Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الطفو الحر مناعة أدمغة الفأر

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62876
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1,4
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول نهجا فعالا وقابلا للاستنساخ للدراسات النسيجية للدماغ الماوس ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الدماغ ، والتأنيم المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير.

Abstract

تلطيخ المناعي الكيميائية من أدمغة الفئران هو تقنية روتينية تستخدم عادة في علم الأعصاب للتحقيق في الآليات المركزية الكامنة وراء تنظيم استقلاب الطاقة وغيرها من العمليات العصبية البيولوجية. ومع ذلك، قد تختلف جودة وموثوقية والاستنساخ لنتائج الأنسجة الدماغية بين المختبرات. لكل تجربة تلطيخ ، من الضروري تحسين الإجراءات الرئيسية استنادا إلى الاختلافات في الأنواع والأنسجة والبروتينات المستهدفة وظروف عمل الكواشف. توضح هذه الورقة سير عمل موثوق به بالتفصيل ، بما في ذلك التشوه داخل الأبهر ، وتفتيت الدماغ ، والتشبع المناعي العائم ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير ، والتي يمكن متابعتها بسهولة من قبل الباحثين في هذا المجال.

كما تناقش كيفية تعديل هذه الإجراءات لتلبية الاحتياجات الفردية للباحثين. لتوضيح موثوقية وكفاءة هذا البروتوكول ، كانت الشباك العجان ملطخة بالوستاريا فلوربوندا أغغلوتينين (WFA) وأرجينين فاسوبريسين (AVP) مع مضاد مضاد ل AVP في دماغ الماوس. وأخيرا، تمت معالجة التفاصيل الهامة للإجراء بأكمله، ومزايا هذا البروتوكول مقارنة بمزايا البروتوكولات الأخرى. تقدم هذه الورقة مجتمعة بروتوكولا محسنا لاحتواء المناعة العائمة الحرة لأنسجة دماغ الماوس. إن اتباع هذا البروتوكول يجعل هذه العملية أسهل لكل من العلماء المبتدئين وكبار العلماء لتحسين جودة وموثوقية واستنساخ دراسات التضمين المناعي.

Introduction

وقد بلغ انتشار السمنة والأمراض المصاحبة لها مستويات وبائية، مما تسبب في عبء اجتماعي واقتصادي هائل1،2. وقد تم تطوير نماذج الماوس المختلفة لفهم أفضل للعمليات البيولوجية المسؤولة عن السمنة3،4. لأن الآليات المركزية مهمة لتنظيم التوازن الطاقة في هذه النماذج الحيوانية، أصبحت الدراسات التشريحية العصبية من أدمغة الفئران تقنية ضرورية في هذا المجال. ومع ذلك، تختلف جودة وموثوقية واستنساخ تقنيات الأنسجة الدماغية بشكل كبير بين المختبرات وحتى الباحثين داخل المختبر نفسه لأسباب مختلفة (مثل الأجسام المضادة والأنسجة والعلاجات والأنواع وأهداف البحث). لذلك ، من الضروري وضع بروتوكول عام للدراسات النسيجية لدماغ الماوس ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الدماغ ، والتشبع المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير. وفي الوقت نفسه، يمكن للمبتدئين تعلم بسرعة، وإتقان، وضبط هذا البروتوكول لتلبية احتياجاتهم الفردية.

تلطيخ Immunohistochemical هو طريقة راسخة التي تم استخدامها على نطاق واسع لتصور أنواع محددة من الخلايا، ورنا، والبروتينات في مجموعة متنوعة من الأنسجة (مثل الدماغ والأنسجة الطرفية)5،6. وبشكل أكثر تحديدا، يمكن تسمية مستضد الاهتمام بأجسام مضادة أولية محددة وأجسام مضادة ثانوية مقابلة مرتبطة إنزيم (مثل الكيمياء المناعية الكروموجينية) أو صبغة فلورية (الفلوريسين إيزوثيوسيانات)6. وكمثال على فائدة هذه التقنيات، كان β-إندورفين [ببتيد واحد مشفر بواسطة الموالية للأوبيوميلانوكرتيين (POMC)] وc-fos (علامة على نشاط الخلايا العصبية) ملطخة في نواة arcuate. وقد تبين حذف هيدروكسيلولاز التربتوفان 2 (إنزيم جزء لا يتجزأ من تخليق السيروتونين) في نواة رابي الظهرية لتقليل التعبير ج فوس في الخلايا العصبية POMC في النواة arcuate7. وبالإضافة إلى ذلك، تم تعيين توزيع مستقبلات فيتامين (د) مرنا في دماغ الماوس عن طريق التهجين في الموقع (RNAscope)8. تقدم هذه الورقة طريقة موثوقة وفعالة مع سير عمل خطوة بخطوة لاحتواء المناعة العائمة مجانا ، بهدف تحسين جودة واستنساخ الدراسات النسيجية لدماغ الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

استخدمت الفئران C57BL/6J من كلا الجنسين (8-16 أسابيع من العمر) في هذه الدراسة. تمت الموافقة على رعاية جميع الحيوانات وجميع الإجراءات من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية بايلور للطب.

1. التخبط

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 1.1 -1.6 في غطاء محرك السيارة fume.

  1. تخدير
    1. صب 5 مل من isoflurane (انظر جدول المواد) على منشفة ورقية وضعت في الجزء السفلي من المجفف. أدخل الماوس على الحاجز المتحصن داخل المجفف وانتظر حتى تختفي علامات التنفس.
      ملاحظة: بدون التنفس الماوس مازال لديه heartbeat لفترة قصيرة من الوقت ثم سيتم perfused قبل اختفاء heartbeat.
    2. قبل المتابعة، تأكد من عدم وجود رد فعل لقرصة إصبع القدم.
    3. إصلاح الماوس إلى لوحة رغوة عن طريق قيادة دبوس من خلال كل قدم. تأكد من وضع لوح الرغوة في صينية لجمع السوائل غير المباشرة.
  2. تعريض القلب
    1. إجراء شق سطحي طولي على طول خط الوسط على الصدر والبطن، ثم تحريك الجلد جانبا لفضح جدار العضلات من الصدر والبطن. بعد ذلك، قم بإجراء شق في طبقة العضلات لكشف الكبد والأمعاء. وأخيرا، قطع القفص الصدري مع مقص لفتح الصدر وفضح القلب والرئتين. استخدام ملقط الهيموستاتيكي لسحب القفص الصدري جانبا لتوسيع منطقة العمل.
  3. جمع الدم النهائي (اختياري)
    1. أدخل حقنة 1 مل (انظر جدول المواد) بعناية في الأذين الأيمن للقلب حتى يتم تضمين الطرف بالكامل. أمسك المحقنة بثبات واسحب الدم ببطء حتى يتم الوصول إلى الحجم المطلوب.
      ملاحظة: الحرص على عدم اختراق الماضي الأذين الأيمن; جمع 300-400 ميكرولتر من الدم يمكن تحقيقه لكل فأر بالغ. يمكن استخدام إضافات مثل مسرع الجلطة أو مضادات التخثر، اعتمادا على الغرض من جمع الدم.
  4. وضع قنية التغلغل
    1. للمبتدئين، وقطع ثقب صغير (<1 ملم) في البطين الأيسر من القلب مع مقص وإدراج قنية حادة (18 إبرة G للفئران الصغيرة و 21 إبرة G للفئران الذين تتراوح أعمارهم بين) من خلال البطين الأيسر في الشريان الأورطي الصاعد. بدلا من ذلك، للمجربين ذوي الخبرة، واختراق البطين القلب الأيسر مع قنية حادة مباشرة وإدراجه في الشريان الأورطي التصاعدي بعناية.
    2. وضع دبابيس حول اقتران القنية وأنابيب مقرونة على لوحة الرغوة لمنع الحركة أثناء التخبط. بدلا من ذلك، استخدم ملقط الهيموستاتيكي لإصلاح القنية في مكانها. المضي قدما في خفض الأذين الأيمن للسماح لتدفق الدم من الدورة الدموية.
      ملاحظة: يتم توصيل قنية النفخ والأنابيب المقترنة بمضخة النفخ.
  5. التغلغل مع المالحة
    1. قم بتشغيل مفتاح الضغط المالح، وثقب الماوس عبر البطاقة مع 40-60 مل من المالحة (0.9٪ NaCl: 25 درجة مئوية، درجة الحموضة 7.4). مراقبة تدفق من الأذين الأيمن ولون الكبد عن كثب.
      ملاحظة: يتم استخدام مضخة التشوه الآلي (انظر جدول المواد) لتدفق الدم في غضون 1-2 دقيقة. وبما أن نطاق ضغط المضخة يتراوح بين 1 و300 مم زئبق، يمكن تعديل السرعة وفقا لذلك. إذا كان المالحة يتسرب من الأنف و / أو تضخم الرئة، وتقليل الضغط وضبط القنية. بمجرد أن لا يحتوي التدفق إلى الخارج على الدم ، يتم مسح الدماغ بما فيه الكفاية بالمحلول الملحي. وفي الوقت نفسه، الكبد يخلو من الدم ويصبح البني الرمادي في اللون.
  6. التخبط مع الفورمولين
    1. إيقاف التبديل الضغط المالحة وتشغيل مفتاح ضغط الفورمالين لثقب الماوس مع 40 مل من 10٪ الفورمالين العازلة محايدة (10٪ NBF: 25 درجة مئوية، درجة الحموضة 6.8-7.2، انظر جدول المواد). مراقبة أطراف الحيوان للحصول على أدلة على الهزات.
      ملاحظة: يمكن ملاحظة حركة الذيل أيضا بعد ضخ 10٪ من فرنك بلجيكي. تنبيه: بما أن بنك الفجيرة الوطني خطر، يقترح أن يرتدي الباحثون معدات الحماية الشخصية (مثل جهاز التنفس المناسب، درع الوجه) طوال العملية.
  7. عزل الدماغ9
    1. استخدام مقص لإزالة الرأس. جعل شق الخط الأوسط على طول integument لفضح الجمجمة. تقليم قبالة الجلد والعضلات المرفق مع مقص.
    2. جعل قطع في التلال المدارية، ومن ثم وضع نهاية حادة من مقص قزحية العين في ماغنوم foramen. تقدم المقص على طول السطح الداخلي للجمجمة ، مع الحفاظ على الضغط التصاعدي لتجنب تلف الدماغ. إزالة العظام الجدارية / الجبهية وس السحايا بعناية. وأخيرا، إزالة الدماغ من الجمجمة المفتوحة بلطف.
  8. مرحلة ما بعد التثبيت
    1. ضع الدماغ في أنبوب 15 مل مملوءا ب 10 مل من 5٪ NBF و 15٪ سكروز للتثبيت بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: لإعداد 10 مل من 5٪ NBF و 15٪ سكروز، اجمع 5 مل من 10٪ NBF و 5 مل من السكروز بنسبة 30٪ (ث/ v، المذاب في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)، انظر جدول المواد). تأكد من أن حجم المخزن المؤقت المثبت أكبر من النموذج نفسه ب 10 أضعاف على الأقل. في البداية، سوف يطفو الدماغ في المخزن المؤقت وسوف تغرق إلى أسفل بعد التثبيت بين عشية وضحاها.
  9. تجفاف
    1. نقل عينة الدماغ إلى أنبوب 15 مل مليئة 10 مل من السكروز 30٪ للجفاف في 4 درجة مئوية حتى يغرق.

2. Cryosectioning (المقاطع التاجية)

  1. اعداد
    1. ضع الثلج الجاف فوق لوحة تعديل الارتفاع من ميكروتوم منزلق، وانتظر حتى يظهر الصقيع الأبيض. انتشار بعناية 5 مل من السكروز 30٪ على رأس لوحة لتشكيل طبقة من قاعدة صلبة بعد تجميد محلول السكروز تماما. ضع جميع عينات الدماغ (حتى 5 عينات من الدماغ في دفعة واحدة) أفقيا في خط أعلى السكروز ، ثم أضف 0.5 مل من السكروز بنسبة 30٪ إلى الجزء السفلي من كل دماغ.
      ملاحظة: سوف الدماغ التمسك فورا إلى قاعدة السكروز المجمدة وتجميد تدريجيا من أسفل إلى أعلى. ضع السكروز الإضافي حول الجزء المثبت من الدماغ لتشكيل قاعدة أكثر متانة للقطع.
  2. تقسيم
    1. بعد 5-10 دقيقة من التجمد ، عندما يصبح الدماغ صلبا وأبيض ، قم بتقليم الدماغ حتى يتم الوصول إلى الطبقة / المنطقة المطلوبة.
      ملاحظة: ضبط كمية الثلج الجاف على لوحة للتحكم في درجة الحرارة. درجة الحرارة منخفضة جدا عندما تظهر بلورات الثلج على سطح الدماغ. درجة الحرارة مرتفعة جدا عندما يصبح الدماغ لينة ولم يعد أبيض.
    2. انتقل من وضع التقليم إلى وضع التغذية وقسم أنسجة الدماغ إلى سمك 25 ميكرومتر. إعداد لوحة 48 جيدا مليئة 1x برنامج تلفزيوني، ووضع علامة على خمسة آبار لدماغ فأر واحد. استخدام فرشاة لجمع كل قسم من ماوس واحد ووضعه في بئر واحد. جمع المقطع اللاحق من نفس الماوس ووضعه في البئر 2 .
    3. كرر 2.2.2 حتى يتم الوصول إلى البئر الخامس ، ووضع الأقسام 6-10 في البئر 1-5 وهلم جرا. كرر نفس الإجراء لبقية الأدمغة في وقت واحد. كرر حتى يتم جمع جميع المقاطع من فأر واحد في الآبار 5 في الترتيب التشريحي.
      ملاحظة: بعد هذا الإجراء، يتم اقتباس أقسام الدماغ من كل فأر إلى 5 سلسلة، والتي يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 5 دراسات النسيجية المختلفة.
  3. خزن
    1. استخدام فرشاة لنقل المقاطع من كل بئر إلى 1.5 مل microtube مليئة مخزن التبريد (20٪ الجلسرين، 30٪ جلايكول الإيثيلين، و 50٪ برنامج تلفزيوني)، وتخزين العينات في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه المقاطع المخزنة في أنابيب صغيرة (1.5 مل) يمكن أن توفر المساحة الفعلية في الثلاجة، ويمكن الحفاظ على سلامة المقاطع لعدة أشهر.

3. الحرة العائمة WFA تلطيخ ومكافحة AVP المناعية

  1. ضع مصفاة الخلية في بئر من لوحة ثقافة الخلايا 6-جيدا مليئة برنامج تلفزيوني، واستخدام فرشاة الرسم لنقل سلسلة واحدة من أقسام الدماغ إلى مصفاة الخلية. شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني عن طريق نقل مصفاة الخلية إلى بئر آخر مملوءة برنامج تلفزيوني. شطف لمدة 6 × 10 دقيقة على شاكر للأقسام المخزنة في عازلة cryoprotectant و 3 × 10 دقيقة لأقسام قطع الطازجة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع إجراءات الغسيل في لوحة ثقافة الخلايا 6-جيدا مع مصفاة الخلية داخل كل بئر (انظر جدول المواد). كل مصفاة يحمل أقسام الدماغ من الفائدة من كل فأر. لحفظ الكواشف، يتم تنفيذ جميع إجراءات الحضانة الموضحة أدناه في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. بين إجراءات الغسيل والحضانة، استخدم فرشاة الطلاء لنقل أقسام الدماغ بين كل مصفاة خلايا وكل أنبوب. لغسل مع برنامج تلفزيوني، 12 مل كافية لكل بئر.
  2. إعداد 1 مل من biotin المسمى WFA (1:1,000) الحل في PBT (2.5 مل من تريتون X-100 حل في 1,000 مل من برنامج تلفزيوني) العازلة في أنبوب 1.5 مل. نقل أقسام الدماغ من مصفاة الخلية إلى الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز ~ 50 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  3. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة كما هو موضح في 3.1.
  4. إعداد 1 مل من streptavidin-Dylight 488 (1:500) الحل في PBT في أنبوب 1.5 مل. نقل أقسام الدماغ في الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على منصة هزاز في ~ 50 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: قم بتغطية اللوحة بورق لتجنب التعرض للضوء من هذه الخطوة إلى الأمام.
  5. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة. احتضان أقسام الدماغ في منع العازلة (3٪ مصل الحمير العادي المخفف في PBT) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم تحديد اختيار منع المصل من قبل الأنواع التي يتم إنشاء الأجسام المضادة الثانوية. على سبيل المثال، إذا كان الجسم المضاد الثانوي من الماعز، يجب استخدام مصل الماعز الطبيعي.
  6. احتضان أقسام الدماغ في الأجسام المضادة الأولية (أرنب المضادة لAMP، 1:500) في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز في ~ 50 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تحضير كل من الأجسام المضادة الأساسية والثانوية في حظر المخزن المؤقت. يجب تحسين التركيز ومدة الحضانة ودرجة حرارة الحضانة في الدراسات التجريبية.
  7. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة. احتضان أقسام الدماغ في الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا الدقيق 594 حمار المضادة للأرنب IgG (H + L)، 1:500) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على منصة هزاز في ~ 50 دورة في الدقيقة. شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 10 دقيقة.

4. تصاعد

  1. ملء اثنين من أطباق بيتري (قطرها 150 ملم) مع 100 مل من برنامج تلفزيوني 1x لكل منهما. نقل جميع أقسام الدماغ من مصفاة واحدة في الطبق الأول، ومحاذاة أقسام الدماغ في ترتيب التشريح العصبي من caudal إلى rostral.
    ملاحظة: لتجنب خلط المقاطع من الحيوانات المختلفة، قم بتركيب سلسلة واحدة من أقسام الدماغ من واحد في كل مرة.
  2. بعد أن يتم محاذاة جميع أقسام الدماغ في الطبق الأول، غمر شريحة واحدة في الطبق الثاني مع نهاية واحدة مائلة قليلا مع موقف (انظر الشكل 1 والشكل 2). استخدم فرشاة طلاء دقيقة لوضع قسم الدماغ برفق أسفل واجهة العازلة الهوائية مباشرة على الشريحة المائلة. كرر نفس الإجراء مع قسم آخر من الدماغ وجبل جنبا إلى جنب مع القسم الأول.
  3. استخدام ماصة نقل لإزالة ببطء وبلطف المخزن المؤقت لخفض مستواه حتى كلا القسمين الدماغ تماما فوق واجهة الهواء العازلة.
    ملاحظة: الحرص على تقليل اضطراب سطح العازلة، أو قد تطفو أقسام الدماغ بعيدا. عندما تجف، وهذا الصف من أقسام الدماغ تلتزم الشريحة بحزم. إذا لزم الأمر، قم بضبط المقاطع الموجودة على الشريحة برفق لضمان عدم وجود تجاعيد أو طيات في الأنسجة عندما تكون الأقسام لا تزال رطبة.
  4. كرر هذه العملية حتى يتم الوصول إلى أسفل الشريحة. استمر في التكرار حتى يتم تحميل كافة المقاطع على الشريحة (الشرائح).

5. تغطية

  1. بعد أن جفت جميع الأقسام (1-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة)، ضع 80-100 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد المضاد للتلاشي مع DAPI (انظر جدول المواد) على الشريحة، وتطبيق بلطف غطاء زجاجي لتغطية العينات.
    ملاحظة: تطبيق غطاء الزجاج بعناية وببطء لتجنب الفقاعات.
  2. ضع الشرائح في مربع شرائح المجهر (راجع جدول المواد) وخزنها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: صورة جميع المقاطع في غضون 1-3 أيام لتجنب يتلاشى من الفلورسينس وتطوير autofluorescence.

6. التصوير

  1. قم بتشغيل الماسح الضوئي والكمبيوتر (راجع جدول المواد). ضع الشرائح في حامل الشريحة مع جهاز التحميل وأدخل الحامل في الماسح الضوئي.
    ملاحظة: يتيح الماسح الضوئي مسح قنوات متعددة (على سبيل المثال، 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), قنوات خضراء وحمراء) في وقت واحد. المسح الضوئي الشرائح فقط مع التكبير 20x، ويمكن استخدام المجهر الفلوري التقليدي (انظر جدول المواد) عند الحاجة إلى تكبير أعلى (على سبيل المثال، 40x).
  2. افتح البرنامج للماسح الضوئي (راجع جدول المواد). اختر موقع التخزين المناسب وملف تعريف المسح الضوئي.
  3. ابدأ فحص المعاينة بالنقر على الزر بدء معاينة الفحص . بعد معاينة الفحص، افتح معالج الكشف عن الأنسجة وحلق حول المناطق التي تهم التصوير.
  4. انقر على زر بدء المسح الضوئي بعد اختيار المناطق للتصوير. انتظر حتى ينتهي الجهاز من المسح الضوئي. تحقق من ملف النتائج ثم قم بتصدير الصور.
    ملاحظة: إذا كان الملف الشخصي غير مناسب للشريحة، فاضبط عن طريق إعادة التركيز وتغيير وقت التعرض أو قوة الضوء لتكييف الملف الشخصي مع الأنسجة. راجع إرشادات الماسح الضوئي للحصول على مزيد من التفاصيل التقنية (جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الرسم البياني الانسيابي لهذا البروتوكول بإيجاز في الشكل 1. يظهر إجراء هذا المختبر في عملية استئصال البكاء في الشكل 2A، حيث تم تقسيم 5 عينات من الدماغ في وقت واحد. يظهر تركيب أقسام الدماغ في الشكل 2B ، ويتضح انزلاق محمول بالكامل مع أقسام الدماغ في الشكل 2C. في الشكل 3، صور الكيمياء المناعية الفلورية التمثيلية لقسم دماغ الفأر مع تلطيخ مشترك ل WFA و AVP عند التكبير السفلي والأعلى في Bregma -0.82 mm. لوحظت إشارات AVP في النواة شبه البطينية والنواة فوق البصرية. لوحظت إشارات WFA في المنطقة المحيطة من تحت المهاد الأمامي والنواة الشبكية.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفق الكيمياء المناعية الفلورية مع أدمغة الفئران. بعد التخدير الكامل، يتم تغلغل الماوس مع المالحة ومن ثم 10٪ NBF. تتم إزالة الدماغ بعناية وقطع إلى أقسام بعد التثبيت والجفاف. تم احتضان الأقسام مع WFA تليها ستريبتافيدين-دايلايت 488 بعد ثلاث يغسل مع برنامج تلفزيوني. تم حظر أقسام الدماغ ثم احتضانها بأجسام مضادة أولية ل AVP. ثم، تم غسلها أقسام 3 مرات مع برنامج تلفزيوني تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، اليكسا الدقيق 594 حمار المضادة الأرنب IgG (H + L). تم تركيب أقسام الدماغ على الشرائح وأغطية وضعت على الشرائح مع المتوسط تصاعد antifading مع DAPI قبل التصوير. الاختصارات: NBF = الفورمات المخزنة مؤقتا محايدة; WFA = ويستيريا فلوربوندا أغلوتينين; PBS = المالحة العازلة بالفوسفات؛ AVP = أرجينين فاسوبريسين; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور توضح عملية عملية البكاء وتصاعد في المختبر. (أ) بناء قاعدة على رأس لوحة مع السكروز 30٪ لعقد جميع العينات أفقيا، وقطع الأنسجة إلى أقسام (25 ميكرومتر / قسم) وجمع المقاطع في لوحة ثقافة الخلية 48 جيدا مليئة المالحة العازلة الفوسفات. (ب) غمر شريحة في الطبق مع نهاية واحدة مائلة قليلا مع موقف. ضع كل صف من المقاطع تحت واجهة المخزن المؤقت الجوي واخفض المخزن المؤقت لإخراج المقاطع من المخزن المؤقت حتى أسفل الشريحة. يشير الخط الأبيض إلى واجهة المخزن المؤقت والهواء. (ج) شريحة مثبتة بالكامل مع أقسام الدماغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على تلطيخ المناعة المزدوجة. (A-D) الصور المجهرية التي تبين توزيع WFA (الأحمر، A)، AVP (الأخضر، B)، DAPI (الأزرق، C)، ودمج (D) في أقسام الدماغ الماوس التاجي في Bregma -0.82 ملم. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (E-H) صور مجهرية أعلى للتكبير للصناديق البيضاء في A-D، على التوالي. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: 3V = البطين الثالث; PeFAH = منطقة بيريفورنيكال من تحت المهاد الأمامي; PVH = نواة البطين; RT = نواة شبكية; SON = النواة فوق البصرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة للدراسات التشريحية العصبية لدماغ الفأر ، بما في ذلك التشوه ، وتقسم الأنسجة ، والتشبع المناعي العائم الحر ، وتركيب الأنسجة ، والتصوير. ومع ذلك، يجب تحسين بعض التفاصيل الأساسية اللازمة لتحقيق نتائج متسقة وموثوقة.

نوعية التشوه أمر بالغ الأهمية لنجاح تلطيخ. قد تتأثر نتائج التلطيخ إذا بقي الدم في الدماغ، بالنظر إلى أن خلايا الدم (مثل خلايا الدم الحمراء) يمكن أن تولد تلطيخا اصطناعيا "إيجابيا"10. نستنتج وجود كبد بني رمادي للإشارة إلى جودة عالية من التشوه ، مما يؤدي عادة إلى أدمغة خالية من الدم. تساعد مضخة التشوه الآلي المستخدمة في هذا البروتوكول على بث واحد بنجاح في غضون فترة قصيرة. التثبيت غير الكافي سوف تولد أقسام الدماغ لينة وهشة في الإجراءات اللاحقة، في حين أن الإفراط في التثبيت سوف يقلل من حساسية ردود فعل مستضد بسبب تعزيز الفورمالديهايد عبر ربط البروتينات. تم اختبار ظروف مختلفة، وكان التثبيت بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية كافيا لتثبيت أدمغة الفئران بعد التثبيت. بالإضافة إلى 10٪ NBF المستخدمة في هذا البروتوكول كمخزن مؤقت مثبت، 4٪ (ث / v) من بارافورمالديهايد الطازجة (PFA) في برنامج تلفزيوني كما استخدمت على نطاق واسع لتثبيت الأنسجة11.

فيما يتعلق بالتبريد ، يجب تحديد سمك المقاطع اعتمادا على الاحتياجات المحددة. على سبيل المثال، تتطلب دراسات RNAscope سمك 14 ميكرومتر بدلا من 25 ميكرومتر، وتستخدم عادة في تلطيخ العائمة الحرة. وفي الوقت نفسه، تتطلب دراسات RNAscope أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في حلول خالية من RNAase للحفاظ على سلامة mRNAs الهدف. يستخدم بعض الباحثين أيضا سمك مقطع من 30-40 ميكرومتر لمجموعة متنوعة من إجراءات التلطيخ. يسمح قسم التبريد التقليدي (أي درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) بالعينات المدمجة في المركب) بأقسام الدماغ الأرق بكثير (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر) التي قد تكون حاسمة للهياكل داخل الخلايا أو التطبيقات الأخرى. استراتيجية cryosectioning المعروضة هنا لا تنطوي بالضرورة O.C.T. تضمين مركب من عينات الدماغ ويسمح لأقسام 14-40 ميكرومتر. قد لا يكون هناك فرق كبير ل3,3-diaminobenzidine (DAB) تلطيخ باستخدام 25 أو 40 ميكرومتر أقسام الدماغ سميكة. ومع ذلك، تقدم المقاطع الأرق صورا مضانة ذات جودة أفضل.

فائدة الاستراتيجية المعروضة هنا هي أن عينات الدماغ المتعددة (حتى 5 أدمغة) يمكن قطعها في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن الحد من هذه الطريقة هو أن عينات الدماغ تحتاج إلى خفض في غضون أسبوع واحد بعد الجفاف لأن الغمر في السكروز 30 ٪ لفترة طويلة جدا هو أكثر عرضة للتسبب في تدهور البروتين وغيرها من القضايا. لتجنب هذه المشكلة المحتملة، يمكن نقل هذه المقاطع الدماغ إلى المخزن المؤقت cryoprotectant وتخزينها في -20 درجة مئوية. بالنسبة للتلطيخ العائم الحر ، يجب تحسين مدة حضانة وتركيز كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية في الدراسات التجريبية. عموما، الحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة 4 درجة مئوية أو مع اهتزاز خفيف هو مناسب لمعظم الأجسام المضادة الأولية، إذا لم يتم إرشاد خلاف ذلك من قبل الشركات المصنعة. بالنسبة للأجسام المضادة الثانوية ، يعمل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 ساعة بشكل جيد في معظم الحالات. ومع ذلك، يجب تحسين هذه التفاصيل لظروف مختلفة. على سبيل المثال، بالنسبة لتلطيخ c-fos، فإننا عادة ما نحتضن أقسام الدماغ بتركيز 1:1000 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية لتلطيخ المناعة. ومع ذلك، باستخدام نفس الأجسام المضادة لتلطيخ C-fos DAB، نفضل احتضان أقسام الدماغ بتركيز 1:5,000 لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.

يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية للتلطيخ المزدوج لتسريع الإجراء. وبشكل أكثر تحديدا، يتم خلط جسمين مضادين أوليين مختلفين من أنواع مختلفة (على سبيل المثال، أحدهما من أرنب، والآخر من خنزير غينيا أو الدجاج أو الفأر) قبل الحضانة، وكذلك الأجسام المضادة الثانوية المقابلة. اختيار الأجسام المضادة الثانوية يعتمد على الأجسام المضادة الأولية. إذا كان الجسم المضاد الأساسي هو من أرنب، يجب أن يكون الجسم المضاد الثانوي المضادة للأرنب، على سبيل المثال، حمار المضادة للأرنب أو الماعز المضادة للأرنب. اختيار المصل حجب يعتمد على الأجسام المضادة الثانوية، على سبيل المثال، سيتم استخدام مصل الحمير العادي إذا كان الجسم المضاد الثانوي هو من حمار. ويقترح استرجاع مستضد إذا كان لا يزال لا يعمل المناعي حتى لو تم اتباع جميع المبادئ التوجيهية بدقة.

يجب إجراء التركيب والطي لأقسام الدماغ بطريقة دقيقة للغاية. العملية برمتها لا يتطلب أي التجاعيد، طيات، أو فقاعات الهواء. وسوف يستغرق عدة تجارب لتحديد الوقت الأمثل التعرض للتصوير. نوصي بنفس وقت التعرض لنفس الجسم المضاد عبر أقسام مختلفة ، وهو أمر ضروري لمقارنة كثافة الإشارة بين الحيوانات أو المجموعات المختلفة. من المعقول أن وقت التعرض قد لا يكون هو نفسه بالنسبة للأجسام المضادة المختلفة ، حتى في نفس القسم. فعلى سبيل المثال، قد يكون وقت التعرض ل DAPI أقصر من إشارة c-fos في معظم الحالات.

وهناك عدد قليل من الإجراءات المعروضة في البروتوكول مفيدة لتحسين الموثوقية والكفاءة على حد سواء طوال العملية برمتها. 1) استخدام مضخة التشوه الآلي للتشويش يمكن أن تقصير كبير في وقت التغلغل وتحسين جودة الأنسجة بشكل كبير. 2) هذه الاستراتيجية cryosectioning تمكن تشريح عينات الدماغ متعددة في وقت واحد، وهو أكثر كفاءة بكثير من الممارسة التقليدية. هذه الطريقة هي أيضا سهلة للباحثين الجدد للتعلم وإتقان. 3) لتلطيخ العائمة الحرة، وعينات الدماغ ملطخة في التعليق، يمكن للأجسام المضادة اختراق أقسام من كلا الجانبين. لقد قمنا بتحسين استراتيجية الحضانة من خلال وضع جميع الأقسام من عينة / سلسلة واحدة في أنبوب طرد دقيق سعة 1.5 مل للأجسام المضادة الأولية والثانوية ، مما يوفر الأجسام المضادة ، خاصة عندما نحتاج إلى وصم عينات الدماغ بكميات كبيرة. فائدة أخرى من نهج العائمة الحرة هو أنه يمكن تعديلها وتطبيقها على طرق أخرى تلطيخ الهسوتشيميكال (على سبيل المثال، IHC الكروموجينيك، hematoxylin وeosin، البنفسجي كريسيل) بالإضافة إلى تلطيخ immunofluorescence12.

ومع ذلك ، فإن أحد قيود التلطيخ العائم الحر هو أن الأقسام الرقيقة جدا يمكن أن يكون من الصعب التعامل معها. يمكن النظر في طريقة تلطيخ على الشريحة إذا كان هناك عدد قليل فقط من المقاطع التي تحتاج إلى جمعها وتلوينها على الفور ، كما هو الحال في كثير من الأحيان في علم الأمراض السريرية. كما اختبرنا طريقة تلطيخ الشرائح باستخدام أقسام الدماغ الناتجة عن هذا البروتوكول، وعملت بشكل جيد. للقيام بذلك، قم بتركيب أقسام الدماغ على الشرائح، وانتظر حتى تجف الأقسام، واتبع بروتوكول تلطيخ تقليدي مجمد على الشريحة. 4) تركيب أقسام عائمة حرة على الشرائح يمكن أن تكون مملة لبعض الباحثين، وخاصة بالنسبة للمبتدئين. نحن نستخدم فرشاة طلاء دقيقة لإقناع المقاطع بلطف على الشريحة في واجهة العازلة الهواء ومن ثم استخدام ماصة نقل لإزالة المخزن المؤقت بلطف لخفض واجهة عازلة الهواء كما تصاعد التقدم من أعلى إلى أسفل الشريحة. على الرغم من أن تستغرق وقتا طويلا، هذه الاستراتيجية هي ودية للمبتدئين. يمكن للمجربين ذوي الخبرة تحميل جميع أقسام العقول على الشرائح في PBS في وقت واحد وإزالة المخزن المؤقت فقط لإخراج الشريحة بعد تحميل القسم الأخير. 5) وأخيرا، نستخدم الماسح الضوئي للتصوير، وهو أكثر كفاءة من المجهر الفلوري، وخصوصا عندما يكون هناك عدد كبير من الشرائح للتصوير. يتيح الماسح الضوئي مسح ما يصل إلى 12 شريحة في دفعة واحدة بتكبير 20x. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المجهر الفلوري القياسي في ظروف معينة، على سبيل المثال، عندما يجب عرض مجموعة محددة من الخلايا العصبية في الدماغ مع تكبير أعلى (على سبيل المثال، 40x أو حتى 60x)13،14.

في الختام، تقدم هذه الورقة منهجية راسخة للدراسات النسيجية لأدمغة الفئران التي ثبت أنها قابلة للاستنساخ وموثوقة وفعالة. سيساعد البروتوكول على توليد نتائج النسيجية المثلى والمتسقة بين مختلف الباحثين والمختبرات وسيكون بمثابة مرجع للمبتدئين لتعلم هذه التقنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم المحققون بمنح من المعاهد القومية للصحة (K01DK119471 إلى CW؛ و19971 إلى الأسلحة الكيميائية؛ وC01DK19471 إلى الأسلحة الكيميائية؛ وC01DK119471 إلى الأسلحة الكيميائية؛ وC01DK1 P01DK113954, R01DK115761، R01DK117281، R01DK125480، وR01DK120858 إلى YX)، وزارة الزراعة الأمريكية / CRIS (51000-064-01S إلى YX)، وزمالة ما بعد الدكتوراه جمعية القلب الأمريكية (#829565) إلى LT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Tags

علم الأعصاب، العدد 176،
الطفو الحر مناعة أدمغة الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M.,… More

Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter