Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.
Abstract
Immunohistochemische kleuring van muizenhersenen is een routinetechniek die vaak wordt gebruikt in de neurowetenschappen om centrale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de regulatie van het energiemetabolisme en andere neurobiologische processen. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de histologische resultaten van de hersenen kan echter variëren tussen laboratoria. Voor elk kleuringsexperiment is het noodzakelijk om de belangrijkste procedures te optimaliseren op basis van verschillen in soorten, weefsels, gerichte eiwitten en de werkomstandigheden van de reagentia. Dit artikel demonstreert een betrouwbare workflow in detail, inclusief intra-aortaperfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselmontage en beeldvorming, die gemakkelijk kan worden gevolgd door onderzoekers op dit gebied.
Ook wordt besproken hoe deze procedures kunnen worden aangepast om aan de individuele behoeften van onderzoekers te voldoen. Om de betrouwbaarheid en efficiëntie van dit protocol te illustreren, werden perineuronale netten gekleurd met biotine-gelabelde Wisteria florbunda agglutinin (WFA) en arginine vasopressine (AVP) met een anti-AVP-antilichaam in de muizenhersenen. Ten slotte zijn de kritieke details voor de hele procedure behandeld en de voordelen van dit protocol ten opzichte van die van andere protocollen. Alles bij elkaar presenteert dit artikel een geoptimaliseerd protocol voor vrij zwevende immunostaining van hersenweefsel van muizen. Het volgen van dit protocol maakt dit proces gemakkelijker voor zowel junior als senior wetenschappers om de kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van immunostainingstudies te verbeteren.
Introduction
De prevalentie van obesitas en bijbehorende comorbiditeiten heeft epidemische niveaus bereikt, wat een enorme sociaaleconomische last veroorzaakt1,2. Er zijn verschillende muismodellen ontwikkeld om de biologische processen die verantwoordelijk zijn voor obesitas beter te begrijpen3,4. Omdat centrale mechanismen belangrijk zijn voor de regulatie van energiehomeostase in deze diermodellen, zijn neuroanatomische studies van muizenhersenen een noodzakelijke techniek op dit gebied geworden. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histologietechnieken in de hersenen variëren echter aanzienlijk tussen laboratoria en zelfs onderzoekers binnen hetzelfde laboratorium om verschillende redenen (bijv. Antilichamen, weefsels, behandelingen, soorten, onderzoeksdoelstellingen). Daarom is het noodzakelijk om een algemeen protocol vast te stellen voor histologische studies van de hersenen van muizen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Ondertussen kunnen beginners dit protocol snel leren, beheersen en aanpassen om aan hun individuele behoeften te voldoen.
Immunohistochemische kleuring is een gevestigde methode die op grote schaal is gebruikt om specifieke celtypen, mRNA's en eiwitten in verschillende weefsels (bijv. Hersenen en perifere weefsels) te visualiseren5,6. Meer specifiek kan een interessant antigeen worden gelabeld door een specifiek primair antilichaam en een overeenkomstig secundair antilichaam gekoppeld aan een enzym (bijvoorbeeld chromogene immunohistochemie) of een fluorescerende kleurstof (fluoresceïne-isothiocyanaat)6. Als voorbeeld van het nut van deze technieken werden β-endorfine [één peptide gecodeerd door pro-opiomelanocortine (POMC)] en c-fos (een marker van neuronale activiteit) gekleurd in de boogvormige kern. Deletie van tryptofaanhydroxylase 2 (een enzym dat integraal deel uitmaakt van de serotoninesynthese) in de dorsale raphe-kern bleek de c-fos-expressie in POMC-neuronen in de boogvormige kern7 te verminderen. Daarnaast werd de verdeling van vitamine D-receptor mRNA in het muizenbrein in kaart gebracht via in situ hybridisatie (RNAscope)8. Dit artikel presenteert een betrouwbare en efficiënte methode met een stapsgewijze workflow voor vrij zwevende immunostaining, met als doel de kwaliteit en reproduceerbaarheid van histologische studies van het muizenbrein te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J muizen van beide geslachten (8-16 weken oud) werden gebruikt in de huidige studie. De verzorging van alle dieren en alle procedures werden goedgekeurd door de institutional animal care and use committees van Baylor College of Medicine.
