNA-stege (0,1-10,0 kb) som referens. Kör gelén vid 120 V tills färglinjen nästan har nått botten av gelén.
- Visualisera DNA-fragmenten med hjälp av ett UV-transilluminatorbildsystem för att kontrollera rätt storlek på DNA15.
- Rena PCR-produkten med hjälp av ett PCR-reningssats enligt tillverkarens protokoll16.
- Smält PCR-produkten och pSAL-uttrycksvektorn med KpnI- och BlpI-restriktionsenzymer i en 15 μL-reaktion, innehållande 10 μL PCR-produkt eller plasmidvektor (koncentration 20-50 ng/μL), 1,5 μL 10x enzymbuffert, 1 μL av varje enzym och 1,5 μL RNas/DNas-fritt vatten vid 37 °C i 2 timmar.
- Tillsätt 3 μL 6x gelladdningsfärg till reaktionsblandningen och separera de sönderdelade fragmenten på en 1% agarosgel enligt beskrivningen i steg 1.3-1.5.
- Rengör DNA-fragmenten med hjälp av ett gelextraktionssats enligt tillverkarens protokoll16.
- Ligate den smälta PCR-produkten till en smält linjäriserad plasmidvektor, pSAL, med användning av T4 DNA-ligas och kompletterad ligasbuffert i en 10 μL-reaktion innehållande 3-20 fmol av den smälta vektorn, 9-60 fmol av den smälta PCR-produkten, 2 μL ligasbuffert, 1 μL (1 enhet) T4-DNA-ligas och DNase/RNase-fritt vatten. Inkubera ligeringsreaktionen vid 25 °C i 3 timmar.
OBS: Se till att det totala DNA-innehållet i reaktionsblandningen är 0,01-0,1 μg. - Transformera E. coli DH5α kompetenta celler med 10 ng av ligeringsreaktionsblandningen enligt tillverkarens protokoll17.
- Odla de transformerade cellerna vid 37 °C över natten på LB-agarplattor kompletterade med ampicillin (100 μg/ml).
- Plocka 3-4 bakteriekolonier från plattan och överför aseptiskt var och en av dem till 5 ml LB-media kompletterat med ampicillin (100 μg / ml). Odla kulturerna över natten vid 37 °C i en skakande inkubator vid 225 rpm.
- Pelletera över natten kulturerna genom centrifugering vid 11 x g i 3 min vid rumstemperatur.
- Använd en reningssats för att rena plasmiderna enligt tillverkarens protokoll16.
- Verifiera sekvenserna av de renade plasmiderna genom DNA-sekvensering. Plasmidkartan och sekvensen för den resulterande konstruktionen (pSALv-RS-GFPa1) visas i figur 1.
2. Storskalig DNA-rening.
- Omvandla plasmidvektorn pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (kodar för teofyllinriboswitch kopplad till GFPa1-rapportgenen) eller pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (kodar för Broccoli aptamer) till E. coli DH5α-kompetenta celler enligt tillverkarens protokoll17.
- Odla de transformerade cellerna vid 37 °C över natten på LB-agarplattor kompletterade med ampicillin (100 μg/ml) för celler transformerade med pSALv-RS-GFPa1 eller kanamycin (50 μg/ml) för celler transformerade med pET28c-F30-2x broccoli.
- Välj 3-4 bakteriekolonier från plattan och överför aseptiskt varje koloni till 5 ml LB-media kompletterat med lämpligt antibiotikum (100 μg / ml ampicillin eller 50 μg / ml kanamycin). Odla kulturerna över natten vid 37 °C i en skakande inkubator vid 225 rpm.
- Använd 3 ml av nattkulturen för att inokulera i 150 ml LB kompletterat med lämpligt antibiotikum (100 μg/ml ampicillin eller 50 μg/ml kanamycin) och odla kulturerna över natten vid 37 °C i en skakinkubator vid 225 rpm.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid ≥3400 x g i 10 min vid 4 °C.
- Använd en reningssats för att rena plasmiderna enligt tillverkarens protokoll16.
- Eluera DNA med 0,5 ml rent DNas / RNasfritt vatten. Mät DNA-koncentrationen och bered 1 ml DNA-stamlösningar (100 ng/μl). Förvara rören med DNA vid 4 °C tills de används vidare.
3. Extraktion av silkefibroin och beredning av utgångsmaterial.
- Bered en vattenlösning av rekonstituerat silkesfibroinprotein (SF) från Bombyx mori silkesmaskkokonger enligt det förfarande som beskrivs i detalj någon annanstans för att stå för 10% av Silk-LiBr-lösning18.
- Bestäm den slutliga koncentrationen av den vattenhaltiga SF-lösningen. Pipettera 0,5 ml silkeslösning till en 60 mm petriskål, låt den torka vid 60 °C och mät vikten av torr silkesfilm. Dela torrvikten med 0,5 ml för att beräkna vikten per volymprocent.
