Summary
Protokollen beskriver dannelsen av robuste og biokompatible DNA-ladede mikrokapsler som multipleksede in vitro biosensorer som er i stand til å spore flere ligander.
Abstract
Vi introduserer en protokoll for fremstilling av DNA-lastede silkefibroinmikrokapsler via Layer-by-Layer (LbL) monteringsmetode på offersfæriske kjerner. Etter adsorpsjon av et primærlag og DNA-plasmider ble dannelsen av robuste mikrokapsler lettere ved å indusere β-ark i silkens sekundærstruktur under akutt dehydrering av et enkelt silkelag. Derfor skjedde lagdelingen via flere hydrogenbindinger og hydrofobe interaksjoner. Ved adsorpsjon av flerlagsskall kan kjerneskallstrukturene funksjonaliseres ytterligere med gullnanopartikler (AuNP) og / eller antistoffer (IgG) som skal brukes til fjernmåling og / eller målrettet levering. Justering av flere nøkkelparametere under sekvensiell avsetning av viktige makromolekyler på silikakjerner som tilstedeværelsen av en polymerprimer, konsentrasjonen av DNA og silkeprotein, samt en rekke adsorberte lag, resulterte i biokompatible, DNA-ladede mikrokapsler med variabel permeabilitet og DNA-belastninger. Ved oppløsning av silikakjerner demonstrerte protokollen dannelsen av hule og robuste mikrokapsler med DNA-plasmider immobilisert til kapselmembranens indre overflate. Å skape en selektivt permeabel biokompatibel membran mellom DNA-plasmidene og det ytre miljø bevarte DNA under langvarig lagring og spilte en viktig rolle i den forbedrede utgangsresponsen fra romlig begrensede plasmider. Aktiviteten til DNA-maler og deres tilgjengelighet ble testet under in vitro transkripsjon og translasjonsreaksjoner (cellefrie systemer). DNA-plasmider som koder for RNA light-up aptamere og riboswitcher ble vellykket aktivert med tilsvarende analytter, som ble visualisert under lokalisering av fluorescerende merkede RNA-transkripter eller GFPa1-protein i skallmembranene.
Introduction
Feltet syntetisk biologi gir unike muligheter til å utvikle sensing evner ved å utnytte naturlige mekanismer utviklet av mikroorganismer for å overvåke deres miljø og potensielle trusler. Det er viktig at disse sensingmekanismene vanligvis er knyttet til et svar som beskytter disse mikroorganismer mot skadelig eksponering, regulerer genuttrykk for å redusere negative effekter eller forhindre inntak av giftige materialer. Det har vært betydelig innsats for å konstruere disse mikroorganismene for å skape helcellesensorer som utnytter disse naturlige responsene, men omdirigerer dem til å gjenkjenne nye mål og / eller å produsere et målbart signal som kan måles for kvantifiseringsformål (typisk fluorescens) 1,2. For tiden er bekymringer med bruk av genetisk modifiserte mikroorganismer (GMO), spesielt når de slippes ut i miljøet eller menneskekroppen, på grunn av lekkasje av hele celler eller noe av deres genetiske materiale, selv om de er innkapslet i en polymermatrise, at alternative måter å utnytte disse sensing-tilnærmingene er nødvendig3.
En kraftig tilnærming for å utnytte fordelene med mikroorganismebasert sensing uten bekymring for distribusjon av GMO, er bruk av in vitro transkripsjon / oversettelse (IVTT) systemer. Fra et praktisk perspektiv består IVTT-systemer av en blanding som inneholder de fleste cellekomponentene i en aktiv tilstand som har blitt "ekstrahert" fra celler på forskjellige måter, inkludert sonikering, perleslag eller andre4. Det endelige produktet av denne prosessen er en biokjemisk reaksjonsblanding som allerede er optimalisert for å utføre transkripsjon og oversettelse som kan brukes til å teste forskjellige sensorer i et "åpent fartøy" -format, uten begrensninger forbundet med bruk av hele celler (membrandiffusjon, transformasjonseffektivitet, celletoksisitet, etc.). Det er viktig at forskjellige sensorkomponenter kan legges kvantitativt til, og deres effekt studeres ved forskjellige optiske og spektrometriske teknikker, som vi har demonstrert5. Det har blitt lagt merke til at ytelsen til IVTT-systemer kan være inkonsekvent; Nylige studier har imidlertid vist tilnærminger for å standardisere deres forberedelse og karakterisering, noe som er til stor hjelp når man studerer ytelsen i sensordesign6. Nylig har mange eksempler på IVTT-systemer som brukes til å lage papirbaserte analyser gjennom lyofilisering av komponentene i papirmatriser, blitt demonstrert, inkludert påvisning av tungmetallioner, stoffer, quorumsfølende elementer og andre 7,8,9. Et spennende bruksområde for IVTT-baserte sensorer er deres bruk i sensorapplikasjoner i forskjellige typer miljøer, inkludert jord, vann og menneskekroppen. For å distribuere disse IVTT-systemene til disse utfordrende miljøene, må en innkapslingsmetode implementeres for å inneholde IVTT-komponentene og beskytte dem mot nedbrytning.
De vanligste innkapslingsmetodene for IVTT-systemer inkluderer bruk av lipidkapsler, miceller, polymersomer og andre tett lukkede mikrobeholdere10,11,12. En ulempe med denne tilnærmingen er behovet for å innlemme enten passive eller aktive mekanismer for å transportere materialer inn og ut av beholderne for å tillate kommunikasjon med det ytre miljø og gi sensing evner. For å overvinne noen av disse problemene, rapporterer studien her en metode som gir en enkel, men effektiv tilnærming til å kapsle inn kodingsmaterialene for forskjellige sensordesign som skal uttrykkes i IVTT-systemer. Denne tilnærmingen er basert på bruk av lag-for-lag (LbL) avsetning av en biopolymer i nærvær av plasmider av interesse for å skape hule mikrokapsler med høy porøsitet, noe som gjør at det beskyttede genetiske materialet kan interagere med de forskjellige komponentene i IVTT av valg. Studien viste at innkapslede plasmider kunne lede transkripsjon og oversettelse når de ble aktivert i denne polymere matrisen, som vist med responsen av en plasmidkodet aptamer og en riboswitch til deres tilsvarende mål. I tillegg beskytter dette LbL-belegget plasmidene i flere måneder uten spesielle lagringsforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruksjon av plasmidvektor.
- Konstruere en plasmidvektor (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) ved forsterkning av kodesekvensen til en teofyllin-riboswitch (ThyRS) koblet med GFPa1 fra pJ201: 23976-RS-GFPa1-vektor (designet og opprettet av DNA2.0) og innsetting i E. coli-ekspresjonsvektor, pSAL13. Bruk fremover (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') og omvendt (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') primere for å forsterke kodingssekvensen til ThyRS kombinert med GFPa1 og utføre en PCR-reaksjon i 50 μL volum ved bruk av DNA-polymerase i henhold til produsentens protokoll14.
- Forbered en 1% agarosegel fra 0,5 g agarose, 50 ml TAE-buffer (40 mM Tris Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) og 3 μL DNA-flekk.
- Bland 5 μL alikot av det PCR-forsterkede produktet med 5 μL RNase / DNase-fritt vann og 2 μL 6x gellastingsfargestoff og analyser ved agarosegelelektroforese. Legg inn en DNA-stige (0,1-10,0 kb) som referanse. Kjør gelen på 120 V til fargelinjen nesten har nådd bunnen av gelen.
- Visualiser DNA-fragmentene ved hjelp av et UV-transilluminatorbildesystem for å sjekke om riktig størrelse på DNA15.
- Rens PCR-produktet ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til produsentens protokoll16.
- Fordøy PCR-produktet og pSAL-ekspresjonsvektoren med KpnI- og BlpI-restriksjonsenzymer i en 15 μL-reaksjon, inneholdende 10 μL PCR-produkt eller plasmidvektor (konsentrasjon 20-50 ng/μL), 1,5 μL 10x enzymbuffer, 1 μL av hvert enzym og 1,5 μL RNase/DNase-fritt vann, ved 37 °C i 2 timer.
- Tilsett 3 μL 6x gellastende fargestoff til reaksjonsblandingen og separer de fordøyede fragmentene på en 1% agarosegel som beskrevet i trinn 1.3-1.5.
- Rens DNA-fragmentene ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll16.
- Ligat det fordøyde PCR-produktet til en fordøyd linearisert plasmidvektor, pSAL, ved bruk av T4 DNA-ligase og supplert ligasebuffer i en 10 μL-reaksjon inneholdende 3-20 fmol av den fordøyede vektoren, 9-60 fmol av det fordøyde PCR-produktet, 2 μL ligasebuffer, 1 μL (1 enhet) T4 DNA-ligase og DNase / RNase-fritt vann. Inkuber ligeringsreaksjonen ved 25 °C i 3 timer.
MERK: Sørg for at det totale DNA-innholdet i reaksjonsblandingen er 0,01-0,1 μg. - Transformer E. coli DH5a-kompetente celler med 10 ng av ligeringsreaksjonsblandingen i henhold til produsentens protokoll17.
- Dyrk de transformerte cellene ved 37 °C over natten på LB-agarplater tilsatt ampicillin (100 μg/ml).
- Plukk 3-4 bakteriekolonier fra platen og overfør hver av dem aseptisk til 5 ml LB-medier supplert med ampicillin (100 μg / ml). Dyrk kulturene over natten ved 37 °C i en ristende inkubator ved 225 o / min.
- Pellet nattkulturene ved sentrifugering ved 11 x g i 3 min ved romtemperatur.
- Bruk et rensesett for å rense plasmidene i henhold til produsentens protokoll16.
- Bekreft sekvensene av de rensede plasmidene ved DNA-sekvensering. Plasmidkartet og sekvensen av den resulterende konstruksjonen (pSALv-RS-GFPa1) er vist i figur 1.
2. Storskala DNA-rensing.
- Transformer plasmidvektoren pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (som koder for teofyllin riboswitch kombinert med GFPa1 reportergen) eller pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (koding av brokkoliaptamer) til E. coli DH5α kompetente celler i henhold til produsentens protokoll17.
- Dyrk de transformerte cellene ved 37 °C over natten på LB-agarplater supplert med ampicillin (100 μg / ml) for celler transformert med pSALv-RS-GFPa1 eller kanamycin (50 μg / ml) for celler transformert med pET28c-F30-2x brokkoli.
- Plukk 3-4 bakteriekolonier fra platen og overfør aseptisk hver koloni til 5 ml LB-medier supplert med passende antibiotika (100 μg / ml ampicillin eller 50 μg / ml kanamycin). Dyrk kulturene over natten ved 37 °C i en ristende inkubator ved 225 o / min.
- Bruk 3 ml av nattens kultur for å inokulere i 150 ml LB supplert med passende antibiotika (100 μg / ml ampicillin eller 50 μg / ml kanamycin) og dyrk kulturen over natten ved 37 ° C i en ristende inkubator ved 225 rpm.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved ≥3400 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Bruk et rensesett for å rense plasmidene i henhold til produsentens protokoll16.
- Elute DNA med 0,5 ml rent DNase/RNase-fritt vann. Mål DNA-konsentrasjonen og klargjør 1 ml DNA-stamløsninger (100 ng/μL). Oppbevar tubene med DNA ved 4 °C inntil videre bruk.
3. Ekstraksjon av silkefibroin og tilberedning av innledende materialer.
- Tilbered en vandig oppløsning av rekonstituert silkefibroin (SF) protein fra Bombyx mori silkeormkokonger i henhold til prosedyren beskrevet i detalj andre steder for å utgjøre 10% av Silk-LiBr oppløsning18.
- Bestem den endelige konsentrasjonen av den vandige SF-oppløsningen. Pipett 0,5 ml silkeoppløsning til en 60 mm petriskål, la den tørke ved 60 °C og mål vekten av tørr silkefilm. Del tørrvekten med 0,5 ml for å beregne vekten per volumprosent.
- Fortynn den konsentrerte silkeoppløsningen med DNase/RNase-fritt destillert vann ved langsomt å tilsette vann via serologisk pipette for å oppnå 1 mg/ml endelig konsentrasjon. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C for fremtidig bruk.
- Forbered fluorescerende merket silkefibroin ved hjelp av et antistoffmerkingssett. Bruk 1 ml 2 mg / ml silkefibroinløsning for å koble de N-terminale α-aminogruppene av proteinet med et NHS esteraktivert derivatfargestoff i henhold til produsentens protokoll19.
- Klargjør 50 ml polyetylenimin (PEI) vandig oppløsning med en konsentrasjon på 6 mg/ml, juster pH til 4 med HCl (1 M). Filtrer løsningen gjennom en steril 0,2 μm membran. Lagring er mulig ved omgivelsesforhold i flere måneder.
- Forbered SiO2-kjerner . Pipette 300 μL SiO 2-partikler inn i et2 ml mikrosentrifugerør. Vask mikropartiklene to ganger med 1 ml DNase/RNase-fritt vann ved sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min.
4. Utfør lag-for-lag-avsetning av et primlag, DNA-plasmider og silkelag.
- For å deponere PEI-primærlaget på SiO 2-mikropartiklene, tilsett 1 ml PEI-oppløsning til den spunnet ned pelleten fra trinn 3.6 og beveg blandingen ved omgivelsesforhold på en thermomixer ved 800 o / min i 15 minutter. Vask partiklene fire ganger med 1 ml DNase/RNase-fritt avionisert vann ved sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min.
- For å utføre avsetning av DNA-laget, tilsett 1 ml av den vandige oppløsningen av DNA-plasmider fra trinn 2,7 til de PEI-primede mikropartiklene og beveg blandingen forsiktig ved 4 °C på en termomikser ved 800 o / min i 15 minutter. For å forberede mikrokapsler med forskjellige DNA-belastninger, juster konsentrasjonen av DNA-plasmider fra 50-200 ng / μL ved bruk av DNase / RNase-fritt destillert vann og bruk 1 ml av disse løsningene for å deponere DNA. Samle mikropartiklene ved sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min.
- Merk rørene for DNA-plasmider som koder for teofyllin riboswitch kombinert med GFPa1 som ThyRS-GFPa1, og DNA-plasmider som koder for brokkoli-aptamer som BrocApt.
MERK: Oppbevar mikrosentrifugerørene med DNA på is. - Fjern supernatanten forsiktig og vask mikropartiklene fire ganger med 1 ml DNase/RNase-fritt destillert vann, hver gang supernatanten kastes etter sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min. Utfør alle eksperimenter ved romtemperatur (RT) med mindre annet er spesifisert.
- For å utføre avsetning av silkefibroinlaget, tilsett 1 ml av den rekonstituerte vandige SF-løsningen fra trinn 3,3 til de DNA-adsorberte mikropartiklene, virvel forsiktig og beveg blandingen ved 10 °C på thermomixeren ved 750 o / min i 15 minutter. Samle mikropartiklene ved sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min ved 4 °C, fjern supernatanten og vask dem deretter én gang med 1 ml DNase/RNase-fritt destillert vann. Gjenta sentrifugeringen og kast supernatanten.
MERK: Under forsøket, hold løsningen av silke på is for å unngå temperaturindusert gelering. - Behandle partiklene gradvis med metanol for å indusere β-arkdannelse i silkeproteinstruktur. Tilsett først 0,5 ml DNase / RNase destillert vann, virvel mikrosentrifugerøret, tilsett deretter 0,5 ml 100% metanol. Rist forsiktig partiklene på thermomixeren ved 10 °C i 5 minutter. Samle partiklene ved sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
- Behandle partiklene med metanol for å fremme dannelsen av β-ark og sikre sterk fysisk adsorpsjon av silkelaget. Tilsett 1 ml 100% metanol. Rist forsiktig partiklene på thermomixeren ved 750 o / min i 10 minutter ved 10 °C.
- Samle partiklene ved sentrifugering ved 0,2 x g i 1 min ved 4 °C og vask dem to ganger med 1 ml DNase/RNase-fritt destillert vann hver gang, kast supernatanten og virvler forsiktig før neste sentrifugering.
- Gjenta trinn 4,5-4,8 20 ganger for å få flerlags kjerneskallstrukturer i silke. For det siste avsetningstrinnet, bruk fluorescerende merket silke fra trinn 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
- Utfør det siste vasketrinnet og oppbevar mikropartiklene i 1 ml DNase/RNase-fritt destillert vann ved omgivelsesforhold.
MERK: For å unngå aggregering av partikler under avsetning av silkelag, utfør en visuell inspeksjon av partikkelsuspensjonen og pipetter den opp og ned ved hjelp av en 1 ml pipettespiss for å fremme homogen partikkelfordeling. - Beregn antall DNA-plasmidkopier innkapslet i hver mikrokapsel, NDNA ved hjelp av ligning 1:
(1)
Hvor N = 6.769 × 1011 - antall SiO2-kjerner som brukes til innkapsling. Beregn det fra en standardkurve for kjente konsentrasjoner av silikapartikler ved bruk av serielle fortynninger og absorpsjon A 320 ved λ =320 nm;
C- innledende konsentrasjon av DNA brukt til adsorpsjon
V- volumet av DNA som brukes til adsorpsjon
0.8- DNA-adsorpsjonseffektivitet på kjernene
Mw- Molekylvekt av DNA-plasmid
NA- Avogadros nummer (6,022 × 1023)
(1)5. Oppløsning av kjerner for å oppnå silkemikrokapsler.
- Tilbered 8% flussyre (HF) løsning, pH 5,5, ved å fortynne stamoppløsning (48%) med destillert vann. Skaff deg et 50 ml sentrifugerør. Pipetter forsiktig 5 ml HF og tilsett 25 ml destillert vann for å oppnå 8% HF-oppløsning.
FORSIKTIG: HF er en svært etsende syre og kan forårsake alvorlige forbrenninger i vevet. Det må utvises ekstrem forsiktighet ved håndtering og bruk av HF i forsøkene. Følg Standard Operating Procedure (SOP) for riktig bruk og håndtering av HF utviklet av organisasjonen for å unngå uønskede utslippsulykker. Ikke bruk glassbeholdere til å fortynne HF-syre. Bruk den kjemiske hetten til å utføre dette trinnet i protokollen. - Løs opp SiO2-kjerner ved å tilsette 1,5 ml 8 % HF-oppløsning til pelleterte kjerneskallmikropartikler fra trinn 4.10. Virvel forsiktig og la kjerner oppløses over natten ved omgivelsesforhold med forsiktig risting ved 450 o / min.
MERK: For å unngå søl av HF, bruk podetape for å forsegle mikrosentrifugerøret. Bruk en kjemisk hette til å utføre dette trinnet i protokollen. - Forbered et 2 l glassbeger fylt med 2 liter avionisert vann. Overfør mikrokapsleroppløsning til dialyseenheter (50 kDa MWCO) og dialyser dem mot avionisert vann med en gjentatt forandring av vannet hver 3. time de neste 3 dagene.
MERK: Samle supernatanten under de tre første utvekslingene av vann og kast løsningen i henhold til den etablerte protokollen for farlig avfall. - Bruk en 1 ml pipette til å overføre suspensjonen fra dialyseutstyr til nye 2 ml mikrosentrifugerør for å samle opp mikrokapslene.
MERK: Oppbevar vandige oppløsninger av mikrokapsler ved omgivelsesforhold i flere år.
6. Avbildning av silke fibroin mikrokapsler ved hjelp av konfokal laser skanning mikroskop (CLSM).
- Utfør DNA-farging ved hjelp av et DNA-fargestoff.
- Overfør 300 mikrokapsler med hul silkefibroin til et nytt mikrosentrifugerør på 1 ml. Tilsett 500 μL RNase/DNase-fritt destillert vann.
- Tilsett 5 μL av DNA-fargestoffet, kort virvel, og inkuber ved RT i 2 timer beskyttet mot lys.
- Utfør fire vasketrinn ved sentrifugering ved 0,1 x g i 20 minutter ved 4 °C hver gang, fjern forsiktig 400 μl av supernatanten og fyll den på med 400 μL RNase/DNase-fritt destillert vann.
- Utfør avbildning av silkekapsler på inverterte konfokalsystemer utstyrt med tre store lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm) ved bruk av 100x olje-nedsenkingsmål (NA 1,49). Overfør 100 μL av kapselprøven til en enkelt brønn med 8-brønnkammerglassglass, slik at kapslene kan sedimentere i 20-30 minutter før avbildning.
MERK: Fargestoffer er svært følsomme for fotobleking. Beskytt prøvene ved å dekke lysbildene med aluminiumsfolie.
7. Estimering av permeabiliteten til hule mikrokapsler ved hjelp av molekylvektscut-off (MWCO) metode.
- Forbered 2 ml hver av FITC-merkede dextranfluoroforløsninger (20 μM, diH 2 O) av forskjellig Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa og2MDa).
- Pipette 100 μL av suspensjonen av kapsler i en enkelt brønn i et kammerglassglass. Analyser hver mikrokapseldesign (konsentrasjon av PEI, lasteantall DNA-plasmider, konsentrasjonen av silkefibroin og antall lag) separat.
- Til hver brønn, tilsett 300 μL av den spesifikke fluoroforoppløsningen fra den laveste Mw opp til den høyeste, slik at hver brønn vil tilsvare den spesifikke fluoroforoppløsningen. Bland ved å pipettere opp og ned og la blandingen inkubere i 1 time ved RT til diffusjonen av fluoroforoppløsninger når likevekt.
- Overfør lysbildet til et konfokal laserskanningsmikroskop (CLSM) og avbilde hver brønn ved hjelp av 100x olje-nedsenkingsmål ved eksitasjon λ = 488 nm.
- Identifiser interesseområdet ved å justere fokalplanet for å sikre at kapslene vises i form av sirkler med størst diameter. Dette skjer vanligvis når man ser prøvene nærmere bunnen av brønnen når kapsler sedimenterer på grunn av tyngdekraften.
- Samle flere bilder av mikrokapselprøver ved å flytte lysbildet i XY-retning. Ta bilder for å ta hensyn til opptil 100-150 kapsler for hver prøve.
- Bruk ImageJ-programvaren til å analysere permeabiliteten til kapselmembranen i hver Mw fluoroforløsning ved å sammenligne fluorescensintensiteter i og utenfor kapslene. For det, tegne et interesseområde (ROI) i form av en sirkel for å skissere omkretsen av kapselen og klikk Analyser / mål for å måle fluorescensintensiteten inni. Tabuler dataene i et regneark. Utfør denne operasjonen for hver mikrokapsel for totalt 200-300 kapsler.
- Vurder den utvendige fluorescensintensiteten på samme måte ved å skissere avkastningen og måle intensiteten bort fra kapslene. Utfør 3-5 målinger for statistisk analyse.
- For å utføre statistisk analyse, sammenlign fluorescensintensitetene på innsiden og utsiden av kapslene ved hjelp av paret t-test (p < 0,05).
- Bruk omregningstabell 2 for å estimere permeabiliteten til mikrokapsler basert på hydrodynamiske radier for FITC-Dextran med variabel Mw.
8. In vitro aktivering av syntetisk teofyllin riboswitch i silke mikrokapsler
- Klargjør 1 ml teofyllinoppløsning (100 mM, DMSO). Forbered E. coli S30 ekstraktsystem for sirkulært DNA ved å tine komponentene på is i 40 min.
- Få et 0,5 ml DNase/RNase-fritt mikrosentrifugerør. Utfør in vitro transkripsjons-/translasjonsreaksjon, kombiner de cellefrie komponentene med en prøve av mikrokapsler i følgende rekkefølge (50 μL totalvolum): S30 premix uten aminosyrer (20 μL); S30 ekstrakt, sirkulær (15 μL); komplett aminosyreblanding (5 μL); hule mikrokapsler inneholdende ThyRS-GFPa1-plasmider fra trinn 4,10 (9 μL); og teofyllin, 100 mM DMSO (1 μL).
MERK: Etter å ha tilsatt alle komponentene, virvle røret kort og samle prøven under kort sentrifugering ved 0,2 × g i et par sekunder. - Inkuber røret ved 30 °C i 4 timer og kontroller fluorescensen på en plateleser ved hjelp av eksitasjon ved λ = 488 nm og utslipp for GFP/FITC-filter (510 nm ± 20 nm).
- Avbilde kapslene på et hvilket som helst LCSM-system ved hjelp av lasere på 488 nm og 561 nm. Få bilder av beste kvalitet ved hjelp av 100x oljefordypningsmål og 8-brønnkammerede lysbilder.
9. In vitro aktivering av brokkoli aptamer i silke mikrokapsler
- Forbered 1 ml stamoppløsning av DFHBI-1T fargestoff (30 μM, diH2O). Forbered det cellefrie systemreaksjonssettet PURE (proteinsyntese ved bruk av rekombinante elementer) ved å tine komponentene på is i 40 minutter.
- Få et 0,5 ml DNase/RNase-fritt mikrosentrifugerør. Utfør in vitro transkripsjonsreaksjon ved å kombinere cellefrie reaksjonskomponenter med en prøve av mikrokapsler i følgende rekkefølge (50 μL totalt volum): oppløsning A (20 μL); oppløsning B (15 μL); hule mikrokapsler inneholdende BrocApt-plasmider fra trinn 4,10 (14 μL); og DFHBI-1T fargestoff (1 μL).
MERK: Etter å ha tilsatt alle komponentene, virvle røret kort og samle prøven under kort sentrifugering ved 0,2 × g i et par sekunder. - Inkuber røret ved 37 °C i 6 timer og kontroller fluorescensen på en plateleser ved hjelp av eksitasjon ved λex = 470 nm og utslipp ved λem = 510 nm ± 20 nm.
- Avbilde kapslene på et hvilket som helst LCSM-system ved hjelp av lasere på 488 nm og 561 nm. Få bilder av beste kvalitet ved hjelp av 100x olje-nedsenking mål, og 8-brønns coverglass kamret lysbilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her tar studien for seg funksjonaliteten til DNA-maler som koder for forskjellige sensordesign (to typer RNA-regulerte transkripsjons-/oversettelseselementer) etter innkapsling i silkeproteinkapsler. Mikrokapsler ble fremstilt via lag-for-lag (LbL) sammenstilling av nøkkelkomponentene: Et primlag, DNA-plasmider som koder for sensordesign og silkefibroin biopolymer (figur 2). Avsetning av makromolekyler på en lagdelt måte gjør det mulig å kontrollere permeabiliteten til kapselmembranen basert på inter- og intramolekylære interaksjoner mellom de absorberte lagene og tykkelsen på skallet. Den justerbare permeabiliteten til systemet ga potensial til å kontrollere diffusjonen av essensielle molekyler samtidig som diffusjonen av store uønskede makromolekyler ble begrenset gjennom kapselmembranen20.
Homogen i størrelse (4,5 μm) og robuste silkefibroin mikrokapsler med en skalltykkelse på ~ 500 nm (20 lag) i hydrert tilstand kan produseres når protokollen følges riktig (figur 3) 21. LbL-tilnærmingen tillot å justere lastekapasiteten til DNA-maler basert på den opprinnelige konsentrasjonen av plasmidene. Den optimale DNA-belastningen kan oppnås ved å variere den opprinnelige konsentrasjonen av DNA-maler fra 50-200 ng / μL. Tabell 1 representerer antall DNA-kopier som ble beholdt i en enkelt mikrokapsel ved fullføring av LbL-innkapsling og ble beregnet for hver sensordesign basert på de opprinnelige DNA-konsentrasjonene og Mw av DNA-plasmider i henhold til ligning 1. Den optimale DNA-lastekapasiteten ble oppnådd med 32 og 20 DNA-kopier for henholdsvis ThyRS- og BrocApt-sensordesign. Vurderingen av lastekapasitet var viktig for å ha en nøyaktig estimering av de innkapslede DNA-konsentrasjonene for å kunne titrere den under IVTT-aktivering av sensorene ved å legge til flere konsentrerte kapselprøver.
Permeabiliteten til kapselskallene kan analyseres systematisk ved å følge MWCO-metoden. Metoden estimerer porestørrelsen til membranen basert på molekylvekten til løsemiddelmolekyler som ikke kunne trenge gjennom kapselmembranen. Ved å utsette mikrokapsler for variable Mw fluoroformolekyler og utføre konfokal avbildning i fokalplanet som tilsvarer den største diameteren over flere kapsler, kan permeabiliteten til skallmembranene vurderes. ImageJ-analyse gjør det mulig å estimere fluorescensintensitetene i og utenfor kapslene og identifisere fullt permeable (utvendige og innvendige fluoroforintensiteter var sammenlignbare), delvis permeable (50%-70% av kapslene hadde lavere fluorescens inne sammenlignet med utsiden), og ikke permeable (inne i fluoroforintensiteten var lavere sammenlignet med utvendig intensitet) membraner (figur 4). Konvertering av Mw til hydrodynamisk radius for hver fluorofor gjør det mulig å estimere maskestørrelsen på kapselmembranen (tabell 2).
Selektiv permeabilitet av proteinkapsler kan oppnås under systematisk optimalisering av LbL-avsetningsprotokollen ved å bruke variable konsentrasjoner av et primlag (fra 0-6 mg / ml), konsentrasjonen av et silkefibroin (fra 0,5-2 mg / ml) og antall avsatte lag (fra 10-25) til optimal permeabilitet oppnås. I denne protokollen ble optimal permeabilitet mellom 25-32 nm oppnådd med 6 mg / ml PEI som et hovedlag og 20 lag med 1 mg / ml silkefibroin avsatt under LbL-montering (figur 4). Dette permeabilitetsområdet var ideelt for komponentene i IVTT-systemet å perkolere gjennom kapselskallet. Vanligvis er de største molekylære kompleksene til et hvilket som helst IVTT-system prokaryote ribosomale enheter, 30S og 50S, som, når de er bundet av mRNA i et ribosomalt kompleks, kan nå opp til ~ 20 nm i størrelse22. Strukturen til de utviklede mikrokapslene skallene ligner et svært sammenflettet nettverk av silkefiberlag som er fysisk tverrbundet av β-arkblokker produsert under LbL-montering. Denne membranstrukturen er semi-permeabel: svært gjennomtrengelig for små molekyler (f.eks. ioner, aminosyrer, peptider, sukkerarter, etc.) og begrenset til store molekyler (f.eks. proteiner med høy molekylvekt, glykoproteiner, celler, etc.) som bare tillater perkolering av molekyler med en hydrodynamisk radius mindre enn 25 nm. Derfor kan silkefibroin mikrokapsler med optimal DNA-belastning og membranpermeabilitet brukes som bioreaktorbærere for IVTT-aktivering.
Den transkripsjonelle og translasjonsaktiviteten til ThyRS- og BrocApt-designsensorer kan testes ved hjelp av kommersielt tilgjengelige IVTT-systemer. ThyRS krever translasjonell aktivering av reportergenet i nærvær av teofyllinligand. Aktivering av syntetisk ThyRS involverer flere trinn for å initiere genuttrykk, inkludert mRNA-syntese, konformasjonsendringen av mRNA-sekvensen ved binding til analytten, frigjøring av ribosombindingsstedet og syntesen av reporteren GFPa1-proteinet. Alle disse trinnene krever fri diffusjon av IVTT-komponentene gjennom kapselmembranen. Den foreslåtte utformingen av DNA-lastede silkefibroinmikrokapsler forbedret aktiveringsparametrene til RNA-regulerte sensordesign: Både ekspresjonskinetikken og fluorescensutgangen var signifikant høyere sammenlignet med det frie ikke-immobiliserte DNA (figur 5A). CLSM-avbildningen bekreftet også vellykket GFPa1-genaktivering i kapsler lastet med DNA-plasmider som koder for ThyRS-sekvenser (figur 5B-D).
Alternativt ble aktiveringen av BrocApt-sensordesign utført i IVTT-systemet som støtter T7 E. coli-promotorkoblet transkripsjon/oversettelse i nærvær av DHFBI-1T-fargestoff . Fluorescensutgangen ble initiert ved binding av fluorogent fargestoff til mRNA-sekvensen. Det er viktig at utgangssignalet fra silkemikrokapsler var flere ganger høyere sammenlignet med ikke-innkapslede DNA-prøver med ekvivalente konsentrasjoner (figur 6). Derfor kan silkefibroin mikrokapsler beholde den essensielle funksjonaliteten til DNA-kodede sensorelementer, noe som kan være viktig for utformingen av nye typer in vitro biosensorplattformer for rask og sensitiv deteksjon av analytter av interesse.
Figur 1: Plasmidkart og sekvens av pSALv-RS-GFPa1 . (A) Plasmidet inneholder teofyllin riboswitch (ThyRS) sekvens plassert oppstrøms for GFPa1-kodende gen under kontroll av ptac-promotor, β-laktamase (BLA) kodende gen ansvarlig for resistens mot ampicillin. (B) PTAC-promotorsekvensen vises i fet skrift og understreket; Theophylline riboswitch sekvens er vist i fet kursiv; GFPa1-kodingssekvens vises i fet skrift; Sekvenser for begrensningsområder er understreket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over fremstilling av mikrokapsler ved hjelp av lag-for-lag-tilnærmingen. Uberørte SiO2-kjerner ble først funksjonalisert med PEI-polymer, etterfulgt av sekvensiell avsetning av DNA-plasmider som koder for forskjellige sensordesign og silkefibroinlag til ønsket antall silkeproteinlag er adsorbert. Hule uberørte mikrokapsler som inneholder forskjellige DNA-sensordesign kan produseres ved å oppløse offerkjerner. Aktivering av hver biosensordesign innkapslet i mikrokapselen kan oppnås under IVTT-reaksjoner i nærvær av tilsvarende ligander. Denne figuren er gjengitt fra Drachuk, I. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikroskopistudier for DNA-lastede mikrokapsler. (A) Tverrsnitt 2D og (B) Gjengitte 3D konfokale mikroskopibilder av hule (SF) 20 mikrokapsler lastet med DNA-plasmider som koder for ThyRS (32 DNA-kopier/kapsel) og produsert fra 6 mg/ml PEI-primede SiO2-kjerner. Autofluorescens fra silkefibroinkapsler (DAPI-kanal, blå) og farget DNA (FITC-kanal, grønn) ble brukt for å identifisere lokaliseringen av DNA-plasmider og estimere kapselmembrantykkelsen. Innfelt i (A) representerer intensitetsprofiler for DNA- og silkefibroinskall over kapselen. Skala bar: 2 μm. Innfelt i (B) representerer intensitetsprofilen for silkeprotein over kapselskallet. Membrantykkelse ble målt som lengden ved halv intensitetstopp. Behandling av tverrsnittsbilder og 3D-gjengivelse ble utført ved hjelp av NIS-bildebehandlingsprogramvare på Nikon C2+-systemet. Denne figuren er gjengitt fra Drachuk, I. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Estimering av membranpermeabilitet for silkemikrokapsler med MWCO-metoden. Selektive CLSM-representative fluorescerende bilder av hule silkefibroinmikrokapsler utsatt for FITC-Dextran-oppløsninger av forskjellige Mw (20 μM, diH2O). Kapsler ble fremstilt med et annet antall lag og PEI-konsentrasjoner. En økning i konsentrasjonen av et primlag fører til økt kolloidal stabilitet av mikrokapsler med mer permeable skall, mens eliminering av hovedlaget forårsaker aggregering av kapsler med mindre permeable skallmembraner. Skala bar: 5 μm. Denne figuren er gjengitt fra Drachuk, I. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Aktivering av ThyRS-sensordesign i silkefibroinmikrokapsler. (A) Kinetikk for GFPa1-ekspresjon under ThyRS-aktivering fra DNA-plasmider lastet inn i 20-lags SF-mikrokapsler (rødfargede linjer) og kontroller ikke-innkapslet DNA (blåfargede linjer). Fra topp til bunn var konsentrasjoner av DNA i et prøvevolum (50 μL) 6,5 ng / μL, 4,5 ng / μL, 2,5 ng / μL og 0 ng / μL og tilsvarer endringene i fargeintensiteter. (B) CLSM-bilder av silkefibroinkapsler lastet med 32 DNA-kopier per kapsel. Skala bar: 5 μm. (C) Bildet tilsvarer tverrsnittsintensitetsprofiler som tilsvarer bilde (B) over to kapsler (hvit linje i B). Den røde linjen representerer silkekapsler, og den grønne linjen representerer GFPa1 uttrykt i kapsler. (D) Bildet representerer gjengitte 3D-silkekapsler lastet med 32 kopier av DNA etter inkubasjon i IVTT-systemet. Grønn fluorescens tilsvarer GFPa1-signalet, og rød fluorescens tilsvarer fluorescerende merkede silkelag. Skala bar: 2 μm. ThyRS-aktivering ble utført med teofyllin (2 mM, DMSO) under inkubasjon av mikrokapsler i IVTT-systemet (S30 ekstrakt). Denne figuren er gjengitt fra Drachuk, I. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Aktivering av BroccApt i silkefibroin mikrokapsler. Sammenligning av transkripsjonskinetikk ble utført for 20-lags silkemikrokapsler lastet med 30 DNA-kopier per kapsel (rødfargede linjer) og kontroll ikke-innkapslet DNA (blåfargede linjer). Fra topp til bunn var konsentrasjoner av innkapslet DNA i en prøve: 3,6 ng / μL, 2 ng / μL, 1 ng / μL og 0 ng / μL og tilsvarer endringene i fargeintensiteter. Konsentrasjoner av ikke-innkapslet DNA var: 20 ng / μL, 10 ng / μL, 5 ng / μL og 0 ng / μL og tilsvarer endringene i fargeintensitet. Aktivering ble utført med DHBFI-1T (100 μM, diH2O) under inkubasjon i det PURE-cellefrie systemet. Denne figuren er gjengitt fra Drachuk, I. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Design av DNA-sensor | Initial DNA-konsentrasjon (ng/μL) | Antall DNA-kopier per kapsel (DNA/kapsel) |
| 50 | 16 | |
| Tyrene | 100 | 32 |
| 150 | 48 | |
| 200 | 64 | |
| 50 | 10 | |
| BrocApt | 100 | 20 |
| 150 | 30 | |
| 200 | 40 |
Tabell 1: DNA-kopinummer per kapsel for hvert DNA-design. Kopinummeret ble beregnet i henhold til ligning 1 og var korrelert med den opprinnelige konsentrasjonen av DNA-plasmider, retensjonsaffiniteten til DNA-sekvenser under LbL-avsetningsprosessen og lengden på DNA-plasmider.
| Mw av FITC-Dextran (kDa) | Hydrodynamisk radius (nm) |
| 4 | 1.4 |
| 20 | 3.3 |
| 40 | 4.5 |
| 70 | 6 |
| 150 | 8.5 |
| 250 | 10 |
| 500 | 14 |
| 2,000 | 18 |
Tabell 2: Fysiske egenskaper til FITC-dextrans. Hydrodynamisk radius for hver fluorofor ble brukt til å estimere permeabiliteten til hule silkefibroin mikrokapsler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektivt permeable hydrogelmikrokapsler lastet med ulike typer DNA-kodede sensordesign kan fremstilles etter denne protokollen. Et av de karakteristiske trekkene ved LbL-tilnærmingen er evnen til å skreddersy kompleksiteten til mikrokapsler under bottom-up-monteringen, som vanligvis starter med adsorpsjon av molekylære arter på offermaler. Ved nøye justering av konsentrasjoner av de opprinnelige komponentene, pH-forhold og antall lag, kan mikrokapsler med forskjellige DNA-belastningsparametere, funksjonalitet og justerbar permeabilitet fremstilles23. For å forsterke allsidigheten til kapslene, kan ytterligere funksjonalisering av skalloverflaten med AuNPs og IgG oppnås for å implementere biokompatible sensorbærere for in vivo-diagnostikk . Begge disse alternative rutene er avhengige av den unike molekylære strukturen til silkefibroinet. In situ reduksjon av Au3+ ioner kan oppnås på grunn av tilstedeværelsen av tyrosinrester (5,3% mol.) som er i stand til å redusere metallioner i nærvær av en optimal reduksjonsbuffer. Konjugeringen av spesifikke antistoffer mot overflaten av AuNPs-funksjonaliserte proteinmikrokapsler kan gjøres ved implementering av karbodiimidaktiveringskjemi. Begge disse trinnene krever nøye utvikling og optimalisering av protokollen for å oppnå riktig funksjonalitet av biosensorkapslene for fremtidige applikasjoner. For eksempel, for å bruke disse mikrokapslene som "smarte" leveringssystemer, der en molekylær last leveres på spesifikke stimuli (som pH eller kjemiske signaler), bør spesifikke egenskaper av disse kapslene karakteriseres og justeres, inkludert leveringseffektivitet, retensjonstid, administrasjonsvei og sykdomsmodellbehandlinger.
De DNA-ladede mikrokapslene var preget av CLSM-teknikken og fluorescensmålinger. Imidlertid kan andre karakteriseringsmetoder som atomkraftmikroskopi (AFM), kryogen elektrontomografi (CEM) og direkte stokastisk rekonstruksjon superoppløsningsmikroskopi (dSTORM) brukes til å skille spesifikke strukturer av mikrokapslene, inkludert individuelle fibre, nanodomener og lokalisering av DNA-plasmider24,25,26.
Den utviklede protokollen fremhever bruken av silkefibroin biopolymer som et biokompatibelt nettverksmateriale som bevarer den tertiære strukturen av lastede DNA-plasmider. Stabiliteten til immobiliserte DNA-sekvenser i silkefibroinnettverket skjer via hydrofobe interaksjoner og/eller hydrogenbinding, som gir et beskyttende mikromiljø mot pH-inaktivering, oksidasjon eller hydrolyse27. I tillegg gir de β-krystallinske domenene av silkefibroin en unik mekanisk barriere, som begrenser bevegelsen av innestengte makromolekyler og forhindrer DNA-plasmider fra nedbrytning under lagring i vandige løsninger.
Den semi-permeable naturen til silkefibroinmikrokapsler lastet med DNA-maler skapte unike romlige og fysisk-kjemiske forhold for IVTT-reaksjonene. Transkripsjonelt og translasjonelt aktivert RNA-aptamer og riboswitch immobilisert i silkefibroinmikrokapsler var i stand til å produsere et utgangssignal som var minst tre ganger høyere sammenlignet med frie, ikke-immobiliserte sensorer. I tillegg kan immobilisering av DNA-maler i mikrokapsler betydelig forbedre aktiviteten til innkapslede sensorer utover deteksjonsgrensen for ikke-innkapslede. Mens ikke-innkapslede sensorer hadde minimal respons ved lave DNA-konsentrasjoner, hadde de innkapslede sensorene en veldig tydelig utgangsrespons, som lett kan titreres for å gjenspeile de subtile endringene i DNA-konsentrasjoner. Det forbedrede responssignalet fra innkapslede reportere skyldtes sannsynligvis ubegrenset diffusjon av komponentene i IVTT-maskiner og redusert mobilitet av DNA-plasmider. Flere studier har anerkjent at utbyttet av proteinsyntese i cellefrie reaksjoner er avhengig av det makromolekylære miljøet28,29. Immobilisering av DNA-plasmider i silkenettverk ga et effektivt begrenset miljø som begrenset oligonukleotidbevegelse og akselererte transkripsjons-/translasjonsmekanismereaksjoner selv fra flere DNA-kopier21.
Mens LbL-metoden gir en svært allsidig tilnærming til å konstruere multifunksjonelle enheter på en kontrollerbar måte, er fabrikasjonsprosedyren relativt tidkrevende og krever vanligvis behandlingsjusteringer for å skalere opp mikrokapselutbyttet. En annen vurdering ved å lage biomolekylbaserte mikrokapsler er kompatibiliteten til et gitt system med kravet til kjerneoppløsningen etter at LbL-avsetningen er fullført. Så langt, for å produsere homogene i størrelse og robuste hule silkebaserte DNA-ladede mikrokapsler, ble skallene avsatt på offersilika (SiO2) kjernemaler, som krevde påfølgende fjerning ved flussyreetsing (HF). Heller ikke HF-håndtering eller etsing betraktes som biokompatible prosesser, noe som begrenser deres utbredte bruk i praktiske applikasjoner. Alternativet til SiO2 uorganiske kolloidale maler, karbonatkjerner er vanligvis inerte ved dannelse av komplekser med polymerlag og kan oppløses under milde forhold ved bruk av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Justering av offerkjerner kan imidlertid påvirke avsetningsegenskapene til flersjikt og integriteten til skallstrukturen, noe som krever ytterligere optimalisering av protokollen.
Oppsummert tillater den nåværende protokollen fremstilling av silkebaserte DNA-ladede mikrokapsler med forskjellige sensordesign. Kombinasjonen av et begrenset mikromiljø levert av LbL-metoden og bruken av silkefibroin som et biokompatibelt materiale forbedret sensingegenskapene til innkapslet DNA. Med den raske utviklingen av fluorogen RNA-aptamerteknologi, kan den potensielle bruken av DNA-lastede silkemikrokapsler utvides til multiplekset in vitro-diagnostikk. Nylig har flere varianter av RNA-baserte fluorescerende aptamere dukket opp som kraftig bakgrunnsfri teknologi for avbildning av RNA i levende celler med høy signal-støy-forholdsfølsomhet30,31. Ved å bruke syntetisk RNA-nanoteknologi for å designe kunstige RNA-aptamere, kan de fluorogene egenskapene til aptamere utnyttes for å oppdage spesifikke ligander av interesse. Denne teknologien vil være spesielt verdifull for å overvåke biomarkører av interesse i forskjellige formater, inkludert papirbaserte sensorer, hydrogelbaserte flekker for svette eller interstitiell væske og implanterbare materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Synspunktene og meningene som presenteres her, tilhører forfatterne og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til DoD eller dets komponenter
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av LRIR 16RH3003J-tilskudd fra Air Force Office of Scientific Research, samt Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programmet til US Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering.
Plasmidvektorsekvensen for ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) ble sjenerøst levert av Dr. J. Gallivan. Silkeormkokonger fra Bombyx mori ble sjenerøst donert av Dr. DL Kaplan fra Tufts University, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N.
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