1. Perfusie
OPMERKING: Stappen 1.1 - 1.6 worden uitgevoerd in een zuurkast.
- Anesthesie
- Giet 5 ml isofluraan (zie de tabel met materialen) op een papieren handdoek die op de bodem van een exsiccator is geplaatst. Breng de muis op de holte barrière in de exsiccator en wacht tot tekenen van ademhaling zijn verdwenen.
OPMERKING: Zonder ademhaling heeft de muis nog steeds een hartslag voor een korte periode en zal deze worden doordrenkt voordat de hartslag verdwijnt. - Voordat u verder gaat, moet u bevestigen dat er geen reflex is voor een teenknijpen.
- Bevestig de muis aan een schuimplaat door een pin door elke voet te rijden. Zorg ervoor dat de schuimplaat in een bakje wordt geplaatst om overloop van vloeistof op te vangen.
- Giet 5 ml isofluraan (zie de tabel met materialen) op een papieren handdoek die op de bodem van een exsiccator is geplaatst. Breng de muis op de holte barrière in de exsiccator en wacht tot tekenen van ademhaling zijn verdwenen.
- Het hart blootleggen
- Maak een longitudinale oppervlakkige incisie langs de middellijn over de thorax en de buik en beweeg vervolgens de huid opzij om de spierwand van de thorax en de buik bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie in de spierlaag om de lever en de darm bloot te leggen. Knip ten slotte de ribbenkast met een schaar om de thorax te openen en het hart en de longen bloot te leggen. Gebruik een hemostatische tang om de ribbenkast opzij te trekken om het werkgebied te verbreden.
- Inzameling van terminaal bloed (optioneel)
- Steek een spuit van 1 ml (zie de materiaaltabel) voorzichtig in het rechteratrium van het hart totdat de punt volledig is ingebed. Houd de spuit stabiel en trek langzaam bloed totdat het gewenste volume is bereikt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet voorbij het rechter atrium dringt; Verzameling van 300-400 μL bloed is haalbaar per volwassen muis. Additieven zoals een stolselversneller of antistollingsmiddel kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het doel van de bloedafname.
- Steek een spuit van 1 ml (zie de materiaaltabel) voorzichtig in het rechteratrium van het hart totdat de punt volledig is ingebed. Houd de spuit stabiel en trek langzaam bloed totdat het gewenste volume is bereikt.
- Plaatsing van de perfusiecanule
- Voor beginners, knip een klein gaatje (<1 mm) in de linker ventrikel van het hart met een schaar en steek een stompe canule (18 G naald voor jonge muizen en 21 G naald voor oudere muizen) door de linker ventrikel in de oplopende aorta. Als alternatief, voor ervaren experimentatoren, penetreer de linker hartkamer met een stompe canule direct en breng deze voorzichtig in de opstijgende aorta in.
- Plaats pinnen rond de combinatie van de canule en de gekoppelde slang op de schuimplaat om beweging tijdens de perfusie te voorkomen. U kunt ook een hemostatische tang gebruiken om de canule op zijn plaats te bevestigen. Ga verder met het snijden van het rechteratrium om de uitstroom van bloed uit de bloedsomloop mogelijk te maken.
OPMERKING: De perfusiecanule en gekoppelde slang zijn aangesloten op de perfusiepomp.
- Perfusie met zoutoplossing
- Schakel de zoutoplossingdrukschakelaar in en perfuseer de muis transcardiaal met 40-60 ml zoutoplossing (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observeer de uitstroom uit het rechteratrium en de kleur van de lever nauwkeurig.
OPMERKING: Een geautomatiseerde perfusiepomp (zie de tabel met materialen) wordt gebruikt om het bloed binnen 1-2 minuten te spoelen. Omdat het drukbereik van de pomp 1-300 mmHg is, kan het toerental dienovereenkomstig worden aangepast. Als zoutoplossing uit de neus lekt en/of de long wordt opgeblazen, verlaag dan de druk en pas de canule aan. Zodra de uitstroom geen bloed meer bevat, worden de hersenen voldoende gespoeld met zoutoplossing. Ondertussen is de lever verstoken van bloed en wordt bruingrijs van kleur.
- Schakel de zoutoplossingdrukschakelaar in en perfuseer de muis transcardiaal met 40-60 ml zoutoplossing (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observeer de uitstroom uit het rechteratrium en de kleur van de lever nauwkeurig.