- Späd den koncentrerade silkeslösningen med DNase/RNasfritt destillerat vatten genom att långsamt tillsätta vatten via serologisk pipett för att erhålla 1 mg/ml slutlig koncentration. Förvara lösningen vid 4 °C för framtida användning.
- Förbered fluorescerande märkt silkesfibroin med hjälp av ett antikroppsmärkningssats. Använd 1 ml 2 mg / ml silkesfibroinlösning för att koppla de N-terminala α-aminogrupperna av proteinet med ett NHS-esteraktiverat derivatfärgämne enligt tillverkarens protokoll19.
- Bered 50 ml vattenlösning av polyetenimin (PEI) med en koncentration på 6 mg/ml, justera pH till 4 med HCl (1 M). Filtrera lösningen genom ett sterilt 0,2 μm membran. Lagring är möjlig vid omgivande förhållanden i månader.
- Förbered SiO2-kärnor . Pipettera 300 μL SiO 2-partiklar till ett2 ml mikrocentrifugrör. Tvätta mikropartiklarna två gånger med 1 ml DNase/RNase-fritt vatten genom centrifugering vid 0,2 x g i 1 min.
4. Utför lager-för-lager-avsättning av ett primlager, DNA-plasmider och silkelager.
- För att deponera PEI-primärskiktet på SiO 2-mikropartiklarna, tillsätt 1 ml PEI-lösning till den nedknoppade pelleten från steg 3.6 och skaka blandningen vid omgivande förhållanden på en termomixer vid 800 rpm i 15 min. Tvätta partiklarna fyra gånger med 1 ml DNase/RNase-fritt avjoniserat vatten genom centrifugering vid 0,2 x g i 1 min.
- För att utföra avsättning av DNA-skiktet, tillsätt 1 ml av den vattenhaltiga lösningen av DNA-plasmider från steg 2.7 till de PEI-grundade mikropartiklarna och skaka försiktigt blandningen vid 4 °C på en termomixer vid 800 rpm i 15 minuter. För att förbereda mikrokapslar med olika DNA-belastningar, justera koncentrationen av DNA-plasmider från 50-200 ng / μL med DNas / RNasfritt destillerat vatten och använd 1 ml av dessa lösningar för att deponera DNA. Samla upp mikropartiklarna genom centrifugering vid 0,2 x g i 1 min.
- Markera rören för DNA-plasmider som kodar för teofyllinriboswitch i kombination med GFPa1 som ThyRS-GFPa1 och DNA-plasmider som kodar för Broccoli aptamer som BrocApt.
OBS: Håll mikrocentrifugrören med DNA på is. - Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta mikropartiklarna fyra gånger med 1 ml DNase/RNase-fritt destillerat vatten, kassera supernatanten varje gång efter centrifugering vid 0,2 x g i 1 min. Utför alla experiment vid rumstemperatur (RT) om inte annat anges.
- För att utföra avsättning av silkesfibroinskiktet tillsätt 1 ml av den rekonstituerade vattenhaltiga SF-lösningen från steg 3.3 till de DNA-adsorberade mikropartiklarna, virvla försiktigt och agitera blandningen vid 10 °C på termomixern vid 750 rpm i 15 min. Samla upp mikropartiklarna genom centrifugering vid 0,2 x g i 1 min vid 4 °C, avlägsna supernatanten och tvätta dem sedan en gång med 1 ml DNase/RNase-fritt destillerat vatten. Upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten.
OBS: Under experimentet, håll lösningen av siden på is för att undvika temperaturinducerad gelering. - Behandla gradvis partiklarna med metanol för att inducera β-arkbildning i silkeproteinstruktur. Tillsätt först 0,5 ml DNas / RNas-destillerat vatten, virvla mikrocentrifugröret och tillsätt sedan 0,5 ml 100% metanol. Skaka försiktigt partiklarna på termomixern vid 10 °C i 5 minuter. Samla upp partiklarna genom centrifugering vid 0,2 x g i 1 min. Ta bort supernatanten.
- Behandla partiklarna med metanol för att främja bildandet av β-ark och säkerställa stark fysisk adsorption av silkeskiktet. Tillsätt 1 ml 100% metanol. Skaka försiktigt partiklarna på termomixern vid 750 rpm i 10 min vid 10 °C.
- Samla upp partiklarna genom centrifugering vid 0,2 x g i 1 min vid 4 °C och tvätta dem två gånger med 1 ml DNase/RNase-fritt destillerat vatten varje gång, kassera supernatanten och virvla försiktigt före nästa centrifugering.
- Upprepa steg 4,5-4,8 20 gånger för att erhålla silke flerskiktiga kärnskalstrukturer. För det sista avsättningssteget, använd fluorescerande märkt siden från steg 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
- Utför det sista tvättsteget och förvara mikropartiklarna i 1 ml DNase/RNase-fritt destillerat vatten vid omgivningsförhållanden.
OBS: För att undvika aggregering av partiklar under avsättning av silkeskikt, utför en visuell inspektion av partikelsuspensionen och pipettera den upp och ner med en 1 ml pipettspets för att främja homogen partikelfördelning. - Beräkna antalet DNA-plasmidkopior inkapslade i varje mikrokapsel, N-DNA med hjälp av ekvation 1:
(1)
Där N = 6, 769 × 1011 - antalet SiO2-kärnor som används för inkapsling. Beräkna den utifrån en standardkurva för kända koncentrationer av kiseldioxidpartiklar med serieutspädning och absorption A 320 vid λ =320 nm.
C- initial koncentration av DNA som används för adsorption
V- den DNA-volym som används för adsorption
0,8- DNA-adsorptionseffektivitet på kärnorna
Mw- DNA-plasmidens molekylvikt
NA- Avogadros nummer (6,022 × 1023)
(1)5. Upplösning av kärnor för att erhålla silkemikrokapslar.
- Bered 8% fluorvätesyralösning, pH 5,5, genom att späda stamlösningen (48%) med destillerat vatten. Skaffa ett 50 ml centrifugrör. Pipettera försiktigt 5 ml HF och tillsätt 25 ml destillerat vatten för att erhålla 8% HF-lösning.
VARNING: HF är en starkt frätande syra och kan orsaka allvarliga brännskador på vävnaderna. Extrem försiktighet måste iakttas vid hantering och användning av HF för experimenten. Följ Standard Operating Procedure (SOP) för korrekt användning och hantering av HF som utvecklats av organisationen för att undvika oönskade spillolyckor. Använd inte glasbehållare för att späda HF-syra. Använd den kemiska huven för att utföra detta steg i protokollet. - Lös upp SiO2-kärnor genom att tillsätta 1,5 ml 8% HF-lösning till pelleterade kärnskalmikropartiklar från steg 4.10. Virvla försiktigt och låt kärnorna lösas upp över natten vid omgivande förhållanden med försiktig skakning vid 450 rpm.
OBS: För att undvika spill av HF, använd ymptejp för att täta mikrocentrifugröret. Använd en kemisk huva för att utföra detta steg i protokollet. - Förbered en 2 L glasbägare fylld med 2 L avjoniserat vatten. Överför mikrokapsellösning till dialysapparater (50 kDa MWCO) och dialysera dem mot avjoniserat vatten med en upprepad förändring av vattnet var 3: e timme under de kommande 3 dagarna.
OBS: Samla supernatanten under de tre första vattenbytena och kassera lösningen enligt det fastställda protokollet för farligt avfall. - Använd en 1 ml pipett för att överföra suspensionen från dialysapparater till nya 2 ml mikrocentrifugrör för att samla upp mikrokapslarna.
OBS: Förvara vattenlösningarna av mikrokapslar vid omgivningsförhållanden i flera år.
6. Avbildning av silkesfibroinmikrokapslar med hjälp av konfokalt laserskanningsmikroskop (CLSM).
- Utför DNA-färgning med ett DNA-färgämne.
- Överför 300 μL ihåliga mikrokapslar av silkesfibroin till ett nytt 1 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 μL RNase/DNase-fritt destillerat vatten.
- Tillsätt 5 μL av DNA-färgningsfärgämnet, kort virvel och inkubera vid RT i 2 timmar skyddat från ljus.
- Utför fyra tvättsteg genom centrifugering vid 0,1 x g i 20 minuter vid 4 °C varje gång, avlägsna försiktigt 400 μL av supernatanten och fyll på med 400 μL RNase/DNase-fritt destillerat vatten.
- Utför avbildning av silkekapslar på inverterade konfokala system utrustade med tre stora lasrar (405 nm, 488 nm, 561 nm) med 100x oljenedsänkningsmål (NA 1.49). Överför 100 μL av kapselprovet till en enda brunn med 8-brunnskammare glasskivor, låt kapslarna sedimentera i 20-30 minuter före avbildning.
OBS: Färgämnen är mycket känsliga för fotoblekning. Skydda proverna genom att täcka objektglasen med aluminiumfolie.
7. Uppskattning av permeabiliteten hos ihåliga mikrokapslar med hjälp av molekylviktsmetoden (MWCO).
- Bered 2 ml vardera av FITC-märkta dextranfluoroforlösningar (20 μM,diH2O) av olika Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa och 2 MDa).
- Pipettera 100 μL av kapselsuspensionen till en enda brunn i en glasskiva. Analysera varje mikrokapseldesign (koncentration av PEI, laddningsantal DNA-plasmider, koncentrationen av silkefibroin och antalet lager) separat.
- Tillsätt 300 μL av den specifika fluoroforlösningen till varje brunn med början från den lägsta Mw upp till den högsta, så att varje brunn motsvarar den specifika fluoroforlösningen. Blanda genom pipettering upp och ner och låt blandningen inkubera i 1 timme vid rumstemperatur tills diffusionen av fluoroforlösningar når jämvikt.
- Överför bilden till ett konfokalt laserskanningsmikroskop (CLSM) och avbilda varje brunn med 100x oljenedsänkningsmål vid excitation λ = 488 nm.
- Identifiera intresseområdet genom att justera fokalplanet för att se till att kapslarna visas i form av cirklar med största diameter. Detta händer vanligtvis när man tittar på proverna närmare botten av brunnen när kapslar sediment på grund av tyngdkraften.
- Samla in flera bilder av mikrokapselprover genom att flytta bilden i XY-riktning. Ta bilder för att ta upp till 100-150 kapslar för varje prov.
- Använd ImageJ-programvaran för att analysera permeabiliteten hos kapselns membran i varje M w-fluoroforlösning genom att jämföra fluorescensintensiteter inuti och utanför kapslarna. För det, rita ett intresseområde (ROI) i form av en cirkel för att skissera kapselns omkrets och klicka på Analysera / mäta för att mäta fluorescensintensiteten inuti. Tabulera data i ett kalkylblad. Utför denna operation för varje mikrokapsel för totalt 200-300 kapslar.
- Bedöm den yttre fluorescensintensiteten på samma sätt genom att beskriva ROI och mäta intensiteten bort från kapslarna. Utför 3-5 mätningar för statistisk analys.
- För att utföra statistisk analys, jämför fluorescensintensiteterna inuti och utanför kapslarna med parat t-test (p < 0,05).
- Använd konverteringstabell 2 för att uppskatta permeabiliteten hos mikrokapslar baserat på de hydrodynamiska radierna för FITC-Dextran med variabel Mw.
8. In vitro-aktivering av syntetisk teofyllin riboswitch i silkemikrokapslar
- Bered 1 ml teofyllinstamlösning (100 mM, DMSO). Förbered E. coli S30-extraktsystemet för cirkulärt DNA genom att tina komponenterna på is i 40 minuter.
- Skaffa ett 0,5 ml DNas / RNasfritt mikrocentrifugrör. Utför in vitro transkription/translationsreaktion, kombinera de cellfria komponenterna med ett prov av mikrokapslar i följande ordning (50 μL total volym): S30 premix utan aminosyror (20 μL); S30-extrakt, cirkulärt (15 μl). fullständig aminosyrablandning (5 μL); ihåliga mikrokapslar innehållande ThyRS-GFPa1-plasmider från steg 4.10 (9 μl); och teofyllin, 100 mM DMSO (1 μL).
OBS: Efter tillsats av alla komponenter, virvla röret kort och samla provet under kort centrifugering vid 0,2 × g i några sekunder. - Inkubera röret vid 30 °C i 4 timmar och kontrollera fluorescensen på en plattläsare med excitation vid λ = 488 nm och emission för GFP/FITC-filter (510 nm ± 20 nm).
- Avbilda kapslarna på valfritt LCSM-system med 488 nm och 561 nm lasrar. Få bilder av bästa kvalitet med 100x oljenedsänkningsmål och 8-brunnskammare.
9. In vitro-aktivering av broccoli aptamer i silkemikrokapslar
- Bered 1 ml stamlösning av DFHBI-1T-färgämne (30 μM,diH2O). Förbered PURE (proteinsyntes med rekombinanta element) cellfria systemreaktionssats genom att tina komponenterna på is i 40 minuter.
- Skaffa ett 0,5 ml DNas / RNasfritt mikrocentrifugrör. Utför transkriptionsreaktion in vitro genom att kombinera cellfria reaktionskomponenter med ett prov av mikrokapslar i följande ordning (50 μL total volym): lösning A (20 μl); Lösning B (15 μl). ihåliga mikrokapslar innehållande BrocApt-plasmider från steg 4.10 (14 μl); och DFHBI-1T-färgämne (1 μL).
OBS: Efter tillsats av alla komponenter, virvla röret kort och samla provet under kort centrifugering vid 0,2 × g i några sekunder. - Inkubera röret vid 37 °C i 6 timmar och kontrollera fluorescensen på en plattläsare med excitation vid λex = 470 nm och emission vid λem = 510 nm ± 20 nm.
- Avbilda kapslarna på valfritt LCSM-system med 488 nm och 561 nm lasrar. Få bilder av bästa kvalitet med 100x oljenedsänkningsmål och 8-brunns täckglaskammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här behandlar studien funktionaliteten hos DNA-mallar som kodar för olika sensordesigner (två typer av RNA-reglerade transkriptions-/translationselement) efter inkapsling i silkeproteinkapslar. Mikrokapslar framställdes via mallad Layer-by-Layer (LbL) -montering av nyckelkomponenterna: Ett primlager, DNA-plasmider som kodar för sensordesign och silkesfibroinbiopolymer (figur 2). Deponering av makromolekyler på ett skiktat sätt möjliggör kontroll av kapselmembranets permeabilitet baserat på inter- och intramolekylära interaktioner mellan de absorberade skikten och skalets tjocklek. Systemets avstämbara permeabilitet erbjöd möjligheten att kontrollera diffusionen av väsentliga molekyler samtidigt som diffusionen av stora oönskade makromolekyler genom kapselmembranet20 begränsades.
