Summary
Denne protokol beskriver en effektiv og reproducerbar tilgang til musehjerne histologiske undersøgelser, herunder perfusion, hjernesektion, fritflydende immunstainning, vævsmontering og billeddannelse.
Abstract
Immunohistokemisk farvning af musehjerner er en rutinemæssig teknik, der almindeligvis anvendes i neurovidenskab til at undersøge centrale mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af energimetabolisme og andre neurobiologiske processer. Men kvaliteten, pålideligheden og reproducerbarheden af hjernens histologiresultater kan variere fra laboratorier til laboratorier. For hvert farvningseksperiment er det nødvendigt at optimere nøgleprocedurerne baseret på forskelle i arter, væv, målrettede proteiner og reagensernes arbejdsvilkår. Dette papir viser en pålidelig arbejdsgang i detaljer, herunder intra-aorta perfusion, hjernesektion, fritflydende immunstaining, vævsmontering og billeddannelse, som let kan følges af forskere på dette område.
Også diskuteret er, hvordan man kan ændre disse procedurer for at opfylde de enkelte behov for forskere. For at illustrere pålideligheden og effektiviteten af denne protokol blev perineuronale net farves med biotin-mærket Wisteria florbunda agglutinin (WFA) og arginin vasopressin (AVP) med et anti-AVP antistof i musehjernen. Endelig er de kritiske detaljer for hele proceduren blevet behandlet, og fordelene ved denne protokol i forhold til fordelene ved andre protokoller. Samlet set dette papir præsenterer en optimeret protokol for fritflydende immunstaining af musen hjernevæv. Efter denne protokol gør denne proces lettere for både junior og senior forskere til at forbedre kvaliteten, pålideligheden og reproducerbarheden af immunstaining undersøgelser.
Introduction
Forekomsten af fedme og tilknyttede comorbiditeter har nået epidemiske niveauer, hvilket har forårsaget en enorm socioøkonomisk byrde1,2. Forskellige musemodeller er blevet udviklet for bedre at forstå de biologiske processer, der er ansvarlige for fedme3,4. Fordi centrale mekanismer er vigtige for reguleringen af energi homøostase i disse dyremodeller, neuroanatomiske undersøgelser af musehjerner er blevet en nødvendig teknik på dette område. Men kvaliteten, pålideligheden og reproducerbarheden af hjernens histologiteknikker varierer betydeligt mellem laboratorier og endda forskere inden for samme laboratorium af forskellige årsager (f.eks. antistoffer, væv, behandlinger, arter, forskningsmål). Derfor er det nødvendigt at etablere en generel protokol for histologiske undersøgelser af musehjernen, herunder perfusion, hjernesektion, fritflydende immunstainning, vævsmontering og billeddannelse. I mellemtiden kan begyndere hurtigt lære, mestre og justere denne protokol for at tilfredsstille deres individuelle behov.
Immunohistokemisk farvning er en etableret metode, der er blevet brugt i vid udstrækning til at visualisere specifikke celletyper, mRNAs og proteiner i en række væv (f.eks. hjerne og perifert væv)5,6. Mere specifikt kan et interesseantigener mærkes ved et specifikt primært antistof og et tilsvarende sekundært antistof, der er knyttet til et enzym (f.eks. kromogen immunohistochemistry) eller et fluorescerende farvestof (fluorescein isothiocyanat)6. Som et eksempel på nytten af disse teknikker blev β-endorfin [en peptid kodet af pro-opiomelanocortin (POMC)] og c-fos (en markør for neuronal aktivitet) farvet i arcuatekernen. Sletning af tryptofanhydrxylase 2 (et enzym, der er integreret i serotoninsyntesen) i dorsal raphe-kernen, viste sig at mindske c-fos-ekspressionen i POMC-neuroner i arcuatekerne7. Derudover blev fordelingen af D-vitamin receptor mRNA kortlagt i musehjernen via in situ hybridisering (RNAscope)8. Dette papir præsenterer en pålidelig og effektiv metode med en trin-for-trin workflow for fritflydende immunstaining, der sigter mod at forbedre kvaliteten og reproducerbarheden af histologiske undersøgelser af musehjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J mus af begge køn (8-16 uger) blev anvendt i denne undersøgelse. Pleje af alle dyr og alle procedurer blev godkendt af Baylor College of Medicine's Institutionelle Animal Care and Use Udvalg.
1. Perfusion
BEMÆRK: Trin 1.1 - 1.6 udføres i en røghætte.
- Anæstesi
- Hæld 5 mL isoflurane (se materialetabellen) på et køkkenrulle, der er placeret i bunden af en udtørrer. Indfør musen på hul barrieren inde i udtørreren og vent, indtil tegn på åndedræt er forsvundet.
BEMÆRK: Uden åndedræt har musen stadig hjerteslag i en kort periode, og den vil blive gennemsyret, før hjerteslaget forsvinder. - Før du fortsætter, skal du bekræfte, at der ikke er nogen refleks til en tåspids.
- Fix musen til en skum bord ved at køre en nål gennem hver fod. Sørg for, at skumbrættet er placeret i en bakke for at opsamle væskeafsmitning.
- Hæld 5 mL isoflurane (se materialetabellen) på et køkkenrulle, der er placeret i bunden af en udtørrer. Indfør musen på hul barrieren inde i udtørreren og vent, indtil tegn på åndedræt er forsvundet.
- At udsætte hjertet
- Lav et langsgående overfladisk snit langs midterlinjen over brystkassen og maven, og flyt derefter huden til side for at udsætte brystkassens og mavens muskelvæg. Dernæst gøre et snit i muskellaget til at udsætte leveren og tarmen. Til sidst skæres brystkassen med en saks for at åbne brystkassen og udsætte hjerte og lunger. Brug hæmostatiske kræfter til at trække brystkassen til side for at udvide arbejdsområdet.
- Indsamling af terminalt blod (valgfrit)
- Sæt en 1 mL sprøjte (se materialetabellen) forsigtigt ind i hjertets højre atrium, indtil spidsen er helt indlejret. Hold sprøjten stabil og tegn langsomt blod, indtil det ønskede volumen er nået.
BEMÆRK: Pas på ikke at trænge forbi det rigtige atrium; Indsamling af 300-400 μL blod er opnåelig pr. voksen mus. Tilsætningsstoffer såsom en blodpropaccelerator eller antikagulant kan anvendes, afhængigt af formålet med blodopsamlingen.
- Sæt en 1 mL sprøjte (se materialetabellen) forsigtigt ind i hjertets højre atrium, indtil spidsen er helt indlejret. Hold sprøjten stabil og tegn langsomt blod, indtil det ønskede volumen er nået.
- Placering af perfusion kanylen
- For begyndere, skære et lille hul (<1 mm) i venstre ventrikel af hjertet med en saks og indsætte en stump kanyle (18 G nål til unge mus og 21 G nål til alderen mus) gennem venstre ventrikel i den stigende aorta. Alternativt, for erfarne eksperimentatorer, trænge ind i venstre hjerte ventrikel med en stump kanyle direkte og indsætte den i den stigende aorta omhyggeligt.
- Placer stifter omkring konjunktionen af kanylen og koblet slange på skumbrættet for at forhindre bevægelse under perfusion. Alternativt kan du bruge hæmostatiske kraft til at fastgøre kanylen på plads. Fortsæt med at skære det rigtige atrium for at tillade udstrømning af blod fra kredsløb.
BEMÆRK: Perfusions kanylen og den koblede slange er forbundet med perfusionspumpen.
- Perfusion med saltvand
- Tænd saltvandstrykskontakten, og gennemvæn musen transcardially med 40-60 mL saltvand (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7.4). Overhold udstrømningen fra højre atrium og leverens farve nøje.
BEMÆRK: En automatiseret perfusionspumpe (se materialetabellen) bruges til at skylle blodet inden for 1-2 min. Da pumpens trykområde er 1-300 mmHg, kan hastigheden justeres i overensstemmelse hermed. Hvis saltvand lækker fra næsen og/eller lungen er oppustet, skal trykket mindskes og kanylen justeres. Når udstrømningen ikke længere indeholder blod, hjernen er tilstrækkeligt skyllet med saltvand. I mellemtiden er leveren blottet for blod og bliver brunlig-grå i farve.
