Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fremstilling af multifunktionelle silkebaserede mikrokapsler fyldt med DNA-plasmider, der koder for RNA-aptamerere og ribotekser

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/62854
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2
1UES Inc., 2711th Human Performance Wing, Airman Systems Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson AFB, 3Materials and Manufacturing Directorate, Wright-Patterson AFB

Summary

Protokollen beskriver dannelsen af robuste og biokompatible DNA-belastede mikrokapsler som multipleksede in vitro-biosensorer, der er i stand til at spore flere ligander.

Abstract

Vi introducerer en protokol til fremstilling af DNA-belastede silkefibroinmikrokapsler via lag-for-lag (LbL) samlingsmetoden på offersfæriske kerner. Efter adsorption af et primlag og DNA-plasmider blev dannelsen af robuste mikrokapsler lettet ved at inducere β-ark i silke sekundær struktur under akut dehydrering af et enkelt silkelag. Derfor forekom lagdelingen via flere hydrogenbindinger og hydrofobe interaktioner. Ved adsorption af flerlagede skaller kan kerneskalstrukturerne yderligere funktionaliseres med guldnanopartikler (AuNP'er) og / eller antistoffer (IgG), der skal bruges til teledetektion og / eller målrettet levering. Justering af flere nøgleparametre under sekventiel aflejring af nøglemakromolekyler på silicakerner, såsom tilstedeværelsen af en polymerprimer, koncentrationen af DNA og silkeprotein samt et antal adsorberede lag, resulterede i biokompatible, DNA-ladede mikrokapsler med variabel permeabilitet og DNA-belastninger. Efter opløsning af silicakerner demonstrerede protokollen dannelsen af hule og robuste mikrokapsler med DNA-plasmider immobiliseret til den indre overflade af kapselmembranen. Oprettelse af en selektivt permeabel biokompatibel membran mellem DNA-plasmiderne og det ydre miljø bevarede DNA'et under langtidsopbevaring og spillede en vigtig rolle i det forbedrede outputrespons fra rumligt begrænsede plasmider. DNA-skabelonernes aktivitet og tilgængelighed blev testet under in vitro-transkriptions- og translationsreaktioner (cellefrie systemer). DNA-plasmider, der koder for RNA-lyspatamerer og ribotekster, blev med succes aktiveret med tilsvarende analysander, som det blev visualiseret under lokalisering af fluorescerende mærkede RNA-transkripter eller GFPa1-protein i skalmembranerne.

Introduction

Området syntetisk biologi giver unikke muligheder for at udvikle sensorevner ved at udnytte naturlige mekanismer udviklet af mikroorganismer til at overvåge deres miljø og potentielle trusler. Det er vigtigt, at disse sensormekanismer typisk er forbundet med en reaktion, der beskytter disse mikroorganismer mod skadelig eksponering, regulerer genekspression for at afbøde negative virkninger eller forhindre indtagelse af giftige materialer. Der har været en betydelig indsats for at konstruere disse mikroorganismer til at skabe helcellesensorer, der udnytter disse naturlige reaktioner, men omdirigerer dem til at genkende nye mål og / eller producere et målbart signal, der kan måles til kvantificeringsformål (typisk fluorescens)1,2. På nuværende tidspunkt tyder bekymringer med hensyn til anvendelsen af genetisk modificerede mikroorganismer (GMO'er), navnlig ved udsætning i miljøet eller menneskekroppen på grund af lækage af hele celler eller noget af deres genetiske materiale, selv om de er indkapslet i en polymermatrix, på, at der er behov for alternative måder at udnytte disse sensormetoderpå 3.

En effektiv tilgang til at udnytte fordelene ved mikroorganismer-baseret sensing uden bekymring for udbredelsen af GMO'er er brugen af in vitro transkriptions-/oversættelsessystemer (IVTT). Fra et praktisk perspektiv består IVTT-systemer af en blanding, der indeholder de fleste af cellekomponenterne i en aktiv tilstand, der er blevet "ekstraheret" fra celler på forskellige måder, herunder sonikering, perleslag eller andre4. Det endelige produkt af denne proces er en biokemisk reaktionsblanding, der allerede er optimeret til at udføre transkription og oversættelse, der kan bruges til at teste forskellige sensorer i et "åbent beholder" -format uden de begrænsninger, der er forbundet med brugen af hele celler (membrandiffusion, transformationseffektivitet, celletoksicitet osv.). Det er vigtigt, at forskellige sensorkomponenter kan tilføjes kvantitativt, og deres effekt studeres ved forskellige optiske og spektrometriske teknikker, som vi har demonstreret5. Det er blevet bemærket, at IVTT-systemernes ydeevne kan være inkonsekvent; Nylige undersøgelser har imidlertid vist tilgange til at standardisere deres forberedelse og karakterisering, hvilket er til stor hjælp, når man studerer deres ydeevne i sensordesign6. For nylig er der demonstreret mange eksempler på IVTT-systemer, der bruges til at skabe papirbaserede assays gennem frysetørring af deres komponenter i papirmatricer, herunder påvisning af tungmetalioner, lægemidler, quorum-sensingelementer og andre 7,8,9. Et spændende anvendelsesområde for IVTT-baserede sensorer er deres anvendelse i sensorapplikationer i forskellige typer miljøer, herunder jord, vand og menneskekroppen. For at implementere disse IVTT-systemer i disse udfordrende miljøer skal der implementeres en indkapslingstilgang for at indeholde IVTT-komponenterne og beskytte dem mod nedbrydning.

De mest almindelige indkapslingsmetoder til IVTT-systemer inkluderer brugen af lipidkapsler, miceller, polymersomer og andre tæt lukkede mikrobeholdere10,11,12. En ulempe ved denne fremgangsmåde er behovet for at inkorporere enten passive eller aktive mekanismer til transport af materialer ind og ud af containerne for at muliggøre kommunikation med det ydre miljø og give sensorfunktioner. For at overvinde nogle af disse problemer rapporterer undersøgelsen her en metode, der giver en enkel, men effektiv tilgang til at indkapsle kodningsmaterialerne til forskellige sensordesign, der skal udtrykkes i IVTT-systemer. Denne tilgang er baseret på brugen af lag-for-lag (LbL) aflejring af en biopolymer i nærvær af plasmider af interesse for at skabe hule mikrokapsler med høj porøsitet, hvilket gør det muligt for det beskyttede genetiske materiale at interagere med de forskellige komponenter i IVTT efter eget valg. Undersøgelsen viste, at indkapslede plasmider kunne dirigere transkription og translation, når de aktiveres inden for denne polymere matrix, som vist med responsen fra en plasmidkodet aptamer og en riboswitch til deres tilsvarende mål. Derudover beskytter denne LbL-belægning plasmiderne i flere måneder uden særlige opbevaringsforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion af plasmidvektor.