Homogena i storlek (4,5 μm) och robusta silkesfibroinmikrokapslar med en skaltjocklek på ~ 500 nm (20 lager) i hydratiserat tillstånd kan framställas när de korrekt följer protokollet (figur 3)21. LbL-metoden gjorde det möjligt att ställa in laddningskapaciteten för DNA-mallar baserat på plasmidernas initiala koncentration. Den optimala DNA-belastningen kan uppnås genom att variera den initiala koncentrationen av DNA-mallar från 50-200 ng / μL. Tabell 1 representerar antalet DNA-kopior som behållits i en enda mikrokapsel efter avslutad LbL-inkapsling och beräknades för varje sensordesign baserat på de initiala DNA-koncentrationerna och Mw av DNA-plasmider enligt ekvation 1. Den optimala DNA-laddningskapaciteten uppnåddes med 32 respektive 20 DNA-kopior för ThyRS- respektive BrocApt-sensorkonstruktioner. Bedömningen av laddningskapaciteten var viktig för att få en exakt uppskattning av de inkapslade DNA-koncentrationerna för att kunna titrera den under IVTT-aktivering av sensorerna genom att lägga till fler koncentrerade kapselprover.
Kapselskalens permeabilitet kan analyseras systematiskt genom att följa MWCO-metoden. Metoden uppskattar membranets porstorlek baserat på molekylvikten för lösta molekyler som inte kunde tränga igenom kapselmembranet. Genom att utsätta mikrokapslar för variabla M w-fluoroformolekyler och utföra konfokal avbildning i fokalplanet som motsvarar den största diametern över flera kapslar kan skalmembranens permeabilitet bedömas. ImageJ-analys gör det möjligt att uppskatta fluorescensintensiteterna inuti och utanför kapslarna och identifiera fullt permeabla (yttre och inre fluoroforintensiteter var jämförbara), delvis permeabla (50% -70% av kapslarna hade lägre fluorescens inuti jämfört med utanför) och inte permeabla (inuti fluoroforintensiteten var lägre jämfört med yttre intensitet) membran (figur 4). Genom att omvandla Mw till hydrodynamisk radie för varje fluorofor kan man uppskatta kapselmembranets maskstorlek (tabell 2).
Selektiv permeabilitet hos proteinkapslar kan uppnås under systematisk optimering av LbL-deponeringsprotokoll genom att använda variabla koncentrationer av ett primskikt (från 0-6 mg / ml), koncentrationen av en silkesfibroin (från 0,5-2 mg / ml) och antalet deponerade skikt (från 10-25) tills optimal permeabilitet uppnås. I detta protokoll uppnåddes optimal permeabilitet mellan 25-32 nm med 6 mg / ml PEI som ett primärskikt och 20 lager av 1 mg / ml silkesfibroin avsatt under LbL-montering (figur 4). Detta permeabilitetsområde var idealiskt för komponenterna i IVTT-systemet att perkolera genom kapselskalet. Vanligtvis är de största molekylkomplexen i något IVTT-system prokaryota ribosomala enheter, 30S och 50S, som, när de binds av mRNA i ett ribosomalt komplex, kan nå upp till ~ 20 nm i storlek22. Strukturen hos de utvecklade mikrokapslarna liknar ett mycket sammanflätat nätverk av silkefiberskikt som är fysiskt tvärbundna av β-arkblock som produceras under LbL-montering. Denna membranstruktur är halvpermeabel: mycket permeabel för små molekyler (t.ex. joner, aminosyror, peptider, sockerarter etc.) och begränsad till stora molekyler (t.ex. proteiner med hög molekylvikt, glykoproteiner, celler etc.) som endast tillåter perkolering av molekyler med en hydrodynamisk radie mindre än 25 nm. Därför kan mikrokapslar av silkesfibroin med optimal DNA-belastning och membranpermeabilitet användas som bioreaktorbärare för IVTT-aktivering.
Den transkriptionella och translationella aktiviteten hos ThyRS- och BrocApt-designsensorer kan testas med kommersiellt tillgängliga IVTT-system. ThyRS kräver translationell aktivering av rapportgenen i närvaro av teofyllinligand. Aktivering av syntetisk ThyRS innefattar flera steg för att initiera genuttryck, inklusive mRNA-syntes, konformationsförändringen av mRNA-sekvensen vid bindning till analyten, frisättning av ribosombindningsstället och syntesen av rapportören GFPa1-protein. Alla dessa steg kräver fri diffusion av IVTT-komponenterna genom kapselmembranet. Den föreslagna designen av DNA-laddade silkesfibroinmikrokapslar förbättrade aktiveringsparametrarna för RNA-reglerade sensordesigner: Både uttryckskinetiken och fluorescensutgången var signifikant högre jämfört med det fria icke-immobiliserade DNA (figur 5A). CLSM-avbildningen bekräftade också framgångsrik GFPa1-genaktivering i kapslar laddade med DNA-plasmider som kodar för ThyRS-sekvenser (figur 5B-D).
Alternativt utfördes aktiveringen av BrocApt-sensordesign i IVTT-systemet som stöder T7 E. coli-promotorkopplad transkription/translation i närvaro av DHFBI-1T-färgämne . Fluorescensutgången initierades vid bindning av det fluorogena färgämnet till mRNA-sekvensen. Viktigt är att utsignalen från silkemikrokapslar var flera gånger högre jämfört med icke-inkapslade DNA-prover med ekvivalenta koncentrationer (figur 6). Därför kan mikrokapslar av silkesfibroin behålla den väsentliga funktionaliteten hos DNA-kodade sensorelement, vilket kan vara viktigt för utformningen av nya typer av in vitro-biosensorplattformar för snabb och känslig detektion av analyter av intresse.
Figur 1: Plasmidkarta och sekvens av pSALv-RS-GFPa1 . (A) Plasmiden innehåller teofyllinriboswitchsekvens (ThyRS) placerad uppströms GFPa1-kodande gen under kontroll av ptac-promotorn, β-laktamas (bla) kodande gen som är ansvarig för resistens mot ampicillin. B) Sekvensen för PTAC-promotorn visas i fetstil och understrykning. teofyllin riboswitch sekvens visas i fet kursiv stil; GFPa1-kodningssekvensen visas i fetstil; Sekvenser för begränsningsplatser är understrukna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Översikt över beredningen av mikrokapslar med hjälp av lager-för-lager-metoden. Orörda SiO2-kärnor funktionaliserades först med PEI-polymer, följt av sekventiell avsättning av DNA-plasmider som kodar för olika sensordesigner och silkesfibroinskikt tills det önskade antalet silkeproteinskikt har adsorberats. Ihåliga orörda mikrokapslar innehållande olika DNA-sensordesigner kan framställas genom upplösning av offerkärnor. Aktivering av varje biosensordesign inkapslad i mikrokapseln kan uppnås under IVTT-reaktioner i närvaro av motsvarande ligander. Denna siffra har återtryckts från Drachuk, I. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mikroskopistudier för DNA-laddade mikrokapslar. (A) Tvärsnitt 2D och (B) Renderade 3D-konfokalmikroskopibilder av ihåliga (SF) 20 mikrokapslar laddade med DNA-plasmider som kodar för ThyRS (32 DNA-kopior/kapsel) och framställda av 6 mg/ml PEI-grundade SiO2-kärnor. Autofluorescens från silkesfibroinkapslar (DAPI-kanal, blå) och färgat DNA (FITC-kanal, grön) applicerades för att identifiera lokaliseringen av DNA-plasmider och uppskatta kapselmembrantjockleken. Infälld i (A) representerar intensitetsprofiler för DNA- och silkesfibroinskal över kapseln. Skalstång: 2 μm. Infälld i (B) representerar intensitetsprofilen för silkesprotein över kapselskalet. Membrantjockleken mättes som längden vid halvintensitetstopp. Bearbetning av tvärsnittsbilder och 3D-rendering utfördes med hjälp av NIS-bildprogramvara på Nikon C2+-systemet. Denna siffra har återtryckts från Drachuk, I. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uppskattning av membranpermeabiliteten för silkemikrokapslar med MWCO-metoden. Selektiva CLSM-representativa fluorescerande bilder av ihåliga mikrokapslar av silkesfibroin som utsätts för FITC-Dextran-lösningar av olika Mw (20 μM, diH2O). Kapslar framställdes med ett annat antal lager och PEI-koncentrationer. En ökning av koncentrationen av ett primärskikt leder till ökad kolloidal stabilitet hos mikrokapslar med mer permeabla skal, medan eliminering av det primära skiktet orsakar aggregering av kapslar med mindre permeabla skalmembran. Skalstång: 5 μm. Denna siffra har återtryckts från Drachuk, I. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Aktivering av ThyRS-sensordesign i mikrokapslar av silkesfibroin. (A) Kinetik för GFPa1-uttryck under ThyRS-aktivering från DNA-plasmider laddade i 20-skiktade SF-mikrokapslar (rödfärgade linjer) och kontroll av icke-inkapslat DNA (blåfärgade linjer). Från topp till botten var koncentrationerna av DNA i en provvolym (50 μL) 6,5 ng / μL, 4,5 ng / μL, 2,5 ng / μL och 0 ng / μL och motsvarar förändringarna i färgintensiteter. (B) CLSM-bilder av silkesfibroinkapslar laddade med 32 DNA-kopior per kapsel. Skalstapel: 5 μm. (C) Bilden motsvarar tvärsnittsintensitetsprofiler motsvarande bild (B) över två kapslar (vit linje i B). Den röda linjen representerar silkekapslar och den gröna linjen representerar GFPa1 uttryckt i kapslar. (D) Bilden representerar renderade 3D-silkekapslar laddade med 32 kopior av DNA efter inkubation i IVTT-systemet. Grön fluorescens motsvarar GFPa1-signalen och röd fluorescens motsvarar fluorescerande märkta silkeskikt. Skalstång: 2 μm. ThyRS-aktivering utfördes med teofyllin (2 mM, DMSO) under inkubationen av mikrokapslar i IVTT-systemet (S30-extrakt). Denna siffra har återtryckts från Drachuk, I. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Aktivering av BroccApt i mikrokapslar av silkesfibroin. Jämförelse av transkriptionskinetik utfördes för 20-skiktade silkemikrokapslar laddade med 30 DNA-kopior per kapsel (rödfärgade linjer) och kontroll av icke-inkapslat DNA (blåfärgade linjer). Från topp till botten var koncentrationerna av inkapslat DNA i ett prov: 3,6 ng / μL, 2 ng / μL, 1 ng / μL och 0 ng / μL och motsvarar förändringarna i färgintensiteter. Koncentrationer av icke-inkapslat DNA var: 20 ng / μL, 10 ng / μL, 5 ng / μL och 0 ng / μL och motsvarar förändringarna i färgintensiteter. Aktivering utfördes med DHBFI-1T (100 μM, diH2O) under inkubation i det PURE cellfria systemet. Denna siffra har återtryckts från Drachuk, I. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| DNA-sensor design | Initial DNA-koncentration (ng/μl) | Antal DNA-kopior per kapsel (DNA/kapsel) |
| 50 | 16 | |
| ThyRS | 100 | 32 |
| 150 | 48 | |
| 200 | 64 | |
| 50 | 10 | |
| BrocApt | 100 | 20 |
| 150 | 30 | |
| 200 | 40 |
Tabell 1: DNA-kopieringsnummer per kapsel för varje DNA-design. Kopieringsantalet beräknades enligt ekvation 1 och korrelerades med den initiala koncentrationen av DNA-plasmider, retentionsaffinitet för DNA-sekvenser under LbL-deponeringsprocessen och längden på DNA-plasmider.
| Mw av FITC-Dextran (kDa) | Hydrodynamisk radie (nm) |
| 4 | 1.4 |
| 20 | 3.3 |
| 40 | 4.5 |
| 70 | 6 |
| 150 | 8.5 |
| 250 | 10 |
| 500 | 14 |
| 2,000 | 18 |
Tabell 2: Fysikaliska egenskaper hos FITC-dextrans. Hydrodynamisk radie för varje fluorofor användes för att uppskatta permeabiliteten hos ihåliga silkesfibroinmikrokapslar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektivt permeabla hydrogelmikrokapslar laddade med olika typer av DNA-kodade sensordesigner kan framställas enligt detta protokoll. En av de utmärkande egenskaperna hos LbL-metoden är förmågan att skräddarsy komplexiteten hos mikrokapslar under bottom-up-monteringen, som vanligtvis börjar med adsorption av molekylära arter på offermallar. Genom att noggrant justera koncentrationerna av de ursprungliga komponenterna, pH-förhållandena och antalet lager kan mikrokapslar med olika DNA-laddningsparametrar, funktionalitet och avstämbar permeabilitet framställas23. För att förstärka kapslarnas mångsidighet kan ytterligare funktionalisering av skalytan med AuNP och IgG uppnås för att implementera biokompatibla sensorbärare för in vivo-diagnostik . Båda dessa alternativa vägar är beroende av silkesfibroinets unika molekylära struktur. In situ-reduktion av Au3+ joner kan åstadkommas på grund av närvaron av tyrosinrester (5,3% mol.) som kan reducera metalljoner i närvaro av en optimal reduktionsbuffert. Konjugeringen av specifika antikroppar mot ytan av AuNPs-funktionaliserade proteinmikrokapslar kan göras via implementering av karbodiimidaktiveringskemi. Båda dessa steg kräver noggrann utveckling och optimering av protokollet för att uppnå rätt funktionalitet hos biosensorkapslarna för framtida applikationer. Till exempel, för att använda dessa mikrokapslar som "smarta" leveranssystem, där en molekylär last levereras på specifika stimuli (som pH eller kemiska signaler), bör specifika egenskaper hos dessa kapslar karakteriseras och stämmas, inklusive leveranseffektivitet, retentionstid, administreringsväg och sjukdomsmodellbehandlingar.
De DNA-laddade mikrokapslarna kännetecknades av CLSM-tekniken och fluorescensmätningar. Andra karakteriseringsmetoder såsom atomkraftmikroskopi (AFM), kryogen elektrontomografi (CEM) och direkt stokastisk rekonstruktion superupplösningsmikroskopi (dSTORM) kan emellertid tillämpas för att differentiera specifika strukturer hos mikrokapslarna, inklusive enskilda fibrer, nanodomäner och lokalisering av DNA-plasmider24,25,26.
Det utvecklade protokollet belyser användningen av silkesfibroinbiopolymer som ett biokompatibelt nätverksmaterial som bevarar den tertiära strukturen hos laddade DNA-plasmider. Stabiliteten hos immobiliserade DNA-sekvenser inom silkesfibroinnätverket sker via hydrofoba interaktioner och / eller vätebindning, vilket ger en skyddande mikromiljö mot pH-inaktivering, oxidation eller hydrolys27. Dessutom ger de β-kristallina domänerna av silkefibroin en unik mekanisk barriär, vilket begränsar rörelsen av fångade makromolekyler och förhindrar DNA-plasmider från nedbrytning under lagring i vattenhaltiga lösningar.
Den semipermeabla naturen hos silkesfibroinmikrokapslar laddade med DNA-mallar skapade unika rumsliga och fysikalisk-kemiska förhållanden för IVTT-reaktionerna. Transkriptionellt och translationellt aktiverat RNA, aptamer och riboswitch immobiliserade i silkesfibroinmikrokapslar kunde producera en utsignal som var minst tre gånger högre jämfört med fria icke-immobiliserade sensorer. Dessutom kan immobilisering av DNA-mallar i mikrokapslar avsevärt förbättra aktiviteten hos inkapslade sensorer utöver detektionsgränsen för icke-inkapslade sensorer. Medan icke-inkapslade sensorer hade ett minimalt svar vid låga DNA-koncentrationer, hade de inkapslade sensorerna ett mycket distinkt utgångssvar, som lätt kan titreras för att återspegla de subtila förändringarna i DNA-koncentrationer. Den förbättrade svarssignalen hos inkapslade reportrar berodde sannolikt på obegränsad diffusion av komponenterna i IVTT-maskiner och minskad rörlighet hos DNA-plasmider. Flera studier har erkänt att utbytet av proteinsyntes i cellfria reaktioner är beroende av den makromolekylära miljön28,29. Immobilisering av DNA-plasmider i silkenätverk gav en effektiv begränsad miljö som begränsade oligonukleotiders rörelse och påskyndade transkriptions- / translationsmekanismreaktioner även från flera DNA-kopior21.
Medan LbL-metoden ger ett mycket mångsidigt tillvägagångssätt för att konstruera multifunktionella enheter på ett kontrollerbart sätt, är tillverkningsproceduren relativt tidskrävande och kräver vanligtvis bearbetningsjusteringar för att skala upp mikrokapslarnas utbyte. Ett annat övervägande vid tillverkning av biomolekylbaserade mikrokapslar är kompatibiliteten hos ett givet system med kravet på kärnupplösningen efter att LbL-deponeringen är klar. Hittills, för att producera homogena i storlek och robusta ihåliga silkebaserade DNA-laddade mikrokapslar, deponerades skalen på offerkiseldioxid (SiO2) kärnmallar, vilket krävde efterföljande avlägsnande genom fluorvätesyra (HF) syraetsning. Inte heller HF-hantering eller etsning anses vara biokompatibla processer, vilket begränsar deras utbredda användning i praktiska tillämpningar. Alternativet till SiO2 oorganiska kolloidala mallar, karbonatkärnor är typiskt inerta för att bilda komplex med polymerskikt och kan lösas under milda förhållanden med användning av etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Justering av offerkärnor kan emellertid påverka avsättningsegenskaperna hos flera lager och skalstrukturens integritet, vilket kräver ytterligare optimering av protokollet.
Sammanfattningsvis tillåter det nuvarande protokollet framställning av silkebaserade DNA-laddade mikrokapslar med olika sensordesigner. Kombinationen av en begränsad mikromiljö som tillhandahålls av LbL-metoden och användningen av silkesfibroin som ett biokompatibelt material förbättrade avkänningsegenskaperna hos inkapslat DNA. Med den snabba utvecklingen av fluorogen RNA-aptamerteknik kan den potentiella användningen av DNA-laddade silkemikrokapslar utvidgas till multiplexerad in vitro-diagnostik. Nyligen har flera varianter av RNA-baserade fluorescerande aptamerer dykt upp som kraftfull bakgrundsfri teknik för avbildning av RNA i levande celler med hög signal-brusförhållandekänslighet30,31. Genom att tillämpa syntetisk RNA-nanoteknik för att designa artificiella RNA-aptamerer kan aptamerernas fluorogena egenskaper utnyttjas för att detektera specifika ligander av intresse. Denna teknik kommer att vara särskilt värdefull för att övervaka biomarkörer av intresse i olika format, inklusive pappersbaserade sensorer, hydrogelbaserade plåster för svett eller interstitiell vätska och implanterbara material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De åsikter och åsikter som presenteras här är författarnas och representerar inte nödvändigtvis DoD: s åsikter eller dess komponenter
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av LRIR 16RH3003J-bidrag från Air Force Office of Scientific Research, liksom programmet Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) från U.S. Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering.
Plasmidvektorsekvensen för ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) tillhandahölls generöst av Dr. J. Gallivan. Silkesmaskkokonger från Bombyx mori donerades generöst av Dr. DL Kaplan från Tufts University, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N.
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