- Tænd saltvandstrykskontakten, og gennemvæn musen transcardially med 40-60 mL saltvand (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7.4). Overhold udstrømningen fra højre atrium og leverens farve nøje.
- Perfusion med formalin
- Sluk for saltvandstrykskontakten, og tænd formalintrykkontakten for at gennemtrænge musen med 40 mL 10% neutral buffer formalin (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, se materialetabellen). Overhold dyrets lemmer for tegn på rystelser.
BEMÆRK: Halebevægelse kan også observeres efter infusion af 10% NBF. FORSIGTIG: Da NBF er farligt, foreslås det, at forskere bærer personlige værnemidler (f.eks. passende åndedrætsværn, ansigtsskærm) under hele proceduren.
- Sluk for saltvandstrykskontakten, og tænd formalintrykkontakten for at gennemtrænge musen med 40 mL 10% neutral buffer formalin (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, se materialetabellen). Overhold dyrets lemmer for tegn på rystelser.
- Hjerneisolation9
- Brug en saks til at fjerne hovedet. Lav en midterlinje snit langs integument at udsætte kraniet. Trim huden og muskel vedhæftet fil med en saks.
- Lav et snit på orbital højderyg, og derefter placere den skarpe ende af iris saks i foramen magnum. Fremrykke saksen langs kraniets indre overflade, og hold opadgående tryk for at undgå skader på hjernen. Fjern parietal/frontal knogler og meninges omhyggeligt. Endelig fjerne hjernen fra det åbne kranium forsigtigt.
- Efter fiksering
- Placer hjernen i et 15 mL rør fyldt med 10 mL af 5% NBF og 15% saccharose for natten fiksering ved 4 °C.
BEMÆRK: For at forberede 10 mL 5% NBF og 15% saccharose skal der kombineres 5 mL 10% NBF og 5 mL 30% saccharose (w/v, opløst i fosfatbuffered saltvand (PBS), se Materialetabellen). Sørg for, at volumenet på fikseringsbufferen er mindst 10x større end selve prøven. I første omgang vil hjernen flyde i bufferen og vil synke til bunden efter natten fiksering.
- Placer hjernen i et 15 mL rør fyldt med 10 mL af 5% NBF og 15% saccharose for natten fiksering ved 4 °C.
- Dehydrering
- Hjerneprøven overføres til et 15 mL rør fyldt med 10 mL 30% saccharose til dehydrering ved 4 °C, indtil den synker.
2. Cryosectioning (koronar sektioner)
- Præparation
- Placer tøris oven på højdejusteringspladen på en glidende mikrotom, og vent, indtil hvid frost er synlig. Spred forsigtigt 5 mL 30% saccharose oven på pladen for at danne et lag af en solid base, efter at saccharoseopløsningen er helt frosset. Placer alle hjerneprøver (op til 5 hjerneprøver i et parti) vandret i en linje oven på saccharose, og tilsæt derefter 0,5 mL 30% saccharose til bunden af hver hjerne.
BEMÆRK: Hjernen vil straks holde sig til den frosne saccharosebase og gradvist fryse fra bund til top. Placer yderligere saccharose omkring den monterede del af hjernen til at danne en mere robust base for skæring.
- Placer tøris oven på højdejusteringspladen på en glidende mikrotom, og vent, indtil hvid frost er synlig. Spred forsigtigt 5 mL 30% saccharose oven på pladen for at danne et lag af en solid base, efter at saccharoseopløsningen er helt frosset. Placer alle hjerneprøver (op til 5 hjerneprøver i et parti) vandret i en linje oven på saccharose, og tilsæt derefter 0,5 mL 30% saccharose til bunden af hver hjerne.
- Skæring
- Efter 5-10 minutters frysning, når hjernen er blevet hård og hvid, trim hjernen, indtil det ønskede lag / region er nået.
BEMÆRK: Juster mængden af tøris på pladen for at styre temperaturen. Temperaturen er for lav, når iskrystaller vises på overfladen af hjernen. Temperaturen er for høj, når hjernen bliver blød og ikke længere er hvid. - Skift fra trimtilstand til feedtilstand og sektionshjernevæv til 25 μm tykkelse. Forbered en 48-brønd plade fyldt med 1x PBS, og markere fem brønde til en mus hjerne. Brug en pensel til at indsamle hver sektion fra en mus og placere den i en brønd. Saml den efterfølgende del af den samme mus og placere den i 2. brønd.
- Gentag 2.2.2 indtil 5. brønd er nået, og placer afsnit 6-10 i 1.-5. brønd og så videre. Gentag den samme procedure for resten af hjernen samtidigt. Gentag indtil alle sektioner fra en mus er samlet i de 5 brønde i anatomisk rækkefølge.
BEMÆRK: Efter denne procedure er hjernesektionerne fra hver mus aliquoted i 5 serier, som kan bruges til op til 5 forskellige histologiske undersøgelser.
- Efter 5-10 minutters frysning, når hjernen er blevet hård og hvid, trim hjernen, indtil det ønskede lag / region er nået.
- Oplagring
- Brug en pensel til at overføre sektionerne fra hver brønd til en 1,5 mL mikrotube fyldt med kryobeskyttende buffer (20% glycerol, 30% ethylenglycol og 50% PBS), og opbevar prøverne ved -20 °C.
BEMÆRK: Disse sektioner, der opbevares i små rør (1,5 mL), kan spare fysisk plads i fryseren, og sektionernes integritet kan bevares i flere måneder.
- Brug en pensel til at overføre sektionerne fra hver brønd til en 1,5 mL mikrotube fyldt med kryobeskyttende buffer (20% glycerol, 30% ethylenglycol og 50% PBS), og opbevar prøverne ved -20 °C.
3. Fritflydende WFA farvning og anti-AVP immunstaining
- Placer en celle si i en brønd af en 6-brønd celle kultur plade fyldt med PBS, og bruge en pensel til at overføre en række hjerne sektioner i cellen si. Skyl sektionerne i PBS ved at overføre cellesienren til en anden brønd fyldt med PBS. Skyl i 6 x 10 min på en shaker til sektioner opbevaret i kryobeskyttende buffer og 3 x 10 min for friskskårne sektioner.
BEMÆRK: Alle vaskeprocedurer udføres i en 6-brønds cellekulturplade med en celles si inde i hver brønd (se materialetabellen). Hver si holder hjernen sektioner af interesse fra hver mus. For at redde reagenser udføres alle de inkubationsprocedurer, der er beskrevet nedenfor, i et 1,5 mL mikrocentrifugerør. Mellem vask og inkubationsprocedurer skal du bruge en pensel til at overføre hjernesektionerne mellem hver celles si og hvert rør. Til vask med PBS er 12 mL tilstrækkelig til hver brønd. - Der fremstilles 1 mL biotin-mærket WFA-opløsning (1:1.000) i PBT (2,5 mL Triton X-100 opløst i 1.000 mL PBS) buffer i 1,5 mL rør. Overfør hjernesektioner fra celles si til røret og inkubere ved stuetemperatur på en gyngeplatform ~ 50 rpm natten over.
- Skyl hjernesektionerne med PBS i 3 x 10 min som beskrevet i punkt 3.1.
- Streptavidin-Dylight 488 (1:500) opløsning forberedes i PBT i et 1,5 mL rør. Overfør hjernesektioner ind i røret og inkuber ved stuetemperatur i 2 timer på en gyngeplatform ved ~ 50 rpm.
BEMÆRK: Dæk pladen med folie for at undgå lyseksponering fra dette trin fremad. - Skyl hjernesektionerne med PBS i 3 x 10 min. Inkuber hjernesektionerne i blokerende buffer (3% normalt æselserum fortyndet i PBT) i 2 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Valget af blokerende serum bestemmes af de arter, hvorfra det sekundære antistof genereres. f.eks. skal der anvendes normalt gedeserum, hvis det sekundære antistof kommer fra ged. - Inkuber hjernen sektioner i primære antistof (kanin anti-AVP, 1:500) ved stuetemperatur på en vuggende platform på ~ 50 rpm natten over.
BEMÆRK: Forbered både primære og sekundære antistoffer i blokeringsbufferen. Koncentrationen, inkubationstiden og inkubationens temperatur skal optimeres i pilotundersøgelser. - Skyl hjernesektionerne med PBS i 3 x 10 min. Inkubere hjernen sektioner i sekundært antistof (Alexa Flour 594 æsel anti-kanin IgG (H + L), 1:500) ved stuetemperatur i 2 timer på en gyngeplatform på ~ 50 rpm. Skyl hjernesektionerne med PBS i 3 x 10 min.
4. Montering
- Fyld to petriskåle (en diameter på 150 mm) med 100 mL 1x PBS hver. Overfør alle hjernesektionerne fra en si til den første skål, og juster hjernesektionerne i neuroanatomisk rækkefølge fra kaukasisk til rostral.
BEMÆRK: For at undgå at blande sektioner fra forskellige dyr skal du montere en række hjernesektioner fra et dyr ad gangen. - Når alle hjernesektionerne er justeret i den første ret, nedsænkes et dias i den anden skål med den ene ende let vipet med en stander (se figur 1 og figur 2). Brug en fin pensel til forsigtigt at placere en hjernesektion lige under luftbuffergrænsefladen på det vippede dias. Gentag den samme procedure med en anden hjernesektion og monter den side om side med den første sektion.
- Brug en overførsel pipette til langsomt og forsigtigt at fjerne bufferen for at sænke sit niveau, indtil begge hjernepartier er helt over luftbuffergrænsefladen.
BEMÆRK: Pas på at minimere forstyrrelsen af bufferoverfladen, eller hjernesektionerne kan flyde væk. Når den er tør, klæber denne række hjernesektioner fast til diaset. Om nødvendigt skal du forsigtigt justere sektionerne på diaset for at sikre, at der ikke er rynker eller folder i vævet, når sektionerne stadig er våde. - Gentag denne proces, indtil bunden af diaset er nået. Fortsæt med at gentage, indtil alle sektioner er monteret på diasene.
5. Coverslipping
- Når alle sektioner er tørret (1-24 timer ved stuetemperatur), skal du placere 80-100 μL anti-fading monteringsmedium med DAPI (se materialetabellen) på diaset og forsigtigt anvende et glascover til at dække prøverne.
BEMÆRK: Påfør glasdækslen forsigtigt og langsomt for at undgå bobler. - Placer diasene i en mikroskop slide boks (se tabellen over materialer) og gemme dem på 4 °C.
BEMÆRK: Billede alle sektioner inden for 1-3 dage for at undgå fading af fluorescens og udviklingen af autofluorescence.
6. Billeddannelse
- Tænd scanneren og computeren (se Materialetabel). Placer diasene i slidholderen sammen med lasteenheden, og sæt holderen i scanneren.
BEMÆRK: Scanneren muliggør scanning af flere kanaler (f.eks 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), grønne og røde kanaler) samtidigt. Scanneren scanner kun dias med en 20x forstørrelse, og et traditionelt fluorescerende mikroskop (se Materialetabel) kan bruges, når der er behov for en højere forstørrelse (f.eks. 40x). - Åbn softwaren til scanneren (se materialetabellen). Vælg den relevante lagerplacering og scanningsprofil.
- Start eksempelscanningen ved at klikke på knappen Søg i Start eksempel . Åbn guiden vævsdetektering efter eksempelscanningen, og cirkel mellem de områder, der er interessante for billeddannelse.
- Klik på knappen Start scanning , når du har valgt de områder, der skal søges efter billedbehandling. Vent på, at maskinen er færdig med scanningen. Kontroller resultatfilen, og eksporter billederne.
BEMÆRK: Hvis profilen er uegnet til diaset, justeres ved at fokusere og ændre eksponeringstiden eller lysstyrken for at tilpasse profilen til vævene. Yderligere oplysninger finder du i vejledningen til scanneren (Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutediagrammet for denne protokol er kort illustreret i figur 1. Dette laboratoriums kryosektionsprocedure er påvist i figur 2A, hvor 5 hjerneprøver blev opdelt samtidigt. Monteringen af hjernesektioner er vist i figur 2B, og et fuldt monteret dias med hjernesektioner er illustreret i figur 2C. I figur 3 blev der observeret repræsentative fluorescens immunohistochemistry billeder af en musehjernesektion med co-farvning af WFA og AVP ved lavere og højere forstørrelse ved Bregma -0,82 mm. AVP-signaler i paraventrikulær kerne og den supraoptiske kerne. WFA-signaler blev observeret i det perperiforniske område af den forreste hypothalamus og reticular nucleus.
Figur 1: Flow diagram over fluorescens immunohistochemistry med musehjerner. Efter fuldstændig anæstesi, en mus er gennemsyret med saltvand og derefter 10% NBF. Hjernen er omhyggeligt fjernet og skåret i sektioner efter fiksering og dehydrering. Sektionerne blev inkuberet med WFA efterfulgt af Streptavidin-Dylight 488 efter tre vaske med PBS. Hjernesektionerne blev blokeret og derefter inkuberet med et primært anti-AVP-antistof. Derefter blev sektionerne vasket 3 gange med PBS efterfulgt af inkubation med det sekundære antistof, Alexa Flour 594 æsel anti-kanin IgG (H + L). Hjernesektionerne blev monteret på dias og coverslips placeret på dias med antifading montering medium med DAPI før billeddannelse. Forkortelser: NBF = neutral buffered formalin; WFA = Wisteria florbunda agglutinin; PBS = fosfatbufferet saltvand; AVP = arginin vasopressin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billeder, der illustrerer praktisk kryosektion og montering i laboratoriet. A) Opbyg en base oven på pladen med 30 % saccharose for at holde alle prøver vandret, skære vævene i sektioner (25 μm/sektion) og samle sektionerne i en 48-brønds cellekulturplade fyldt med fosfatbufferet saltvand. (B) Dyk et dias i fadet med den ene ende let vipet med en stander. Placer hver række sektioner under luftbuffergrænsefladen, og sænk bufferen for at bringe sektionerne ud af bufferen indtil bunden af diaset. Den hvide linje angiver grænsefladen mellem buffer og luft. (C) En fuldt monteret rutschebane med hjerne sektioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Et eksempel på dobbelt immunfluorescence farvning. (A-D) Mikroskopiske billeder, der viser fordelingen af WFA (rød, A), AVP (grøn, B), DAPI (blå, C) og fusioneret (D) i koronar musehjerne sektioner på Bregma -0,82 mm. Skalastænger = 200 μm. (E-H) Højere forstørrelse mikroskopiske billeder af de hvide bokse i henholdsvis A-D. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: 3V = tredje ventrikel; PeFAH = perifornical område af den forreste hypothalamus; PVH = paraventrikulær kerne; RT = retikulær kerne; SON = supraoptisk kerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en etableret metode til neuroanatomiske undersøgelser af musehjernen, herunder perfusion, vævssektion, fritflydende immunstaining, vævsmontering og billeddannelse. Et par vigtige detaljer, der er afgørende for ensartede og pålidelige resultater, skal dog optimeres.
Kvaliteten af perfusion er afgørende for vellykket farvning. Farvningsresultater kan blive påvirket, hvis blodet forbliver i hjernen, da blodlegemer (f.eks. røde blodlegemer) kan generere en kunstig 'positiv' farvning10. Vi udleder tilstedeværelsen af en brunlig-grå lever for at indikere en høj kvalitet af perfusion, hvilket normalt resulterer i blodfrie hjerner. Den automatiserede perfusionspumpe, der anvendes i denne protokol, hjælper med at gennemtrænge et dyr med succes inden for en kort periode. Utilstrækkelig fiksering vil generere bløde og skrøbelige hjernesektioner i de efterfølgende procedurer, mens overfiksering vil reducere følsomheden af antigenreaktioner på grund af den forbedrede formaldehyd krydsbinding af proteiner. Forskellige forhold blev testet, og natten fiksering ved 4 °C var tilstrækkelig til post-fiksering af musehjerner. Ud over 10% NBF anvendes i denne protokol som en fiksativ buffer, 4% (w / v) af frisklavet paraformaldehyd (PFA) i PBS er også blevet flittigt anvendt til væv fiksering11.
Med hensyn til kryosectioning skal tykkelsen af sektioner besluttes afhængigt af de specifikke behov. For eksempel kræver RNAscope-undersøgelser en tykkelse på 14 μm i stedet for 25 μm, der almindeligvis anvendes i fritflydende farvning. I mellemtiden kræver RNAscope-undersøgelser, at alle procedurer udføres i RNAase-fri løsninger for at bevare integriteten af mål mRNAs. Nogle forskere bruger også en sektion tykkelse på 30-40 μm for en række farvning procedurer. Konventionel kryosektion (dvs. optimal skæretemperatur (O.C.T.) sammensatte indlejrede prøver) giver mulighed for meget tyndere (f.eks. 10 μm) hjernesektioner, der kan være afgørende for intracellulære strukturer eller andre applikationer. Den kryosektionsstrategi, der præsenteres her, involverer ikke nødvendigvis O.C.T. sammensætningsintegrering af hjerneprøver og giver mulighed for 14-40 μm sektioner. Der kan ikke være nogen signifikant forskel for 3,3-diaminobenzidin (DAB) farvning ved hjælp af 25 eller 40 μm tykke hjernesektioner. Tyndere sektioner tilbyder dog fluorescensbilleder af bedre kvalitet.
Fordelen ved den strategi, der præsenteres her, er, at flere hjerneprøver (op til 5 hjerner) kan skæres på én gang. Begrænsningen af denne metode er imidlertid, at hjerneprøver skal skæres inden for 1 uge efter dehydrering, fordi nedsænkning i 30% saccharose for længe er mere tilbøjelige til at forårsage proteinforringelse og andre problemer. For at undgå dette potentielle problem kan disse hjernesektioner overføres til kryobeskyttende buffer og opbevares ved -20 °C. For fritflydende farvning bør varigheden af inkubation og koncentration af både primære og sekundære antistoffer optimeres i pilotundersøgelser. Generelt er inkubation fra den ene dag til den anden ved 4 °C eller stuetemperatur med mild rysten passende for de fleste primære antistoffer, hvis den ikke instrueres på anden måde af producenterne. For sekundære antistoffer fungerer inkubation ved stuetemperatur i 1-3 timer godt i de fleste situationer. Disse detaljer skal dog optimeres til forskellige omstændigheder. For eksempel inkuberer vi typisk hjernesektionerne med en koncentration på 1:1.000 natten over ved 4 °C for immunfluorescencefarvning. Men ved hjælp af det samme antistof til c-fos DAB farvning foretrækker vi at inkubere hjernesektioner med en koncentration på 1:5.000 i 48 timer ved 4 °C.
En cocktail af primære antistoffer og sekundære antistoffer kan bruges til dobbeltfarvning for at fremskynde proceduren. Mere specifikt blandes to forskellige primære antistoffer fra forskellige arter (f.eks. den ene er fra kanin, den anden er fra marsvin, kylling eller mus) blandet før inkubation, ligesom de tilsvarende sekundære antistoffer. Valget af sekundært antistof afhænger af det primære antistof. Hvis det primære antistof er fra kanin, skal det sekundære antistof være antikanin, for eksempel æsel anti-kanin eller ged anti-kanin. Udvælgelsen af blokerende serum afhænger af det sekundære antistof, for eksempel vil normalt æselserum blive brugt, hvis det sekundære antistof er fra æsel. Antigen hentning foreslås, hvis immunstaining stadig ikke virker, selv om alle retningslinjer er blevet fulgt strengt.
Montering og omslag af hjernesektioner skal udføres på en meget delikat måde. Hele processen kræver ingen rynker, folder, eller luftbobler. Det vil tage flere forsøg at bestemme den optimale eksponeringstid for billeddannelse. Vi anbefaler den samme eksponeringstid for det samme antistof på tværs af forskellige sektioner, hvilket er afgørende for at sammenligne signalintensiteterne mellem forskellige dyr eller grupper. Det er rimeligt, at eksponeringstiden måske ikke er den samme for forskellige antistoffer, selv i samme afsnit. Eksponeringstiden for DAPI kan f.eks. være kortere end c-fos-signalet i de fleste tilfælde.
Et par procedurer, der præsenteres i protokollen, er nyttige til at forbedre både pålidelighed og effektivitet gennem hele processen. 1) Ved hjælp af en automatiseret perfusion pumpe for perfusion kan betydeligt forkorte perfusion tid og væsentligt forbedre vævskvaliteten. 2) Denne kryosektionsstrategi gør det muligt at skære flere hjerneprøver samtidigt, hvilket er meget mere effektivt end konventionel praksis. Denne metode er også let for nye forskere at lære og mestre. 3) For fritflydende farvning, som hjerneprøver er plettet i suspension, antistoffer kan trænge ind i sektioner fra begge sider. Vi optimerede inkubationsstrategien ved at placere alle sektioner fra en prøve/serie i et 1,5 mL mikrocentrifugerør til primære og sekundære antistoffer, hvilket sparer antistoffer, især når vi har brug for at plette hjerneprøver i bulk. En anden fordel ved den fritflydende tilgang er, at den kan ændres og anvendes på andre histokemiske farvningsmetoder (f.eks. kromogen IHC, hæmatoxylin og eosin, cresyl violet) ud over immunofluorescence farvning12.
En begrænsning af fritflydende farvning er imidlertid, at meget tynde sektioner kan være vanskelige at håndtere. En on-slide farvning metode kan overvejes, hvis kun et par sektioner skal indsamles og farves straks, som det ofte er tilfældet i klinisk patologi. Vi testede også on-slide farvningsmetoden ved hjælp af hjerneafsnit genereret fra denne protokol, og det fungerede godt. For at gøre dette skal du montere hjernesektionerne på dias, vente på, at sektionerne tørrer, og følge en traditionel frossen sektion på dias farvningsprotokollen. 4) Montering fritflydende sektioner på dias kan være kedeligt for visse forskere, især for begyndere. Vi bruger en fin pensel til forsigtigt at lokke sektioner på diaset ved luftbuffergrænsefladen og bruger derefter en overførselspipette til forsigtigt at fjerne bufferen for at sænke luftbuffergrænsefladen, når monteringen går fra toppen til bunden af diaset. Selvom det er tidskrævende, er denne strategi venlig for begyndere. Erfarne forsøgspersoner kan montere alle hjernesektionerne på diasene i PBS på én gang og kun fjerne bufferen for at bringe diaset ud, når den sidste sektion er monteret. 5) Endelig bruger vi en scanner til billeddannelse, som er mere effektiv end fluorescensmikroskopi, især når der er et stort antal dias til billeddannelse. Scanneren gør det muligt at scanne op til 12 dias i ét parti med en 20x forstørrelse. Alternativt kan standard fluorescensmikroskopi anvendes under visse omstændigheder, f.eks. når en bestemt klynge af neuroner i hjernen skal fremvises med en højere forstørrelse (f.eks. 40x eller endda 60x)13,14.
Afslutningsvis præsenterer dette papir en etableret metode til histologiske undersøgelser af musehjerner, der har vist sig at være reproducerbare, pålidelige og effektive. Protokollen vil bidrage til at generere optimale og konsekvente histologiske resultater blandt forskellige forskere og laboratorier og tjene som reference for begyndere at lære denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Efterforskerne blev støttet af tilskud fra NIH (K01DK119471 til CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 og R01DK120858 til YX), USDA/CRIS (51000-064-01S til YX) og American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) til LT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H.
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