  1. Konstruer en plasmidvektor (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) ved amplifikation af kodningssekvensen af en theophyllinriboswitch (ThyRS) kombineret med GFPa1 fra pJ201:23976-RS-GFPa1-vektor (designet og skabt af DNA2.0) og indsættelse i E. coli-ekspressionsvektor, pSAL13. Brug fremadgående (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') og omvendte (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') primere til at forstærke kodningssekvensen for ThyRS kombineret med GFPa1 og udføre en PCR-reaktion i 50 μL volumen ved hjælp af DNA-polymerase i henhold til producentens protokol14.
  2. Forbered en 1% agarosegel fra 0,5 g agarose, 50 ml TAE-buffer (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) og 3 μL DNA-plet.
  3. Bland 5 μL alikvote af det PCR-amplificerede produkt med 5 μL RNase/DNasefrit vand og 2 μL 6x gelpåfyldningsfarvestof og analyser ved agarosegelelektroforese. Ilæg en DNA-stige (0,1-10,0 kb) som reference. Kør gelen ved 120 V, indtil farvelinjen næsten har nået bunden af gelen.
  4. Visualiser DNA-fragmenterne ved hjælp af et UV-transilluminatorbilleddannelsessystem for at kontrollere den korrekte størrelse af DNA15.
  5. Rens PCR-produktet ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til producentens protokol16.
  6. PCR-produktet og pSAL-ekspressionsvektoren fordøjes med KpnI- og BlpI-restriktionsenzymer i en 15 μL-reaktion indeholdende 10 μL PCR-produkt eller plasmidvektor (koncentration 20-50 ng/μL), 1,5 μL 10x enzymbuffer, 1 μL af hvert enzym og 1,5 μL RNase/DNasefrit vand ved 37 °C i 2 timer.
  7. Der tilsættes 3 μL 6x gelfyldigt farvestof til reaktionsblandingen, og de fordøjede fragmenter adskilles på en 1% agarosegel som beskrevet i trin 1.3-1.5.
  8. DNA-fragmenterne renses ved hjælp af et gelekstraktionssæt i henhold til producentens protokol16.
  9. Ligere det fordøjede PCR-produkt i en fordøjet lineær plasmidvektor, pSAL, ved hjælp af T4 DNA-ligase og suppleret ligasebuffer i en 10 μL reaktion indeholdende 3-20 fmol af den fordøjede vektor, 9-60 fmol af det fordøjede PCR-produkt, 2 μL ligasebuffer, 1 μL (1 enhed) T4 DNA-ligase og DNase/RNasefrit vand. Inkubationsreaktionen inkuberes ved 25 °C i 3 timer.
    BEMÆRK: Sørg for, at det totale DNA-indhold i reaktionsblandingen er 0,01-0,1 μg.
  10. E. coli DH5α kompetente celler omdannes med 10 ng ligeringsreaktionsblandingen i henhold til fabrikantens protokol17.
  11. De transformerede celler dyrkes ved 37 °C natten over på LB-agarplader suppleret med ampicillin (100 μg/ml).
  12. Pluk 3-4 bakteriekolonier fra pladen og overfør hver af dem aseptisk til 5 ml LB-medier suppleret med ampicillin (100 μg/ml). Kulturerne dyrkes natten over ved 37 °C i en rysteinkubator ved 225 omdr./min.
  13. Pellet natkulturerne ved centrifugering ved 11 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
  14. Brug et rensningssæt til at rense plasmiderne i henhold til producentens protokol16.
  15. Sekvenserne af de oprensede plasmider kontrolleres ved DNA-sekventering. Plasmidkortet og sekvensen af den resulterende konstruktion (pSALv-RS-GFPa1) er vist i figur 1.

2. DNA-oprensning i stor skala.

  1. Omdan plasmidvektoren pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (kodning af theophyllin riboswitch kombineret med GFPa1 reportergen) eller pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (kodning af Broccoli aptamer) til E. coli DH5α kompetente celler i henhold til producentens protokol17.
  2. De transformerede celler dyrkes ved 37 °C natten over på LB-agarplader suppleret med ampicillin (100 μg/ml) til celler transformeret med pSALv-RS-GFPa1 eller kanamycin (50 μg/ml) til celler transformeret med pET28c-F30-2x broccoli.
  3. Pluk 3-4 bakteriekolonier fra pladen og overfør hver koloni aseptisk til 5 ml LB-medier suppleret med passende antibiotikum (100 μg/ml ampicillin eller 50 μg/ml kanamycin). Kulturerne dyrkes natten over ved 37 °C i en rysteinkubator ved 225 omdr./min.
  4. Brug 3 ml af natkulturen til at pode til 150 ml LB suppleret med passende antibiotikum (100 μg/ml ampicillin eller 50 μg/ml kanamycin) og dyrk kulturerne natten over ved 37 °C i en rysteinkubator ved 225 omdr./min.
  5. Pellet cellerne ved centrifugering ved ≥3400 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  6. Brug et rensningssæt til at rense plasmiderne i henhold til producentens protokol16.
  7. Eluer DNA'et med 0,5 ml rent DNase/RNasefrit vand. DNA-koncentrationen måles, og der fremstilles 1 ml DNA-stamopløsninger (100 ng/μL). Beholderne opbevares med DNA ved 4 °C indtil yderligere brug.