- Perfusie met formaline
- Schakel de zoutoplossingdrukschakelaar uit en schakel de formalinedrukschakelaar in om de muis te laten doordringen met 40 ml 10% neutraal gebufferd formaline (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, zie de tabel met materialen). Observeer de ledematen van het dier op bewijs van tremoren.
OPMERKING: Staartbeweging kan ook worden waargenomen na infusie van 10% NBF. LET OP: Aangezien NBF gevaarlijk is, wordt voorgesteld dat onderzoekers tijdens de procedure persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. Geschikt gasmasker, gezichtsscherm) dragen.
- Schakel de zoutoplossingdrukschakelaar uit en schakel de formalinedrukschakelaar in om de muis te laten doordringen met 40 ml 10% neutraal gebufferd formaline (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, zie de tabel met materialen). Observeer de ledematen van het dier op bewijs van tremoren.
- Hersenisolatie9
- Gebruik een schaar om de kop te verwijderen. Maak een middellijnincisie langs het omhulsel om de schedel bloot te leggen. Knip de huid en spieraanhechting af met een schaar.
- Maak een snede bij de orbitale richel en plaats vervolgens het scherpe uiteinde van de irisschaar in het foramen magnum. Schuif de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel en behoud de opwaartse druk om schade aan de hersenen te voorkomen. Verwijder de pariëtale/frontale botten en hersenvliezen voorzichtig. Verwijder ten slotte de hersenen voorzichtig van de geopende schedel.
- Post-fixatie
- Plaats de hersenen in een buis van 15 ml gevuld met 10 ml 5% NBF en 15% sucrose voor nachtelijke fixatie bij 4 °C.
OPMERKING: Om 10 ml 5% NBF en 15% sucrose te bereiden, combineert u 5 ml 10% NBF en 5 ml 30% sucrose (w / v, opgelost in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), zie de tabel met materialen). Zorg ervoor dat het volume van de fixatiebuffer ten minste 10x groter is dan het monster zelf. In eerste instantie zullen de hersenen in de buffer zweven en na nachtelijke fixatie naar de bodem zinken.
- Plaats de hersenen in een buis van 15 ml gevuld met 10 ml 5% NBF en 15% sucrose voor nachtelijke fixatie bij 4 °C.
- Dehydratie
- Breng het hersenmonster over in een buis van 15 ml gevuld met 10 ml 30% sucrose voor uitdroging bij 4 °C totdat het zinkt.
2. Cryosectie (coronale secties)
- Voorbereiding
- Plaats droogijs bovenop de hoogteverstelplaat van een glijdend microtoom en wacht tot witte vorst zichtbaar is. Verdeel voorzichtig 5 ml 30% sucrose over de plaat om een laag van een vaste basis te vormen nadat de sucrose-oplossing volledig is ingevroren. Plaats alle hersenmonsters (maximaal 5 hersenmonsters in één batch) horizontaal in een lijn bovenop de sucrose en voeg vervolgens 0,5 ml 30% sucrose toe aan de onderkant van elk brein.
OPMERKING: De hersenen zullen onmiddellijk aan de bevroren sucrosebasis blijven plakken en geleidelijk van onder naar boven bevriezen. Plaats extra sucrose rond het gemonteerde deel van de hersenen om een stevigere basis te vormen voor het snijden.
- Plaats droogijs bovenop de hoogteverstelplaat van een glijdend microtoom en wacht tot witte vorst zichtbaar is. Verdeel voorzichtig 5 ml 30% sucrose over de plaat om een laag van een vaste basis te vormen nadat de sucrose-oplossing volledig is ingevroren. Plaats alle hersenmonsters (maximaal 5 hersenmonsters in één batch) horizontaal in een lijn bovenop de sucrose en voeg vervolgens 0,5 ml 30% sucrose toe aan de onderkant van elk brein.
- Doorsnede
- Na 5-10 minuten bevriezen, wanneer de hersenen hard en wit zijn geworden, trimt u de hersenen totdat de gewenste laag / regio is bereikt.
OPMERKING: Pas de hoeveelheid droogijs op de plaat aan om de temperatuur te regelen. De temperatuur is te laag wanneer ijskristallen op het oppervlak van de hersenen verschijnen. De temperatuur is te hoog als de hersenen zacht worden en niet meer wit zijn. - Schakel over van de trimmodus naar de feedmodus en sectie hersenweefsel tot 25 μm dikte. Bereid een bord met 48 putten gevuld met 1x PBS en markeer vijf putjes voor één muizenbrein. Gebruik een penseel om elk gedeelte van één muis te verzamelen en in één put te plaatsen. Verzamel het volgende gedeelte van dezelfde muis en plaats het in de 2e put.
- Herhaal 2.2.2 totdat de 5e put is bereikt, plaats secties 6-10 in de 1e-5e put enzovoort. Herhaal dezelfde procedure voor de rest van de hersenen tegelijkertijd. Herhaal dit totdat alle secties van één muis in anatomische volgorde in de 5 putjes zijn verzameld.
OPMERKING: Na deze procedure worden de hersensecties van elke muis gealiquoteerd in 5 series, die kunnen worden gebruikt voor maximaal 5 verschillende histologische studies.
- Na 5-10 minuten bevriezen, wanneer de hersenen hard en wit zijn geworden, trimt u de hersenen totdat de gewenste laag / regio is bereikt.
- Opslag
- Gebruik een verfkwast om de secties van elke put over te brengen naar een microbuis van 1,5 ml gevuld met cryoprotectieve buffer (20% glycerol, 30% ethyleenglycol en 50% PBS) en bewaar de monsters bij -20 °C.
OPMERKING: Deze secties die in kleine buisjes (1,5 ml) zijn opgeslagen, kunnen fysieke ruimte in de vriezer besparen en de integriteit van de secties kan enkele maanden worden bewaard.
- Gebruik een verfkwast om de secties van elke put over te brengen naar een microbuis van 1,5 ml gevuld met cryoprotectieve buffer (20% glycerol, 30% ethyleenglycol en 50% PBS) en bewaar de monsters bij -20 °C.
3. Vrij zwevende WFA-kleuring en anti-AVP-immunostaining
- Plaats een celzeef in een put van een 6-well celkweekplaat gevuld met PBS en gebruik een penseel om een reeks hersensecties over te brengen naar de celzeef. Spoel de secties in PBS door de celzeef over te brengen naar een andere goed gevuld met PBS. Spoel gedurende 6 x 10 minuten op een shaker voor secties die zijn bewaard in cryoprotectieve buffer en 3 x 10 min voor vers gesneden secties.
OPMERKING: Alle wasprocedures worden uitgevoerd in een 6-well celkweekplaat met een celzeef in elke put (zie de tabel met materialen). Elke zeef bevat de hersensecties van belang van elke muis. Om reagentia te besparen, worden alle hieronder beschreven incubatieprocedures uitgevoerd in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Gebruik tussen de was- en incubatieprocedures een verfkwast om de hersensecties tussen elke celzeef en elke buis over te brengen. Voor het wassen met PBS is 12 ml voldoende voor elke put. - Bereid 1 ml biotine-gelabelde WFA (1:1.000) oplossing in PBT (2,5 ml Triton X-100 opgelost in 1.000 ml PBS) buffer in 1,5 ml buis. Breng hersensecties over van de celzeef naar de buis en incubeer bij kamertemperatuur op een schommelplatform ~ 50 rpm 's nachts.
- Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten zoals beschreven in 3.1.
- Bereid 1 ml streptavidin-Dylight 488 (1:500) oplossing in PBT in een buis van 1,5 ml. Breng hersensecties over in de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een schommelplatform bij ~ 50 tpm.
OPMERKING: Bedek de plaat met folie om blootstelling aan licht door deze stap voorwaarts te voorkomen. - Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten. Incubeer de hersensecties in de blokkerende buffer (3% normaal ezelserum verdund in PBT) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De keuze van het blokkerende serum wordt bepaald door de soort waaruit het secundaire antilichaam wordt gegenereerd. Als het secundaire antilichaam bijvoorbeeld van geiten is, moet normaal geitenserum worden gebruikt. - Incubeer de hersensecties in primair antilichaam (konijn anti-AVP, 1:500) bij kamertemperatuur op een schommelplatform bij ~ 50 rpm 's nachts.
OPMERKING: Bereid zowel primaire als secundaire antilichamen voor in de blokkerende buffer. De concentratie, de incubatieduur en de incubatietemperatuur moeten in pilotstudies worden geoptimaliseerd. - Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten. Incubeer de hersensecties in secundair antilichaam (Alexa Flour 594 ezel anti-konijn IgG (H + L), 1:500) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een schommelplatform bij ~ 50 tpm. Spoel de hersensecties met PBS gedurende 3 x 10 minuten.
4. Montage
- Vul twee petrischaaltjes (een diameter van 150 mm) met elk 100 ml 1x PBS. Breng alle hersensecties over van één zeef naar de eerste schotel en lijn de hersensecties in neuroanatomische volgorde uit van caudaal naar rostral.
OPMERKING: Om te voorkomen dat secties van verschillende dieren worden gemengd, monteert u één reeks hersensecties van één dier tegelijk. - Nadat alle hersensecties in de eerste schotel zijn uitgelijnd, dompelt u één schuif onder in de tweede schotel met één uiteinde enigszins gekanteld met een standaard (zie figuur 1 en figuur 2). Gebruik een fijne verfkwast om voorzichtig een hersengedeelte net onder de luchtbufferinterface op de gekantelde dia te plaatsen. Herhaal dezelfde procedure met een ander hersengedeelte en monteer het naast het eerste gedeelte.
- Gebruik een transferpipet om de buffer langzaam en voorzichtig te verwijderen om het niveau te verlagen totdat beide hersensecties zich volledig boven de luchtbufferinterface bevinden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de verstoring van het bufferoppervlak minimaliseert, anders kunnen de hersensecties wegdrijven. Wanneer droog, zal deze rij hersensecties zich stevig aan de dia hechten. Pas indien nodig de secties op de dia voorzichtig aan om ervoor te zorgen dat er geen rimpels of plooien in het weefsel zijn wanneer de secties nog nat zijn. - Herhaal dit proces totdat de onderkant van de dia is bereikt. Blijf herhalen totdat alle secties op de dia('s) zijn gemonteerd.
5. Coverslipping
- Nadat alle secties zijn gedroogd (1-24 uur bij kamertemperatuur), plaatst u 80-100 μL anti-fading montagemedium met DAPI (zie de tabel met materialen) op de dia en brengt u voorzichtig een glazen afdekplaat aan om de monsters te bedekken.
OPMERKING: Breng de glazen afdekplaat voorzichtig en langzaam aan om bubbels te voorkomen. - Plaats de dia's in een microscoopglaasdoos (zie de materiaaltabel) en bewaar ze bij 4 °C.
OPMERKING: Stel alle secties binnen 1-3 dagen voor om vervaging van fluorescentie en de ontwikkeling van autofluorescentie te voorkomen.
6. Beeldvorming
- Schakel de scanner en de computer in (zie Tabel met materialen). Plaats de dia's in de schuifhouder met de laadinrichting en plaats de houder in de scanner.
OPMERKING: De scanner maakt het scannen van meerdere kanalen (bijv. 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), groene en rode kanalen) tegelijkertijd mogelijk. De scanner scant dia's alleen met een vergroting van 20x en een traditionele fluorescerende microscoop (zie Tabel met materialen) kan worden gebruikt wanneer een hogere vergroting (bijv. 40x) nodig is. - Open de software voor de scanner (zie de tabel met materialen). Kies de juiste opslaglocatie en het juiste scanprofiel.
- Start de voorbeeldscan door op de knop Voorbeeldscan starten te klikken. Na de voorbeeldscan opent u de weefseldetectiewizard en omcirkelt u de gebieden die van belang zijn voor beeldvorming.
- Klik op de knop Scan starten nadat u de regio's voor beeldvorming hebt gekozen. Wacht tot het apparaat klaar is met scannen. Controleer het resultaatbestand en exporteer de afbeeldingen.
OPMERKING: Als het profiel niet geschikt is voor de dia, pas het dan aan door de belichtingstijd of lichtsterkte opnieuw scherp te stellen en te wijzigen om het profiel aan te passen aan de weefsels. Raadpleeg de instructies voor de scanner voor meer technische details (Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het stroomschema van dit protocol wordt kort geïllustreerd in figuur 1. De cryosectieprocedure van dit laboratorium is aangetoond in figuur 2A, waarbij 5 hersenmonsters tegelijkertijd werden gesneden. De montage van hersensecties is weergegeven in figuur 2B en een volledig gemonteerde dia met hersensecties is geïllustreerd in figuur 2C. In figuur 3, representatieve fluorescentie immunohistochemische beelden van een muizenhersensectie met co-kleuring van WFA en AVP bij lagere en hogere vergroting bij Bregma -0,82 mm. AVP-signalen werden waargenomen in de paraventriculaire kern en de supraoptische kern. WFA-signalen werden waargenomen in het perifornische gebied van de voorste hypothalamus en de reticulaire kern.
Figuur 1: Stroomdiagram van fluorescentie-immunohistochemie met muizenhersenen. Na volledige anesthesie wordt een muis doordrenkt met zoutoplossing en vervolgens 10% NBF. De hersenen worden zorgvuldig verwijderd en in secties gesneden na fixatie en uitdroging. De secties werden geïncubeerd met WFA gevolgd door Streptavidin-Dylight 488 na drie wasbeurten met PBS. De hersensecties werden geblokkeerd en vervolgens geïncubeerd met een primair anti-AVP-antilichaam. Vervolgens werden de secties 3 keer gewassen met PBS gevolgd door incubatie met het secundaire antilichaam, Alexa Flour 594 ezel anti-konijn IgG (H + L). De hersensecties werden gemonteerd op dia's en coverslips die op de dia's werden geplaatst met antifading montagemedium met DAPI vóór beeldvorming. Afkortingen: NBF = neutraal gebufferd formaline; WFA = Blauweregen florbunda agglutinine; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; AVP = arginine vasopressine; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Foto's van praktische cryosectie en montage in het laboratorium. (A) Bouw een basis op de bovenkant van de plaat met 30% sucrose om alle monsters horizontaal te houden, snijd de weefsels in secties (25 μm / sectie) en verzamel de secties in een 48-well celkweekplaat gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing. (B) Dompel een schuif in de schotel onder met het ene uiteinde iets gekanteld met een standaard. Plaats elke rij secties onder de luchtbufferinterface en verlaag de buffer om de secties uit de buffer te halen tot de onderkant van de dia. De witte lijn geeft het raakvlak van buffer en lucht aan. (C) Een volledig gemonteerde dia met hersensecties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een voorbeeld van dubbele immunofluorescentiekleuring. (A-D) Microscopische beelden die de verdeling van WFA (rood, A), AVP (groen, B), DAPI (blauw, C) en samengevoegd (D) in coronale muizenhersensecties bij Bregma -0,82 mm laten zien. Schaalbalken = 200 μm. (E-H) Microscopische afbeeldingen met een hogere vergroting van de witte vakken in respectievelijk A-D. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: 3V = derde ventrikel; PeFAH = perifornisch gebied van de voorste hypothalamus; PVH = paraventriculaire kern; RT = reticulaire kern; SON = supraoptische kern. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een gevestigde methode voor neuroanatomische studies van de muizenhersenen, waaronder perfusie, weefselsectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Een paar belangrijke details die essentieel zijn voor consistente en betrouwbare resultaten moeten echter worden geoptimaliseerd.
De kwaliteit van de perfusie is van cruciaal belang voor een succesvolle kleuring. Kleuringsresultaten kunnen worden beïnvloed als er bloed in de hersenen achterblijft, aangezien bloedcellen (bijvoorbeeld rode bloedcellen) een kunstmatige 'positieve' kleuring kunnen genereren10. We leiden de aanwezigheid van een bruingrijze lever af om een hoge kwaliteit van perfusie aan te geven, wat meestal resulteert in bloedvrije hersenen. De geautomatiseerde perfusiepomp die in dit protocol wordt gebruikt, helpt om één dier binnen een korte periode met succes te laten doordringen. Onvoldoende fixatie zal zachte en fragiele hersensecties genereren in de daaropvolgende procedures, terwijl overfixatie de gevoeligheid van antigeenreacties zal verminderen als gevolg van de verbeterde formaldehyde-crosslinking van eiwitten. Verschillende omstandigheden werden getest en nachtelijke fixatie bij 4 °C was voldoende voor postfixatie van muizenhersenen. Naast 10% NBF die in het huidige protocol als fixatieve buffer wordt gebruikt, is ook 4% (w/v) vers bereid paraformaldehyde (PFA) in PBS op grote schaal gebruikt voor weefselfixatie11.
Met betrekking tot cryosectie moet de dikte van secties worden bepaald afhankelijk van de specifieke behoeften. RNAscope-studies vereisen bijvoorbeeld een dikte van 14 μm in plaats van 25 μm, vaak gebruikt bij vrij zwevende beitsen. Ondertussen vereisen RNAscope-studies dat alle procedures worden uitgevoerd in RNAase-vrije oplossingen om de integriteit van de doel-mRNA's te behouden. Sommige onderzoekers gebruiken ook een sectiedikte van 30-40 μm voor verschillende kleuringsprocedures. Conventionele cryosectie (d.w.z. optimale snijtemperatuur (O.C.T.) samengestelde ingebedde monsters) zorgt voor veel dunnere (bijv. 10 μm) hersensecties die cruciaal kunnen zijn voor intracellulaire structuren of andere toepassingen. De cryosectiestrategie die hier wordt gepresenteerd, omvat niet noodzakelijkerwijs O.C.T. compound-embedding van hersenmonsters en maakt secties van 14-40 μm mogelijk. Er kan geen significant verschil zijn voor 3,3-diaminobenzidine (DAB) kleuring met behulp van 25 of 40 μm dikke hersensecties. Dunnere secties bieden echter fluorescentiebeelden van betere kwaliteit.
Het voordeel van de hier gepresenteerde strategie is dat meerdere hersenmonsters (tot 5 hersenen) in één keer kunnen worden gesneden. De beperking van deze methode is echter dat hersenmonsters binnen 1 week na uitdroging moeten worden gesneden, omdat onderdompeling in 30% sucrose gedurende te lang meer kans heeft op eiwitafbraak en andere problemen. Om dit mogelijke probleem te voorkomen, kunnen deze hersensecties worden overgebracht naar de cryoprotectieve buffer en worden opgeslagen bij -20 °C. Voor vrij zwevende kleuring moeten de incubatieduur en concentratie van zowel primaire als secundaire antilichamen worden geoptimaliseerd in pilotstudies. Over het algemeen is interubatie 's nachts bij 4 °C of kamertemperatuur met mild schudden geschikt voor de meeste primaire antilichamen, tenzij anders geïnstrueerd door fabrikanten. Voor secundaire antilichamen werkt incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1-3 uur in de meeste situaties goed. Deze details moeten echter worden geoptimaliseerd voor verschillende omstandigheden. Voor c-fos-kleuring incuberen we bijvoorbeeld meestal de hersensecties met een concentratie van 1: 1.000 's nachts bij 4 ° C voor immunofluorescentiekleuring. Met hetzelfde antilichaam voor c-fos DAB-kleuring geven we er echter de voorkeur aan om hersensecties te incuberen met een concentratie van 1:5.000 gedurende 48 uur bij 4 °C.
Een cocktail van primaire antilichamen en secundaire antilichamen kan worden gebruikt voor dubbele kleuring om de procedure te versnellen. Meer specifiek worden twee verschillende primaire antilichamen van verschillende soorten (bijvoorbeeld een is van konijn, de andere is van cavia, kip of muis) gemengd vóór incubatie, net als de overeenkomstige secundaire antilichamen. De keuze van het secundaire antilichaam is afhankelijk van het primaire antilichaam. Als het primaire antilichaam van konijn is, moet het secundaire antilichaam anti-konijn zijn, bijvoorbeeld ezel anti-konijn of geit anti-konijn. De selectie van blokkerend serum hangt af van het secundaire antilichaam, bijvoorbeeld, normaal ezelserum zal worden gebruikt als het secundaire antilichaam van ezel is. Antigeenherstel wordt voorgesteld als de immunostaining nog steeds niet werkt, zelfs als alle richtlijnen strikt zijn gevolgd.
Montage en afdekking van hersensecties moet op een zeer delicate manier worden uitgevoerd. Het hele proces vereist geen rimpels, plooien of luchtbellen. Het zal verschillende proeven vergen om de optimale belichtingstijd voor beeldvorming te bepalen. We raden dezelfde blootstellingstijd aan voor hetzelfde antilichaam in verschillende secties, wat essentieel is voor het vergelijken van de signaalintensiteiten tussen verschillende dieren of groepen. Het is redelijk dat de blootstellingstijd mogelijk niet hetzelfde is voor verschillende antilichamen, zelfs niet in dezelfde sectie. De belichtingstijd voor DAPI kan bijvoorbeeld in de meeste gevallen korter zijn dan het c-fos-signaal.
Een paar procedures die in het protocol worden gepresenteerd, zijn nuttig om zowel de betrouwbaarheid als de efficiëntie gedurende het hele proces te verbeteren. 1) Het gebruik van een geautomatiseerde perfusiepomp voor perfusie kan de perfusietijd aanzienlijk verkorten en de weefselkwaliteit aanzienlijk verbeteren. 2) Deze cryosectiestrategie maakt het mogelijk om meerdere hersenmonsters tegelijkertijd te snijden, wat veel efficiënter is dan de conventionele praktijk. Deze methode is ook gemakkelijk voor nieuwe onderzoekers om te leren en onder de knie te krijgen. 3) Voor vrij zwevende kleuring, als hersenmonsters in suspensie zijn gekleurd, kunnen antilichamen de secties van beide kanten binnendringen. We hebben de incubatiestrategie geoptimaliseerd door alle secties van één monster / serie in een microcentrifugebuis van 1,5 ml te plaatsen voor primaire en secundaire antilichamen, wat antilichamen bespaart, vooral wanneer we hersenmonsters in bulk moeten kleuren. Een ander voordeel van de free-floating benadering is dat het kan worden gewijzigd en toegepast op andere histochemische kleuringsmethoden (bijv. chromogene IHC, hematoxyline en eosine, cresylpottielje) naast immunofluorescentiekleuring12.
Een beperking van vrij zwevende vlekken is echter dat zeer dunne secties moeilijk te hanteren kunnen zijn. Een kleuringsmethode op dia kan worden overwogen als slechts een paar secties onmiddellijk hoeven te worden verzameld en gekleurd, zoals vaak het geval is in klinische pathologie. We hebben ook de on-slide kleuringsmethode getest met behulp van hersensecties die uit dit protocol zijn gegenereerd, en het werkte goed. Om dit te doen, monteert u de hersensecties op dia's, wacht u tot de secties zijn opgedroogd en volgt u een traditioneel protocol voor bevroren secties op diakleuring. 4) Het monteren van vrij zwevende secties op de dia's kan vervelend zijn voor bepaalde onderzoekers, vooral voor beginners. We gebruiken een fijne verfkwast om secties voorzichtig op de dia te coaxen op de luchtbufferinterface en gebruiken vervolgens een transferpipet om de buffer voorzichtig te verwijderen om de luchtbufferinterface te verlagen terwijl de montage van boven naar beneden van de dia vordert. Hoewel tijdrovend, is deze strategie vriendelijk voor beginners. Ervaren experimentatoren kunnen alle hersensecties in PBS in één keer op de dia's monteren en alleen de buffer verwijderen om de dia eruit te halen nadat de laatste sectie is gemonteerd. 5) Ten slotte gebruiken we een scanner voor beeldvorming, wat efficiënter is dan fluorescentiemicroscopie, vooral wanneer er een groot aantal dia's voor beeldvorming is. De scanner maakt het mogelijk om tot 12 dia's in één batch te scannen met een vergroting van 20x. Als alternatief kan standaard fluorescentiemicroscopie in bepaalde omstandigheden worden gebruikt, bijvoorbeeld wanneer een specifiek cluster van neuronen in de hersenen moet worden getoond met een hogere vergroting (bijv. 40x of zelfs 60x)13,14.
Concluderend presenteert dit artikel een gevestigde methodologie voor histologische studies van muizenhersenen waarvan is bewezen dat ze reproduceerbaar, betrouwbaar en efficiënt zijn. Het protocol zal helpen bij het genereren van optimale en consistente histologische resultaten tussen verschillende onderzoekers en laboratoria en dienen als referentie voor beginners om deze techniek te leren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De onderzoekers werden ondersteund door subsidies van de NIH (K01DK119471 aan CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 en R01DK120858 tot YX), USDA/CRIS (51000-064-01S tot YX) en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) tot LT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H.
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