3. Ekstraktion af silkefibroin og forberedelse af indledende materialer.

  1. Forbered en vandig opløsning af rekonstitueret silkefibroin (SF) protein fra Bombyx mori silkeormkokoner i henhold til proceduren beskrevet detaljeret andetsteds for at tegne sig for 10% af Silk-LiBr opløsning18.
  2. Den endelige koncentration af den vandige SF-opløsning bestemmes. Pipette 0,5 ml silkeopløsning til en 60 mm petriskål, lad den tørre ved 60 ° C, og mål vægten af tør silkefilm. Del tørvægten med 0,5 ml for at beregne vægten pr. volumenprocent.
  3. Fortynd den koncentrerede silkeopløsning med DNase/RNase-frit destilleret vand ved langsomt at tilsætte vand via serologisk pipette for at opnå 1 mg/ml slutkoncentration. Opbevar opløsningen ved 4 °C til fremtidig brug.
  4. Forbered fluorescerende mærket silkefibroin ved hjælp af et antistofmærkningssæt. Brug 1 ml 2 mg / ml silkefibroinopløsning til at koble de N-terminale α-aminogrupper af proteinet med et NHS-esteraktiveret derivatfarvestof i henhold til producentens protokol19.
  5. Der fremstilles 50 ml vandig polyethyleneimin (PEI) opløsning med en koncentration på 6 mg/ml, pH justeres til 4 med HCl (1 M). Opløsningen filtreres gennem en steril 0,2 μm membran. Opbevaring er mulig ved omgivelsesforhold i flere måneder.
  6. Forbered SiO2-kerner . Der pipetteres 300 μLSiO2-partikler i et 2 ml mikrocentrifugeglas. Mikropartiklerne vaskes to gange med 1 ml DNase/RNasefrit vand ved centrifugering ved 0,2 x g i 1 min.

4. Udfør lag-for-lag-aflejring af et primelag, DNA-plasmider og silkelag.

  1. For at deponere PEI-primelaget på SiO2-mikropartiklerne tilsættes 1 ml PEI-opløsning til den spundne pellet fra trin 3.6 og omrøres blandingen ved omgivelsesforhold på en termomixer ved 800 o / min i 15 min. Partiklerne vaskes fire gange med 1 ml DNase/RNasefrit deioniseret vand ved centrifugering ved 0,2 x g i 1 min.
  2. For at udføre aflejring af DNA-laget tilsættes 1 ml af den vandige opløsning af DNA-plasmider fra trin 2.7 til de PEI-grundede mikropartikler og omrøres forsigtigt blandingen ved 4 °C på en termomixer ved 800 rpm i 15 minutter. For at forberede mikrokapsler med forskellige DNA-belastninger skal du justere koncentrationen af DNA-plasmider fra 50-200 ng / μL ved hjælp af DNase/RNase-frit destilleret vand og bruge 1 ml af disse opløsninger til at deponere DNA'et. Mikropartiklerne opsamles ved centrifugering ved 0,2 x g i 1 min.
  3. Marker rørene til DNA-plasmider, der koder for theophyllin riboswitch kombineret med GFPa1 som ThyRS-GFPa1, og DNA-plasmider, der koder for Broccoli aptamer som BrocApt.
    BEMÆRK: Opbevar mikrocentrifugerørene med DNA på is.
  4. Supernatanten fjernes forsigtigt, og mikropartiklerne vaskes fire gange med 1 ml destilleret DNase/RNasefrit vand, hver gang supernatanten kasseres efter centrifugering ved 0,2 x g i 1 min. Udfør alle eksperimenter ved stuetemperatur (RT), medmindre andet er angivet.
  5. For at udføre afsætning af silkefibroinlaget tilsættes 1 ml af den rekonstituerede vandige SF-opløsning fra trin 3.3 til de DNA-adsorberede mikropartikler, hvirvler forsigtigt og omrører blandingen ved 10 °C på termomixeren ved 750 o / min i 15 minutter. Mikropartiklerne opsamles ved centrifugering ved 0,2 x g i 1 min ved 4 °C, supernatanten fjernes, og de vaskes derefter én gang med 1 ml destilleret DNase/RNasefrit vand. Centrifugeringen gentages, og supernatanten kasseres.
    BEMÆRK: Under eksperimentet skal opløsningen af silke opbevares på is for at undgå temperaturinduceret gelering.
  6. Behandl gradvist partiklerne med methanol for at inducere dannelse af β ark i silkeproteinstruktur. Tilsæt først 0,5 ml DNase/RNase-destilleret vand, hvirvl mikrocentrifugerøret, tilsæt derefter 0,5 ml 100% methanol. Ryst forsigtigt partiklerne på termomixeren ved 10 °C i 5 min. Partiklerne opsamles ved centrifugering ved 0,2 x g i 1 min. Supernatanten fjernes.
  7. Behandl partiklerne med methanol for at fremme dannelsen af β-ark og sikre stærk fysisk adsorption af silkelaget. Tilsæt 1 ml 100% methanol. Ryst forsigtigt partiklerne på termomixeren ved 750 o/min i 10 minutter ved 10 °C.
  8. Partiklerne opsamles ved centrifugering ved 0,2 x g i 1 min ved 4 °C og vaskes to gange med 1 ml DNase/RNasefrit destilleret vand hver gang, supernatanten kasseres og hvirvles forsigtigt ud inden næste centrifugering.
  9. Gentag trin 4.5-4.8 20 gange for at opnå silke flerlags kerneskalstrukturer. Til det sidste deponeringstrin skal du bruge fluorescerende mærket silke fra trin 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
  10. Udfør det sidste vasketrin, og opbevar mikropartiklerne i 1 ml DNase/RNasefrit destilleret vand ved omgivende forhold.
    BEMÆRK: For at undgå aggregering af partikler under aflejring af silkelag skal du udføre en visuel inspektion af partikelsuspensionen og pipette den op og ned ved hjælp af en 1 ml pipettespids for at fremme homogen partikelfordeling.
  11. Beregn antallet af DNA-plasmidkopier indkapslet i hver mikrokapsel, N-DNA ved hjælp af ligning 1:
    Equation 1 (1)
    Hvor N = 6, 769 × 1011 - antallet afSiO2-kerner , der anvendes til indkapsling. Det beregnes ud fra en standardkurve for kendte koncentrationer af silicapartikler ved anvendelse af serielle fortyndinger og absorption A 320 ved λ =320 nm;
    C- indledende koncentration af DNA anvendt til adsorption
    V- mængden af DNA, der anvendes til adsorption
    0.8- DNA-adsorptionseffektivitet på kernerne
    Mw- Molekylvægt af DNA-plasmid
    NA- Avogadros nummer (6.022 × 1023)

5. Opløsning af kerner for at opnå silkemikrokapsler.

  1. Der fremstilles 8% flussyreopløsning (HF), pH 5,5, ved fortynding af stamopløsning (48%) med destilleret vand. Anskaf et 50 ml centrifugerør. Afpipetter forsigtigt 5 ml HF og tilsæt 25 ml destilleret vand for at opnå 8% HF-opløsning.
    FORSIGTIG: HF er en stærkt ætsende syre og kan forårsage alvorlige forbrændinger i vævene. Der skal udvises ekstrem forsigtighed ved håndtering og anvendelse af HF til forsøgene. Overhold Standard Operating Procedure (SOP) for korrekt brug og håndtering af HF udviklet af organisationen for at undgå uønskede spildulykker. Brug ikke glasbeholdere til at fortynde HF-syre. Brug den kemiske hætte til at udføre dette trin i protokollen.
  2. SiO2-kernerne opløses ved tilsætning af 1,5 ml 8 % HF-opløsning til pelleterede mikropartikler med kerneskal fra trin 4.10. Hvirvel forsigtigt og lad kernerne opløses natten over ved omgivelsesforhold med let omrystning ved 450 o / min.
    BEMÆRK: For at undgå spild af HF skal du bruge podetape til at forsegle mikrocentrifugerøret. Brug en kemisk hætte til at udføre dette trin i protokollen.
  3. Forbered et 2 L glasbægerglas fyldt med 2 liter deioniseret vand. Overfør mikrokapselopløsning til dialyseapparater (50 kDa MWCO) og dialyser dem mod deioniseret vand med en gentagen vandforandring hver 3. time i de næste 3 dage.
    BEMÆRK: Supernatanten opsamles under de første tre vandudvekslinger, og opløsningen kasseres i henhold til den fastlagte protokol for materialer til farligt affald.
  4. Brug en 1 ml pipette til at overføre suspensionen fra dialyseapparater til nye 2 ml mikrocentrifugeglas til opsamling af mikrokapslerne.
    BEMÆRK: Opbevar de vandige opløsninger af mikrokapsler ved omgivelsesforhold i flere år.

6. Billeddannelse af silkefibroinmikrokapsler ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM).

  1. Udfør DNA-farvning ved hjælp af et DNA-farvestof.
    1. Overfør 300 μL hule silkefibroinmikrokapsler til et frisk 1 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 500 μL RNase/DNase-frit destilleret vand.
    2. Tilsæt 5 μL af DNA-farvningsfarvestoffet, kort hvirvel, og inkuber ved RT i 2 timer beskyttet mod lys.
    3. Der udføres fire vasketrin ved centrifugering ved 0,1 x g i 20 minutter ved 4 °C hver gang, idet 400 μL af supernatanten forsigtigt fjernes, og 400 μL RNase/DNasefrit destilleret vand genopfyldes.
  2. Udfør billeddannelse af silkekapsler på inverterede konfokale systemer udstyret med tre store lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm) ved hjælp af 100x olienedsænkningsmål (NA 1.49). Overfør 100 μL af kapselprøven til en enkelt brønd med 8-brønds kammerglas, lad kapslerne sedimentere i 20-30 minutter før billeddannelse.
    BEMÆRK: Farvestoffer er meget følsomme over for fotoblegning. Beskyt prøverne ved at dække diasene med aluminiumsfolie.

7. Estimering af permeabiliteten af hule mikrokapsler ved hjælp af molekylvægtsafskæringsmetoden (MWCO).

  1. Forbered 2 ml hver af FITC-mærkede dextranfluoroforopløsninger (20 μM, diH 2 O) med forskellige Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa og2MDa).
  2. Der pipetteres 100 μL af suspensionen af kapsler i et enkelt hul i et glasglas med kammer. Analyser hvert mikrokapseldesign (koncentration af PEI, indlæsningsantal DNA-plasmider, koncentrationen af silkefibroin og antallet af lag) separat.
  3. Til hvert hul tilsættes 300 μL af den specifikke fluoroforopløsning startende fra den laveste Mw op til den højeste, så hver brønd svarer til den specifikke fluoroforopløsning. Bland ved pipettering op og ned, og lad blandingen inkubere i 1 time ved RT, indtil diffusionen af fluoroforopløsninger når ligevægt.
  4. Overfør diaset til et konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM), og afbild hver brønd ved hjælp af 100x olienedsænkningsmål ved excitation λ = 488 nm.
    1. Identificer interesseområdet ved at justere brændplanet for at sikre, at kapslerne vises i form af cirkler med den største diameter. Dette sker typisk, når man ser prøverne tættere på bunden af brønden, når kapsler sediment på grund af tyngdekraften.
    2. Saml flere billeder af mikrokapselprøver ved at flytte diaset i XY-retning. Tag billeder for at tage højde for op til 100-150 kapsler for hver prøve.
    3. Brug ImageJ-software til at analysere permeabiliteten af kapslens membran i hver Mw fluoroforopløsning ved at sammenligne fluorescensintensiteter inden i og uden for kapslerne. For det skal du tegne et interesseområde (ROI) i form af en cirkel for at skitsere kapslens omkreds og klikke på Analyser / Mål for at måle fluorescensintensiteten indeni. Tabuler dataene i et regneark. Udfør denne operation for hver mikrokapsel for i alt 200-300 kapsler.
    4. Vurder den udvendige fluorescensintensitet på samme måde ved at skitsere ROI og måle intensiteten væk fra kapslerne. Udfør 3-5 målinger til statistisk analyse.
    5. For at udføre statistisk analyse skal du sammenligne fluorescensintensiteterne inden i og uden for kapslerne ved hjælp af parret t-test (p < 0,05).
    6. Brug konverteringstabel 2 til at estimere permeabiliteten af mikrokapsler baseret på de hydrodynamiske radier for FITC-Dextran med variabel Mw.

8. In vitro aktivering af syntetisk theophyllin riboswitch i silkemikrokapsler

  1. Forbered 1 ml theophyllinstamopløsning (100 mM, DMSO). Forbered E. coli S30 ekstraktsystem til cirkulært DNA ved at optø komponenterne på is i 40 min.
  2. Få et 0,5 ml DNase/RNase-frit mikrocentrifugerør. Der udføres in vitro-transkriptions-/translationsreaktion, og de cellefrie komponenter kombineres med en prøve af mikrokapsler i følgende rækkefølge (50 μL totalvolumen): S30-forblanding uden aminosyrer (20 μL); S30-ekstrakt, cirkulært (15 μL); komplet aminosyreblanding (5 μL); hule mikrokapsler indeholdende ThyRS-GFPa1-plasmider fra trin 4.10 (9 μL); og theophyllin, 100 mM DMSO (1 μL).
    BEMÆRK: Efter tilsætning af alle komponenter hvirvles røret kort og opsamles prøven under kortvarig centrifugering ved 0,2 × g i et par sekunder.
  3. Reglasset inkuberes ved 30 °C i 4 timer, og fluorescensen kontrolleres på en pladelæser ved hjælp af excitation ved λ = 488 nm og emission for GFP/FITC-filter (510 nm ± 20 nm).
  4. Afbild kapslerne på ethvert LCSM-system ved hjælp af 488 nm og 561 nm lasere. Få billeder af den bedste kvalitet ved hjælp af 100x olienedsænkningsmål og 8-brønds kammerdias.

9. In vitro-aktivering af broccoli-aptamer i silkemikrokapsler

  1. Forbered 1 ml stamopløsning af DFHBI-1T-farvestof (30 μM, diH2O). Forbered PURE (proteinsyntese ved hjælp af rekombinante elementer) cellefrit systemreaktionssæt ved at optø komponenterne på is i 40 minutter.
  2. Få et 0,5 ml DNase/RNase-frit mikrocentrifugerør. Der udføres in vitro-transkriptionsreaktion ved at kombinere cellefrie reaktionskomponenter med en prøve af mikrokapsler i følgende rækkefølge (50 μL totalvolumen): opløsning A (20 μL); opløsning B (15 μL); hule mikrokapsler indeholdende BrocApt plasmider fra trin 4.10 (14 μL); og DFHBI-1T-farvestof (1 μL).
    BEMÆRK: Efter tilsætning af alle komponenter hvirvles røret kort og opsamles prøven under kortvarig centrifugering ved 0,2 × g i et par sekunder.
  3. Reglasset inkuberes ved 37 °C i 6 timer, og fluorescensen kontrolleres på en pladelæser ved excitation ved λex = 470 nm og emission ved λem = 510 nm ± 20 nm.
  4. Afbild kapslerne på ethvert LCSM-system ved hjælp af 488 nm og 561 nm lasere. Få billeder i den bedste kvalitet ved hjælp af 100x olienedsænkningsmål og 8-brønds dækglaskammerglas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her behandler undersøgelsen funktionaliteten af DNA-skabeloner, der koder for forskellige sensordesign (to typer RNA-regulerede transkriptions- / oversættelseselementer) efter indkapsling i silkeproteinkapsler. Mikrokapsler blev fremstillet via skabelon Layer-by-Layer (LbL) samling af nøglekomponenterne: Et primlag, DNA-plasmider, der koder for sensordesign, og silkefibroinbiopolymer (figur 2). Aflejring af makromolekyler på en lagdelt måde gør det muligt at kontrollere kapselmembranens permeabilitet baseret på inter- og intramolekylære interaktioner mellem de absorberede lag og tykkelsen af skallen. Systemets justerbare permeabilitet gav mulighed for at kontrollere diffusionen af essentielle molekyler og samtidig begrænse diffusionen af store uønskede makromolekyler gennem kapselmembranen20.

Homogene i størrelse (4,5 μm) og robuste silkefibroinmikrokapsler med en skaltykkelse på ~ 500 nm (20 lag) i hydreret tilstand kan fremstilles, når protokollen følges korrekt (figur 3)21. LbL-tilgangen tillod at indstille belastningskapaciteten af DNA-skabeloner baseret på den indledende koncentration af plasmiderne. Den optimale DNA-belastning kan opnås ved at variere den indledende koncentration af DNA-skabeloner fra 50-200 ng/μL. Tabel 1 repræsenterer antallet af DNA-kopier, der opbevares i en enkelt mikrokapsel efter afslutning af LbL-indkapsling, og blev beregnet for hvert sensordesign baseret på de indledende DNA-koncentrationer og Mw af DNA-plasmider i henhold til ligning 1. Den optimale DNA-belastningskapacitet blev opnået med 32 og 20 DNA-kopier til henholdsvis ThyRS- og BrocApt-sensordesign. Vurderingen af belastningskapaciteten var vigtig for at få en nøjagtig estimering af de indkapslede DNA-koncentrationer for at kunne titrere den under IVTT-aktivering af sensorerne ved at tilføje mere koncentrerede kapselprøver.

Kapselskallernes permeabilitet kan systematisk analyseres ved at følge MWCO-metoden. Metoden estimerer porestørrelsen af membranen baseret på molekylvægten af opløste molekyler, der ikke kunne trænge gennem kapselmembranen. Ved at udsætte mikrokapsler for variable Mw fluoroformolekyler og udføre konfokal billeddannelse i brændplanet, der svarer til den største diameter på tværs af flere kapsler, kan permeabiliteten af skalmembranerne vurderes. ImageJ-analyse gør det muligt at estimere fluorescensintensiteterne inden for og uden for kapslerne og identificere fuldt gennemtrængelige (udvendige og indvendige fluoroforintensiteter var sammenlignelige), delvist permeable (50% -70% af kapslerne havde lavere fluorescens indeni sammenlignet med udenfor) og ikke gennemtrængelige (indvendig fluoroforintensitet var lavere sammenlignet med udvendig intensitet) membraner (figur 4). Omregning af Mw til hydrodynamisk radius for hver fluorofor gør det muligt at estimere kapselmembranens maskestørrelse (tabel 2).

Selektiv permeabilitet af proteinkapsler kan opnås under systematisk optimering af LbL-aflejringsprotokol ved anvendelse af variable koncentrationer af et primlag (fra 0-6 mg / ml), koncentrationen af et silkefibroin (fra 0,5-2 mg / ml) og antallet af deponerede lag (fra 10-25), indtil optimal permeabilitet opnås. I denne protokol blev optimal permeabilitet mellem 25-32 nm opnået med 6 mg / ml PEI som et primlag og 20 lag 1 mg / ml silkefibroin deponeret under LbL-samling (figur 4). Dette permeabilitetsområde var ideelt for komponenterne i IVTT-systemet at perkolere gennem kapselskallen. Typisk er de største molekylære komplekser i ethvert IVTT-system prokaryote ribosomale enheder, 30S og 50S, som, når de er bundet af mRNA i et ribosomalt kompleks, kan nå op til ~ 20 nm i størrelse22. Strukturen af de udviklede mikrokapselskaller ligner et stærkt sammenflettet netværk af silkefiberlag, der fysisk er tværbundet af β-arkblokke produceret under LbL-samling. Denne membranstruktur er semipermeabel: meget gennemtrængelig for små molekyler (f.eks. ioner, aminosyrer, peptider, sukkerarter osv.) og begrænset til store molekyler (f.eks. proteiner med høj molekylvægt, glycoproteiner, celler osv.), Der kun tillader perkolering af molekyler med en hydrodynamisk radius mindre end 25 nm. Derfor kan silkefibroinmikrokapsler med optimal DNA-belastning og membranpermeabilitet anvendes som bioreaktorbærere til IVTT-aktivering.

Transskriptionel og translationel aktivitet af ThyRS og BrocApt designsensorer kan testes ved hjælp af kommercielt tilgængelige IVTT-systemer. ThyRS kræver translationel aktivering af reportergenet i nærvær af theophyllinligand. Aktivering af syntetisk ThyRS involverer flere trin til initiering af genekspression, herunder mRNA-syntese, konformationsændring af mRNA-sekvens ved binding til analytten, frigivelse af ribosombindingsstedet og syntese af reporterens GFPa1-protein. Alle disse trin kræver fri diffusion af IVTT-komponenterne gennem kapselmembranen. Det foreslåede design af DNA-belastede silkefibroinmikrokapsler forbedrede aktiveringsparametrene for RNA-regulerede sensordesign: Både ekspressionskinetikken og fluorescensudgangen var signifikant højere sammenlignet med det frie ikke-immobiliserede DNA (figur 5A). CLSM-billeddannelsen bekræftede også vellykket GFPa1-genaktivering i kapsler fyldt med DNA-plasmider, der koder for ThyRS-sekvenser (figur 5B-D).

Alternativt blev aktiveringen af BrocApt sensordesign udført i IVTT-systemet, der understøtter T7 E. coli-promotorkoblet transkription/oversættelse i nærvær af DHFBI-1T-farvestof . Fluorescensoutputtet blev initieret ved binding af det fluorogene farvestof til mRNA-sekvensen. Det er vigtigt, at udgangssignalet fra silkemikrokapsler var flere gange højere sammenlignet med ikke-indkapslede DNA-prøver med ækvivalente koncentrationer (figur 6). Derfor kan silkefibroinmikrokapsler bevare den væsentlige funktionalitet af DNA-kodede sensorelementer, hvilket kan være vigtigt for design af nye typer in vitro-biosensorplatforme til hurtig og følsom påvisning af analysander af interesse.

Figure 1
Figur 1: Plasmidkort og sekvens af pSALv-RS-GFPa1 . (A) Plasmidet indeholder theophyllin riboswitch (ThyRS) sekvens placeret opstrøms for GFPa1 kodende gen under kontrol af ptac promotor, β-lactamase (bla) kodende gen ansvarlig for resistens over for ampicillin. (B) Ptac-promotorsekvensen er vist med fed skrift og understreget. theophyllin riboswitch sekvens er vist med fed kursiv; GFPa1-kodningssekvens vises med fed skrift; Sekvenser af begrænsningswebsteder er understreget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over fremstillingen af mikrokapsler ved hjælp af lag-for-lag-metoden. UberørteSiO2-kerner blev først funktionaliseret med PEI-polymer efterfulgt af sekventiel aflejring af DNA-plasmider, der koder for forskellige sensordesign og silkefibroinlag, indtil det ønskede antal silkeproteinlag er blevet adsorberet. Hule uberørte mikrokapsler, der indeholder forskellige DNA-sensordesign, kan fremstilles ved at opløse offerkerner. Aktivering af hvert biosensordesign indkapslet i mikrokapslen kan opnås under IVTT-reaktioner i nærvær af tilsvarende ligander. Denne figur er genoptrykt fra Drachuk, I. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Mikroskopiundersøgelser for DNA-belastede mikrokapsler. (A) Tværsnits-2D og (B) Gengivne 3D-konfokale mikroskopibilleder af hule (SF)20 mikrokapsler fyldt med DNA-plasmider, der koder for ThyRS (32 DNA-kopier/kapsel) og fremstillet af 6 mg/ml PEI-grundede SiO2-kerner. Autofluorescens fra silkefibroinkapsler (DAPI-kanal, blå) og farvet DNA (FITC-kanal, grøn) blev påført for at identificere lokaliseringen af DNA-plasmider og estimere kapselmembrantykkelsen. Indsat i (A) repræsenterer intensitetsprofiler for DNA- og silkefibroinskaller på tværs af kapslen. Vægtstang: 2 μm. Indsat i (B) repræsenterer intensitetsprofilen for silkeprotein på tværs af kapselskallen. Membrantykkelsen blev målt som længden ved halv intensitetstop. Behandling af tværsnitsbilleder og 3D-gengivelse blev udført ved hjælp af NIS-billedbehandlingssoftware på Nikon C2+-systemet. Denne figur er genoptrykt fra Drachuk, I. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Estimering af membranpermeabiliteten for silkemikrokapsler ved hjælp af MWCO-metoden. Selektive CLSM-repræsentative fluorescerende billeder af hule silkefibroinmikrokapsler udsat for FITC-Dextran-opløsninger af forskellige Mw (20 μM, diH2O). Kapsler blev fremstillet med et andet antal lag og PEI-koncentrationer. En stigning i koncentrationen af et primlag fører til øget kolloid stabilitet af mikrokapsler med mere gennemtrængelige skaller, mens eliminering af primlaget forårsager aggregering af kapsler med mindre gennemtrængelige skalmembraner. Skalabjælke: 5 μm. Denne figur er genoptrykt fra Drachuk, I. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Aktivering af ThyRS sensor design i silkefibroin mikrokapsler. (A) Kinetik for GFPa1-ekspression under ThyRS-aktivering fra DNA-plasmider indlæst i 20-lags SF-mikrokapsler (rødfarvede linjer) og kontrol ikke-indkapslet DNA (blåfarvede linjer). Fra top til bund var DNA-koncentrationerne i et prøvevolumen (50 μL) 6,5 ng/μL, 4,5 ng/μL, 2,5 ng/μL og 0 ng/μL og svarer til ændringerne i farveintensiteter. (B) CLSM-billeder af silkefibroinkapsler fyldt med 32 DNA-kopier pr. kapsel. Skalabjælke: 5 μm. (C) Billedet svarer til tværsnitsintensitetsprofiler svarende til billede (B) på tværs af to kapsler (hvid linje i B). Den røde linje repræsenterer silkekapsler, og den grønne linje repræsenterer GFPa1 udtrykt i kapsler. (D) Billedet repræsenterer gengivne 3D-silkekapsler fyldt med 32 kopier af DNA efter inkubation i IVTT-systemet. Grøn fluorescens svarer til GFPa1-signalet, og rød fluorescens svarer til fluorescerende mærkede silkelag. Vægtstang: 2 μm. ThyRS-aktivering blev udført med theophyllin (2 mM, DMSO) under inkubation af mikrokapsler i IVTT-systemet (S30-ekstrakt). Denne figur er genoptrykt fra Drachuk, I. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Aktivering af BroccApt i silkefibroin mikrokapsler. Sammenligning af transkriptionskinetik blev udført for 20-lags silkemikrokapsler fyldt med 30 DNA-kopier pr. Kapsel (rødfarvede linjer) og kontrol ikke-indkapslet DNA (blåfarvede linjer). Fra top til bund var koncentrationerne af indkapslet DNA i en prøve: 3,6 ng/μL, 2 ng/μL, 1 ng/μL og 0 ng/μL og svarer til ændringerne i farveintensiteter. Koncentrationerne af ikke-indkapslet DNA var: 20 ng/μL, 10 ng/μL, 5 ng/μL og 0 ng/μL og svarer til ændringerne i farveintensiteter. Aktivering blev udført med DHBFI-1T (100 μM, diH2O) under inkubation i det PURE cellefrie system. Denne figur er genoptrykt fra Drachuk, I. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.

Design af DNA-sensor Indledende DNA-koncentration (ng/μL) Antal DNA-kopier pr. kapsel (DNA/kapsel)
50 16
ThyRS 100 32
150 48
200 64
50 10
BrocApt 100 20
150 30
200 40

Tabel 1: DNA-kopinummer pr. kapsel for hvert DNA-design. Kopinummeret blev beregnet i henhold til ligning 1 og var korreleret med den oprindelige koncentration af DNA-plasmider, retentionsaffinitet af DNA-sekvenser under LbL-aflejringsprocessen og længden af DNA-plasmider.

Mw af FITC-Dextran (kDa) Hydrodynamisk radius (nm)
4 1.4
20 3.3
40 4.5
70 6
150 8.5
250 10
500 14
2,000 18

Tabel 2: Fysiske egenskaber af FITC-dextrans. Hydrodynamisk radius for hver fluorofor blev brugt til at estimere permeabiliteten af hule silkefibroinmikrokapsler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selektivt permeable hydrogelmikrokapsler fyldt med forskellige typer DNA-kodede sensordesign kan fremstilles efter denne protokol. Et af de karakteristiske træk ved LbL-tilgangen er evnen til at skræddersy kompleksiteten af mikrokapsler under bottom-up-samlingen, som normalt starter med adsorption af molekylære arter på offerskabeloner. Ved omhyggeligt at justere koncentrationerne af de oprindelige komponenter, pH-betingelser og antallet af lag kan mikrokapsler med forskellige DNA-belastningsparametre, funktionalitet og justerbar permeabilitet fremstilles23. For at forstærke kapslernes alsidighed kan der opnås yderligere funktionalisering af skaloverfladen med AuNP'er og IgG for at implementere biokompatible sensorbærere til in vivo-diagnostik . Begge disse alternative ruter er afhængige af den unikke molekylære struktur af silkefibroinet. In situ reduktion af Au3+ ioner kan opnås på grund af tilstedeværelsen af tyrosinrester (5,3% mol.), der er i stand til at reducere metalioner i nærvær af en optimal reduktionsbuffer. Konjugering af specifikke antistoffer mod overfladen af AuNPs-funktionaliserede proteinmikrokapsler kan ske via implementering af carbodiimidaktiveringskemi. Begge disse trin kræver omhyggelig udvikling og optimering af protokollen for at opnå den korrekte funktionalitet af biosensorkapslerne til fremtidige applikationer. For eksempel at bruge disse mikrokapsler som "smarte" leveringssystemer, hvor en molekylær last leveres ved specifikke stimuli (som pH eller kemiske signaler), skal specifikke egenskaber ved disse kapsler karakteriseres og indstilles, herunder leveringseffektivitet, retentionstid, administrationsvej og sygdomsmodelbehandlinger.

De DNA-belastede mikrokapsler var kendetegnet ved CLSM-teknikken og fluorescensmålinger. Imidlertid kan andre karakteriseringsmetoder såsom atomkraftmikroskopi (AFM), kryogen elektrontomografi (CEM) og direkte stokastisk rekonstruktion superopløsningsmikroskopi (dSTORM) anvendes til at differentiere specifikke strukturer af mikrokapslerne, herunder individuelle fibre, nanodomæner og lokalisering af DNA-plasmider24,25,26.

Den udviklede protokol fremhæver brugen af silkefibroin biopolymer som et biokompatibelt netværksmateriale, der bevarer den tertiære struktur af indlæste DNA-plasmider. Stabiliteten af immobiliserede DNA-sekvenser inden for silkefibroinnetværket sker via hydrofobe interaktioner og / eller hydrogenbinding, som giver et beskyttende mikromiljø mod pH-inaktivering, oxidation eller hydrolyse27. Derudover giver de β-krystallinske domæner af silkefibroin en unik mekanisk barriere, der begrænser bevægelsen af indesluttede makromolekyler og forhindrer DNA-plasmider i nedbrydning under opbevaring i vandige opløsninger.

Den semipermeable karakter af silkefibroinmikrokapsler fyldt med DNA-skabeloner skabte unikke rumlige og fysisk-kemiske betingelser for IVTT-reaktionerne. Transskriptionelt og translationelt aktiverede RNA-aptamer og riboswitch immobiliseret i silkefibroinmikrokapsler var i stand til at producere et udgangssignal, der var mindst tre gange højere sammenlignet med frie ikke-immobiliserede sensorer. Derudover kan immobiliseringen af DNA-skabeloner i mikrokapsler betydeligt forbedre aktiviteten af indkapslede sensorer ud over detektionsgrænsen for ikke-indkapslede. Mens ikke-indkapslede sensorer havde et minimalt respons ved lave DNA-koncentrationer, havde de indkapslede sensorer et meget tydeligt outputrespons, som let kan titreres for at afspejle de subtile ændringer i DNA-koncentrationer. Det forbedrede responssignal fra indkapslede reportere skyldtes sandsynligvis ubegrænset diffusion af komponenterne i IVTT-maskiner og nedsat mobilitet af DNA-plasmider. Flere undersøgelser har erkendt, at udbyttet af proteinsyntese i cellefrie reaktioner er afhængigt af det makromolekylære miljø28,29. Immobilisering af DNA-plasmider i silkenetværk tilvejebragte et effektivt begrænset miljø, der begrænsede oligonukleotiders bevægelse og accelererede transkriptions- / oversættelsesmekanismereaktioner selv fra flere DNA-kopier21.

Mens LbL-metoden giver en meget alsidig tilgang til at konstruere multifunktionelle samlinger på en kontrollerbar måde, er fremstillingsproceduren relativt tidskrævende og kræver typisk behandlingsjusteringer for at opskalere mikrokapslernes udbytte. En anden overvejelse ved fremstilling af biomolekylebaserede mikrokapsler er kompatibiliteten af et givet system med kravet om kerneopløsning, efter at LbL-aflejring er afsluttet. For at producere homogene i størrelse og robuste hule silkebaserede DNA-belastede mikrokapsler blev skallerne indtil videre deponeret på offersilica (SiO2) kerneskabeloner, hvilket krævede efterfølgende fjernelse ved flussyre (HF) ætsning. Håndtering eller ætsning af HF betragtes heller ikke som biokompatible processer, hvilket begrænser deres udbredte anvendelse i praktiske anvendelser. Alternativet tilSiO2 uorganiske kolloide skabeloner, karbonatkerner er typisk inerte til dannelse af komplekser med polymerlag og kan opløses under milde forhold under anvendelse af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Justering af offerkerner kan dog påvirke aflejringsegenskaberne for flerlag og integriteten af skalstrukturen, hvilket kræver yderligere optimering af protokollen.

Sammenfattende tillader den nuværende protokol fremstilling af silkebaserede DNA-belastede mikrokapsler med forskellige sensordesign. Kombinationen af et begrænset mikromiljø tilvejebragt ved LbL-metoden og brugen af silkefibroin som et biokompatibelt materiale forbedrede sensoregenskaberne af indkapslet DNA. Med den hurtige udvikling af fluorogen RNA-aptamerteknologi kan den potentielle anvendelse af DNA-belastede silkemikrokapsler udvides til multiplekset in vitro-diagnostik. For nylig er flere variationer af RNA-baserede fluorescerende aptamerer dukket op som kraftfuld baggrundsfri teknologi til billeddannelse af RNA i levende celler med høj signal-støj-forholdsfølsomhed30,31. Ved at anvende syntetisk RNA-nanoteknologi til at designe kunstige RNA-aptamerer kan aptamerers fluorogene egenskaber udnyttes til at detektere specifikke ligander af interesse. Denne teknologi vil være særlig værdifuld til overvågning af biomarkører af interesse i forskellige formater, herunder papirbaserede sensorer på brugsstedet, hydrogelbaserede plastre til sved eller interstitiel væske og implanterbare materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De synspunkter og meninger, der præsenteres heri, er forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis synspunkterne fra DoD eller dets komponenter

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af LRIR 16RH3003J-bevilling fra Air Force Office of Scientific Research samt Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programmet fra US Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering.

Plasmidvektorsekvensen for ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) blev generøst leveret af Dr. J. Gallivan. Silkeormskopuder fra Bombyx mori blev generøst doneret af Dr. D.L. Kaplan fra Tufts University, MA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) Lucerna DFHBI-1T
5x T4 DNA Ligase Buffer ThermoFisher Scientific 46300-018
6x Blue Gel Loading Dye New England BioLabs B7021S
96-well plates, black circular Corning 3601
Agarose Sigma-Aldrich A9539 BioReagent, for molecular biology, low EEO
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture
BlpI restriction enzymes New England BioLabs R0585S
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems FisherScientific 09-761-1
Dimethyl sulfoxide, DMSO Sigma-Aldrich 472301 ACS reagent, ≥99.9%
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. Addgene Plasmid #66788
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) ThermoFisher Scientific 84530
E. coli S30 extract system for circular DNA Promega L1020
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL FisherScientific 14-959-53A
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL 14-432-22
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL FisherScientific 05-408-129
Hydrofluoric acid, HF Sigma-Aldrich 695068 ACS reagent, 48%
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C
KpnI restriction enzymes New England BioLabs R0142S
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin Sigma-Aldrich L5667 pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin Sigma-Aldrich L0543 pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin
LB broth (Lennox grade) Sigma-Aldrich L3022
Lithium bromide, LiBr Sigma-Aldrich 213225 ReagentPlus, ≥99%
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain ThermoFisher Scientific 18258012
Methanol MilliporeSigma 322415 anhydrous, 99.8%
MilliQ-water EMD MilliPore Milli-Q Reference Water Purification System
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC Sigma-Aldrich E1769
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific 10010023 1x PBS, pH 7.4
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Polyethylenimine, branched Sigma-Aldrich 408727 average Mw ~25,000
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit New England BioLabs E6800S
QIAEX II Gel Extraction Kit Qiagen 20021
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen  27104
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) New England BioLabs N0469S
SiO? silica microspheres, 4.0 µm Polysciences, Inc. 24331-15 10% aqueous solution
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL ThermoFisher Scientific 87724
Sodium carbonate, Na?CO? Sigma-Aldrich 222321 ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices FisherScientific 08-607-008 Spectrum G235058
SYBR Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
T4 DNA Ligase (5 U/µL) ThermoFisher Scientific EL0011
Theophylline Sigma-Aldrich T1633 anhydrous, ≥99%, powder
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) Sigma-Aldrich T6025 Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water FisherScientific 10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit ZymoResearch D4202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  2. Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
  3. König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
  4. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
  5. Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
  6. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  7. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  8. Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
  9. Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
  10. Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
  11. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
  12. Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
  13. Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
  14. Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
  16. Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
  17. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
  18. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
  19. Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
  20. Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
  21. Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
  22. Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
  23. Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
  24. Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
  25. Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
  26. Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
  27. Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
  28. Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
  29. Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
  30. Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
  31. Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 176
Fremstilling af multifunktionelle silkebaserede mikrokapsler fyldt med DNA-plasmider, der koder for RNA-aptamerere og ribotekser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drachuk, I., Harbaugh, S.,… More

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches. J. Vis. Exp. (176), e62854, doi:10.3791/62854 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter