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Neuroscience

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62876
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1,4
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten und reproduzierbaren Ansatz für histologische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung.

Abstract

Die immunhistochemische Färbung von Mäusegehirnen ist eine Routinetechnik, die häufig in den Neurowissenschaften verwendet wird, um zentrale Mechanismen zu untersuchen, die der Regulation des Energiestoffwechsels und anderer neurobiologischer Prozesse zugrunde liegen. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Hirnhistologie kann jedoch zwischen den Labors variieren. Für jedes Färbeexperiment ist es notwendig, die Schlüsselverfahren basierend auf Unterschieden in Spezies, Geweben, Zielproteinen und den Arbeitsbedingungen der Reagenzien zu optimieren. Dieses Papier demonstriert einen zuverlässigen Workflow im Detail, einschließlich intraaortaler Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebender Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung, die von Forschern auf diesem Gebiet leicht verfolgt werden können.

Diskutiert wird auch, wie diese Verfahren modifiziert werden können, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Um die Zuverlässigkeit und Effizienz dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurden perineuronale Netze mit Biotin-markiertem Wisteria florbunda agglutinin (WFA) und Arginin-Vasopressin (AVP) mit einem Anti-AVP-Antikörper im Mausgehirn gefärbt. Schließlich wurden die kritischen Details für das gesamte Verfahren und die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu denen anderer Protokolle angesprochen. Zusammengenommen stellt dieser Artikel ein optimiertes Protokoll für die frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirngewebe vor. Die Einhaltung dieses Protokolls erleichtert diesen Prozess sowohl für Nachwuchs- als auch für Senior-Wissenschaftler, um die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Immunostaining-Studien zu verbessern.

Introduction

Die Prävalenz von Fettleibigkeit und damit verbundenen Komorbiditäten hat epidemische Ausmaße erreicht, was zu einer enormen sozioökonomischen Belastung führt1,2. Verschiedene Mausmodelle wurden entwickelt, um die biologischen Prozesse, die für Fettleibigkeit verantwortlich sind, besser zu verstehen3,4. Da in diesen Tiermodellen zentrale Mechanismen für die Regulation der Energiehomöostase wichtig sind, sind neuroanatomische Untersuchungen von Mausgehirnen zu einer notwendigen Technik auf diesem Gebiet geworden. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Hirnhistologietechniken variieren jedoch aus verschiedenen Gründen (z. B. Antikörper, Gewebe, Behandlungen, Spezies, Forschungsziele) erheblich zwischen Labors und sogar Forschern innerhalb desselben Labors. Daher ist es notwendig, ein allgemeines Protokoll für histologische Studien des Mausgehirns festzulegen, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. In der Zwischenzeit können Anfänger dieses Protokoll schnell erlernen, beherrschen und anpassen, um ihre individuellen Bedürfnisse zu erfüllen.

Die immunhistochemische Färbung ist eine etablierte Methode, die umfassend verwendet wurde, um spezifische Zelltypen, mRNAs und Proteine in einer Vielzahl von Geweben (z. B. Gehirn und periphere Gewebe) zu visualisieren5,6. Genauer gesagt kann ein Antigen von Interesse durch einen spezifischen primären Antikörper und einen entsprechenden sekundären Antikörper markiert werden, der mit einem Enzym (z. B. chromogener Immunhistochemie) oder einem fluoreszierenden Farbstoff (Fluoresceinisothiocyanat) verbunden ist6. Als Beispiel für den Nutzen dieser Techniken wurden β-Endorphin [ein Peptid, das von Pro-Opiomelanocortin (POMC) kodiert wird] und c-fos (ein Marker für neuronale Aktivität) im Bogenkern gefärbt. Es wurde gezeigt, dass die Deletion von Tryptophanhydroxylase 2 (ein enzymintegrante Serotoninsynthese) im dorsalen Raphe-Kern die c-fos-Expression in POMC-Neuronen im bogenförmigen Kern verringert7. Zusätzlich wurde die Verteilung der Vitamin-D-Rezeptor-mRNA im Mausgehirn mittels In-situ-Hybridisierung (RNAscope)8 kartiert. Dieser Beitrag stellt eine zuverlässige und effiziente Methode mit einem Schritt-für-Schritt-Workflow für die frei schwebende Immunfärbung vor, die darauf abzielt, die Qualität und Reproduzierbarkeit histologischer Studien des Mausgehirns zu verbessern.

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Protocol

C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts (8-16 Wochen) wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Die Pflege aller Tiere und alle Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Baylor College of Medicine genehmigt.

1. Durchblutung

HINWEIS: Die Schritte 1.1 - 1.6 werden in einem Abzug ausgeführt.

  1. Anästhesie
    1. Gießen Sie 5 ml Isofluran (siehe Materialtabelle) auf ein Papiertuch, das sich am Boden eines Exsikkators befindet. Führen Sie die Maus auf die durchlöcherte Barriere im Inneren des Exsikkators ein und warten Sie, bis die Anzeichen einer Atmung verschwunden sind.
      HINWEIS: Ohne Atmung hat die Maus für kurze Zeit noch Herzschlag und wird vor dem Verschwinden des Herzschlags durchblutet.
    2. Bevor Sie fortfahren, bestätigen Sie, dass es keinen Reflex auf ein Zehendrücken gibt.
    3. Befestigen Sie die Maus an einem Schaumstoffbrett, indem Sie einen Stift durch jeden Fuß fahren. Stellen Sie sicher, dass die Schaumstoffplatte in eine Schale gelegt wird, um das Verschütten von Flüssigkeit aufzufangen.
  2. Das Herz entblößen
    1. Machen Sie einen longitudinalen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie über thorax und Abdomen und bewegen Sie dann die Haut zur Seite, um die Muskelwand des Thorax und des Abdomens freizulegen. Als nächstes machen Sie einen Schnitt in der Muskelschicht, um die Leber und den Darm freizulegen. Zum Schluss schneiden Sie den Brustkorb mit einer Schere ab, um den Thorax zu öffnen und Herz und Lunge freizulegen. Ziehen Sie mit einer hämostatischen Pinzette den Brustkorb zur Seite, um den Arbeitsbereich zu erweitern.
  3. Entnahme von Terminalblut (optional)
    1. Führen Sie eine 1-ml-Spritze (siehe Materialtabelle) vorsichtig in den rechten Vorhof des Herzens ein, bis die Spitze vollständig eingebettet ist. Halten Sie die Spritze ruhig und ziehen Sie langsam Blut ab, bis das gewünschte Volumen erreicht ist.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht über den rechten Vorhof hinauszugehen; Eine Entnahme von 300-400 μL Blut ist pro erwachsener Maus erreichbar. Zusatzstoffe wie ein Gerinnselbeschleuniger oder ein Gerinnungshemmer können je nach Zweck der Blutentnahme verwendet werden.
  4. Platzierung der Perfusionskanüle
    1. Für Anfänger ein kleines Loch (<1 mm) in den linken Ventrikel des Herzens mit einer Schere schneiden und eine stumpfe Kanüle (18 G Nadel für junge Mäuse und 21 G Nadel für gealterte Mäuse) durch den linken Ventrikel in die aufsteigende Aorta einführen. Alternativ können Sie für erfahrene Experimentatoren den linken Herzventrikel direkt mit einer stumpfen Kanüle durchdringen und vorsichtig in die aufsteigende Aorta einführen.
    2. Platzieren Sie Stifte um die Verbindung der Kanüle und des gekoppelten Schlauches auf der Schaumstoffplatte, um Bewegungen während der Durchblutung zu verhindern. Alternativ können Sie eine hämostatische Pinzette verwenden, um die Kanüle an Ort und Stelle zu fixieren. Fahren Sie fort, den rechten Vorhof zu schneiden, um den Abfluss von Blut aus dem Kreislauf zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Perfusionskanüle und der gekoppelte Schlauch sind mit der Perfusionspumpe verbunden.
  5. Durchblutung mit Kochsalzlösung
    1. Schalten Sie den Salzdruckschalter ein und ziehen Sie die Maus transkardiell mit 40-60 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Beobachten Sie den Abfluss aus dem rechten Vorhof und die Farbe der Leber genau.
      HINWEIS: Eine automatisierte Perfusionspumpe (siehe Materialtabelle) wird verwendet, um das Blut innerhalb von 1-2 Minuten zu spülen. Da der Druckbereich der Pumpe 1-300 mmHg beträgt, kann die Drehzahl entsprechend eingestellt werden. Wenn Kochsalzlösung aus der Nase austritt und / oder die Lunge aufgeblasen ist, verringern Sie den Druck und stellen Sie die Kanüle ein. Sobald der Abfluss kein Blut mehr enthält, wird das Gehirn ausreichend mit Kochsalzlösung gespült. In der Zwischenzeit ist die Leber frei von Blut und wird bräunlich-grau in der Farbe.
  6. Perfusion mit Formalin
    1. Schalten Sie den Salzdruckschalter aus und schalten Sie den Formalin-Druckschalter ein, um die Maus mit 40 ml 10% neutral gepuffertem Formalin (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, siehe Materialtabelle) zu durchgießen. Beobachten Sie die Gliedmaßen des Tieres auf Anzeichen von Zittern.
      HINWEIS: Schwanzbewegung kann auch nach Infusion von 10% NBF beobachtet werden. VORSICHT: Da NBF gefährlich ist, wird empfohlen, dass Forscher während des gesamten Verfahrens persönliche Schutzausrüstung (z. B. geeignete Atemschutzmaske, Gesichtsschutz) tragen.
  7. Gehirnisolation9
    1. Verwenden Sie eine Schere, um den Kopf zu entfernen. Machen Sie einen Mittellinienschnitt entlang des Integuments, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Haut- und Muskelaufsatz mit einer Schere ab.
    2. Machen Sie einen Schnitt am Orbitalkamm und legen Sie dann das scharfe Ende der Irisschere in das Foramen magnum. Bewegen Sie die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels und halten Sie den Aufwärtsdruck aufrecht, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Entfernen Sie die parietalen / frontalen Knochen und Hirnhäute vorsichtig. Schließlich entfernen Sie das Gehirn vorsichtig aus dem geöffneten Schädel.
  8. Nachfixierung
    1. Legen Sie das Gehirn in ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml 5% NBF und 15% Saccharose gefüllt ist, zur Fixierung über Nacht bei 4 ° C.
      HINWEIS: Um 10 ml 5% NBF und 15% Saccharose herzustellen, kombinieren Sie 5 ml 10% NBF und 5 ml 30% Saccharose (w/v, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass das Volumen des fixativen Puffers mindestens 10x größer ist als die Probe selbst. Anfangs schwimmt das Gehirn im Puffer und sinkt nach der Fixierung über Nacht auf den Boden.
  9. Austrocknung
    1. Übertragen Sie die Gehirnprobe auf ein 15-ml-Röhrchen, das mit 10 ml 30% Saccharose zur Dehydrierung bei 4 ° C gefüllt ist, bis sie sinkt.

2. Kryosektion (koronale Abschnitte)

  1. Präparat
    1. Legen Sie Trockeneis auf die Höhenverstellplatte eines gleitenden Mikrotoms und warten Sie, bis weißer Frost sichtbar ist. Verteilen Sie vorsichtig 5 ml 30% Saccharose auf der Platte, um eine Schicht einer festen Basis zu bilden, nachdem die Saccharoselösung vollständig eingefroren ist. Legen Sie alle Gehirnproben (bis zu 5 Gehirnproben in einer Charge) horizontal in einer Linie auf der Saccharose und fügen Sie dann 0,5 ml 30% Saccharose auf den Boden jedes Gehirns hinzu.
      HINWEIS: Das Gehirn klebt sofort an der gefrorenen Saccharosebasis und friert allmählich von unten nach oben ein. Legen Sie zusätzliche Saccharose um den montierten Teil des Gehirns, um eine stabilere Basis für das Schneiden zu bilden.
  2. Schnittdarstellung
    1. Nach 5-10 Minuten Einfrieren, wenn das Gehirn hart und weiß geworden ist, trimmen Sie das Gehirn, bis die gewünschte Schicht / Region erreicht ist.
      HINWEIS: Stellen Sie die Menge an Trockeneis auf der Platte ein, um die Temperatur zu kontrollieren. Die Temperatur ist zu niedrig, wenn Eiskristalle auf der Oberfläche des Gehirns erscheinen. Die Temperatur ist zu hoch, wenn das Gehirn weich wird und nicht mehr weiß ist.
    2. Wechseln Sie vom Trim-Modus in den Feed-Modus und schneiden Sie Hirngewebe auf 25 μm Dicke. Bereiten Sie eine 48-Well-Platte vor, die mit 1x PBS gefüllt ist, und markieren Sie fünf Wells für ein Mausgehirn. Verwenden Sie einen Pinsel, um jeden Abschnitt von einer Maus zu sammeln und in eine Vertiefung zu legen. Sammeln Sie den nachfolgenden Abschnitt derselben Maus und legen Sie ihn in die 2. Vertiefung .
    3. Wiederholen Sie 2.2.2, bis die 5. Vertiefung erreicht ist, platzieren Sie die Abschnitte 6-10 in der 1. bis 5. Vertiefung und so weiter. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für den Rest des Gehirns gleichzeitig. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Abschnitte einer Maus in anatomischer Reihenfolge in den 5 Vertiefungen gesammelt sind.
      HINWEIS: Nach diesem Verfahren werden die Gehirnschnitte jeder Maus in 5 Serien aliquotediert, die für bis zu 5 verschiedene histologische Studien verwendet werden können.
  3. Lagerung
    1. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Abschnitte von jedem Bohrloch auf ein 1,5 ml Mikroröhrchen zu übertragen, das mit kryoprotektivem Puffer (20% Glycerin, 30% Ethylenglykol und 50% PBS) gefüllt ist, und lagern Sie die Proben bei -20 ° C.
      HINWEIS: Diese Abschnitte, die in kleinen Röhrchen (1,5 ml) gelagert werden, können Platz im Gefrierschrank sparen, und die Integrität der Abschnitte kann für mehrere Monate erhalten bleiben.

3. Freischwebende WFA-Färbung und Anti-AVP-Immunfärbung

  1. Legen Sie ein Zellsieb in eine Vertiefung einer mit PBS gefüllten 6-Well-Zellkulturplatte und verwenden Sie einen Pinsel, um eine Reihe von Gehirnabschnitten in das Zellsieb zu übertragen. Spülen Sie die Abschnitte in PBS ab, indem Sie das Zellsieb in eine andere mit PBS gefüllte Vertiefung überführen. Spülen Sie 6 x 10 min auf einem Shaker für Abschnitte, die in Kryoprotektorpuffer gelagert sind, und 3 x 10 min für frisch geschnittene Abschnitte.
    HINWEIS: Alle Waschvorgänge werden in einer 6-Well-Zellkulturplatte mit einem Zellsieb in jedem Bohrloch durchgeführt (siehe Materialtabelle). Jedes Sieb hält die Gehirnabschnitte von Interesse von jeder Maus. Um Reagenzien zu sparen, werden alle unten beschriebenen Inkubationsverfahren in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt. Verwenden Sie zwischen dem Waschen und der Inkubation einen Pinsel, um die Gehirnabschnitte zwischen jedem Zellsieb und jedem Röhrchen zu übertragen. Für das Waschen mit PBS sind 12 ml für jeden Brunnen ausreichend.
  2. 1 ml Biotin-markierte WFA-Lösung (1:1.000) in PBT-Puffer (2,5 ml Triton X-100 gelöst in 1.000 ml PBS) in einem 1,5-ml-Röhrchen herstellen. Übertragen Sie Gehirnabschnitte vom Zellsieb in die Röhre und inkubieren Sie bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform ~ 50 U / min über Nacht.
  3. Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min, wie in 3.1 beschrieben.
  4. 1 ml Streptavidin-Dylight 488 (1:500)-Lösung in PBT in einem 1,5-ml-Röhrchen zubereiten. Gehirnabschnitte in die Röhre übertragen und bei Raumtemperatur 2 h auf einer Schaukelplattform mit ~50 U/min inkubieren.
    HINWEIS: Decken Sie die Platte mit Folie ab, um Lichteinwirkung von diesem Schritt nach vorne zu vermeiden.
  5. Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min. Inkubieren Sie die Gehirnschnitte in blockierendem Puffer (3% normales Eselserum verdünnt in PBT) für 2 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Die Wahl des blockierenden Serums wird durch die Spezies bestimmt, aus der der sekundäre Antikörper erzeugt wird. z.B. wenn der sekundäre Antikörper von Ziege stammt, sollte normales Ziegenserum verwendet werden.
  6. Inkubieren Sie die Gehirnabschnitte in primären Antikörpern (Kaninchen-Anti-AVP, 1:500) bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform bei ~ 50 U / min über Nacht.
    HINWEIS: Bereiten Sie sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper im Blockierungspuffer vor. Die Konzentration, die Dauer der Inkubation und die Temperatur der Inkubation müssen in Pilotstudien optimiert werden.
  7. Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min. Inkubieren Sie die Hirnschnitte in sekundären Antikörpern (Alexa Flour 594 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L), 1:500) bei Raumtemperatur für 2 h auf einer Schaukelplattform bei ~50 U/min. Spülen Sie die Gehirnschnitte mit PBS für 3 x 10 min.

4. Montage

  1. Füllen Sie zwei Petrischalen (Durchmesser 150 mm) mit je 100 ml 1x PBS. Übertragen Sie alle Gehirnabschnitte von einem Sieb in die erste Schale und richten Sie die Gehirnabschnitte in neuroanatomischer Reihenfolge von kaudal bis rostral aus.
    HINWEIS: Um zu vermeiden, dass Abschnitte von verschiedenen Tieren vermischt werden, montieren Sie eine Reihe von Gehirnabschnitten von jeweils einem Tier.
  2. Nachdem alle Gehirnabschnitte in der ersten Schüssel ausgerichtet sind, tauchen Sie einen Schieber in die zweite Schüssel mit einem leicht geneigten Ende mit einem Ständer ein (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um einen Gehirnabschnitt direkt unter der Luftpufferschnittstelle vorsichtig auf den geneigten Schlitten zu legen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit einem anderen Gehirnabschnitt und montieren Sie ihn Seite an Seite mit dem ersten Abschnitt.
  3. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Puffer langsam und vorsichtig zu entfernen, um sein Niveau zu senken, bis beide Gehirnabschnitte vollständig über der Luft-Puffer-Schnittstelle liegen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Störung der Pufferoberfläche zu minimieren, da sonst die Gehirnabschnitte wegschweben können. Wenn sie trocken ist, haftet diese Reihe von Gehirnabschnitten fest an der Rutsche. Passen Sie bei Bedarf die Abschnitte auf dem Objektträger vorsichtig an, um sicherzustellen, dass keine Falten oder Falten im Gewebe vorhanden sind, wenn die Abschnitte noch nass sind.
  4. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der untere Teil der Folie erreicht ist. Wiederholen Sie den Vorgang so lange, bis alle Abschnitte auf dem/den Dia(s) montiert sind.

5. Coverlipping

  1. Nachdem alle Abschnitte getrocknet sind (1-24 h bei Raumtemperatur), legen Sie 80-100 μL Anti-Fading-Montagemedium mit DAPI (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger und tragen Sie vorsichtig einen Glasdeckglas auf, um die Proben abzudecken.
    HINWEIS: Tragen Sie den Glasdeckglas vorsichtig und langsam auf, um Blasen zu vermeiden.
  2. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerkasten (siehe Materialtabelle) und lagern Sie sie bei 4 °C.
    HINWEIS: Bilden Sie alle Abschnitte innerhalb von 1-3 Tagen ab, um ein Verblassen der Fluoreszenz und die Entwicklung von Autofluoreszenz zu vermeiden.

6. Bildgebung

  1. Schalten Sie den Scanner und den Computer ein (siehe Materialtabelle). Positionieren Sie die Dias im Diahalter mit der Ladevorrichtung und setzen Sie die Halterung in den Scanner ein.
    HINWEIS: Der Scanner ermöglicht das scannen mehrerer Kanäle (z. B. 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), grüne und rote Kanäle) gleichzeitig. Der Scanner scannt Dias nur mit einer 20-fachen Vergrößerung, und ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) kann verwendet werden, wenn eine höhere Vergrößerung (z. B. 40-fach) erforderlich ist.
  2. Öffnen Sie die Software für den Scanner (siehe Tabelle der Materialien). Wählen Sie den entsprechenden Speicherort und das entsprechende Scanprofil aus.
  3. Starten Sie den Vorschauscan, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschauscan starten klicken. Öffnen Sie nach dem Vorschauscan den Gewebeerkennungsassistenten und kreisen Sie die Bereiche ein, die für die Bildgebung von Interesse sind.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan starten, nachdem Sie die Regionen für die Bildgebung ausgewählt haben. Warten Sie, bis das Gerät den Scanvorgang abgeschlossen hat. Überprüfen Sie die Ergebnisdatei und exportieren Sie die Bilder.
    HINWEIS: Wenn das Profil für das Dia ungeeignet ist, passen Sie es an, indem Sie die Belichtungszeit oder Lichtstärke neu fokussieren und ändern, um das Profil an das Gewebe anzupassen. Weitere technische Details finden Sie in den Anweisungen für den Scanner (Tabelle der Materialien).

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Representative Results

Das Flussdiagramm dieses Protokolls ist in Abbildung 1 kurz dargestellt. Das Kryosektionsverfahren dieses Labors ist in Abbildung 2A dargestellt, in der 5 Gehirnproben gleichzeitig geschnitten wurden. Die Montage von Hirnschnitten ist in Abbildung 2B dargestellt, und ein vollständig montierter Objektträger mit Hirnschnitten ist in Abbildung 2C dargestellt. In Abbildung 3 wurden repräsentative fluoreszenzimhibistochemische Bilder eines Mausgehirnschnitts mit Co-Färbung von WFA und AVP bei niedrigerer und höherer Vergrößerung bei Bregma -0,82 mm beobachtet. AVP-Signale wurden im paraventrikulären Kern und im supraoptischen Kern beobachtet. WFA-Signale wurden im perifornischen Bereich des vorderen Hypothalamus und des retikulären Kerns beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm der Fluoreszenzimmunhistochemie mit Mausgehirnen. Nach vollständiger Narkose wird eine Maus mit Kochsalzlösung und dann 10% NBF durchblutet. Das Gehirn wird vorsichtig entfernt und nach Fixierung und Dehydrierung in Abschnitte geschnitten. Die Abschnitte wurden mit WFA inkubiert, gefolgt von Streptavidin-Dylight 488 nach drei Wäschen mit PBS. Die Hirnschnitte wurden blockiert und dann mit einem primären Anti-AVP-Antikörper inkubiert. Dann wurden die Abschnitte 3 Mal mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit dem sekundären Antikörper Alexa Flour 594 Esel Anti-Kaninchen IgG (H + L). Die Gehirnschnitte wurden auf Dias und Deckgläsern montiert, die vor der Bildgebung mit Antifading-Montagemedium mit DAPI auf die Dias gelegt wurden. Abkürzungen: NBF = neutrales gepuffertes Formalin; WFA = Glyzinien florbunda agglutinin; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; AVP = Arginin Vasopressin; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Fotos, die die praktische Kryosektion und Montage im Labor veranschaulichen. (A) Bauen Sie eine Basis auf der Platte mit 30% Saccharose auf, um alle Proben horizontal zu halten, schneiden Sie die Gewebe in Abschnitte (25 μm / Abschnitt) und sammeln Sie die Abschnitte in eine 48-Well-Zellkulturplatte, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gefüllt ist. (B) Tauchen Sie einen Schieber mit einem leicht geneigten Ende mit einem Ständer in die Schüssel. Platzieren Sie jede Reihe von Abschnitten unter der Luftpufferschnittstelle und senken Sie den Puffer ab, um die Abschnitte bis zum unteren Rand der Folie aus dem Puffer zu entfernen. Die weiße Linie zeigt die Schnittstelle von Puffer und Luft an. (C) Ein vollständig montierter Schlitten mit Gehirnschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ein Beispiel für eine doppelte Immunfluoreszenzfärbung. (A-D) Mikroskopische Aufnahmen, die die Verteilung von WFA (rot, A), AVP (grün, B), DAPI (blau, C) und verschmolzen (D) in koronalen Mausgehirnschnitten bei Bregma -0,82 mm zeigen. Maßstabsbalken = 200 μm. (E-H) Mikroskopische Aufnahmen der weißen Kästchen in A-D mit höherer Vergrößerung. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: 3V = dritter Ventrikel; PeFAH = perifornischer Bereich des vorderen Hypothalamus; PVH = paraventrikulärer Kern; RT = retikulärer Kern; SON = supraoptischer Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode für neuroanatomische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Gewebeschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. Einige wichtige Details, die für konsistente und zuverlässige Ergebnisse unerlässlich sind, müssen jedoch optimiert werden.

Die Qualität der Perfusion ist entscheidend für eine erfolgreiche Färbung. Die Färbeergebnisse können beeinträchtigt werden, wenn Blut im Gehirn verbleibt, da Blutkörperchen (z. B. rote Blutkörperchen) eine künstliche "positive" Färbung erzeugen können10. Wir schließen auf das Vorhandensein einer bräunlich-grauen Leber, um auf eine hohe Qualität der Perfusion hinzuweisen, die normalerweise zu blutfreien Gehirnen führt. Die in diesem Protokoll verwendete automatisierte Perfusionspumpe hilft, ein Tier innerhalb kurzer Zeit erfolgreich zu perfundieren. Eine unzureichende Fixierung erzeugt in den nachfolgenden Verfahren weiche und zerbrechliche Hirnschnitte, während eine Überfixierung die Empfindlichkeit von Antigenreaktionen aufgrund der verstärkten Formaldehydvernetzung von Proteinen verringert. Verschiedene Bedingungen wurden getestet, und die Fixierung über Nacht bei 4 °C reichte für die Postfixierung von Mausgehirnen aus. Zusätzlich zu 10% NBF, das im vorliegenden Protokoll als fixativer Puffer verwendet wird, wurden 4% (w/v) frisch zubereitetes Paraformaldehyd (PFA) in PBS auch ausgiebig für die Gewebefixierung verwendet11.

In Bezug auf die Kryosektion muss die Dicke der Abschnitte in Abhängigkeit von den spezifischen Bedürfnissen festgelegt werden. Zum Beispiel erfordern RNAscope-Studien eine Dicke von 14 μm anstelle von 25 μm, die üblicherweise in der freischwebenden Färbung verwendet wird. In der Zwischenzeit erfordern RNAscope-Studien, dass alle Verfahren in RNAase-freien Lösungen durchgeführt werden, um die Integrität der Ziel-mRNAs zu erhalten. Einige Forscher verwenden auch eine Schnittdicke von 30-40 μm für eine Vielzahl von Färbeverfahren. Die konventionelle Kryosektion (d. h. Proben mit optimaler Schnitttemperatur (O.C T) ermöglicht viel dünnere (z. B. 10 μm) Gehirnschnitte, die für intrazelluläre Strukturen oder andere Anwendungen entscheidend sein können. Die hier vorgestellte Kryosektionsstrategie beinhaltet nicht unbedingt die O.C.T.-Compound-Einbettung von Hirnproben und ermöglicht 14-40 μm-Abschnitte. Es kann keinen signifikanten Unterschied für die 3,3-Diaminobenzidin (DAB) -Färbung mit 25 oder 40 μm dicken Hirnschnitten geben. Dünnere Abschnitte bieten jedoch Fluoreszenzbilder in besserer Qualität.

Der Vorteil der hier vorgestellten Strategie besteht darin, dass mehrere Gehirnproben (bis zu 5 Gehirne) gleichzeitig geschnitten werden können. Die Einschränkung dieser Methode besteht jedoch darin, dass Gehirnproben innerhalb von 1 Woche nach der Dehydrierung geschnitten werden müssen, da ein zu langes Eintauchen in 30% Saccharose eher zu Proteinabbau und anderen Problemen führt. Um dieses potenzielle Problem zu vermeiden, können diese Hirnschnitte in den kryoprotektiven Puffer übertragen und bei -20 °C gelagert werden. Für die freischwebende Färbung sollten die Dauer der Inkubation und die Konzentration sowohl primärer als auch sekundärer Antikörper in Pilotstudien optimiert werden. Im Allgemeinen ist die inkubation über Nacht bei 4 °C oder Raumtemperatur mit leichtem Schütteln für die meisten primären Antikörper geeignet, sofern die Hersteller nichts anderes vorschreiben. Bei sekundären Antikörpern funktioniert die Inkubation bei Raumtemperatur für 1-3 h in den meisten Situationen gut. Diese Details müssen jedoch für verschiedene Umstände optimiert werden. Zum Beispiel inkubieren wir für die C-Fos-Färbung typischerweise die Hirnschnitte mit einer Konzentration von 1:1.000 über Nacht bei 4 ° C für die Immunfluoreszenzfärbung. Wenn wir jedoch den gleichen Antikörper für die c-fos DAB-Färbung verwenden, ziehen wir es vor, Gehirnschnitte mit einer Konzentration von 1:5.000 für 48 h bei 4 ° C zu inkubieren.

Ein Cocktail aus primären Antikörpern und sekundären Antikörpern könnte für die Doppelfärbung verwendet werden, um das Verfahren zu beschleunigen. Genauer gesagt werden vor der Inkubation zwei verschiedene primäre Antikörper von verschiedenen Spezies (z. B. einer ist von Kaninchen, der andere von Meerschweinchen, Huhn oder Maus) gemischt, ebenso wie die entsprechenden sekundären Antikörper. Die Wahl des sekundären Antikörpers ist abhängig vom primären Antikörper. Wenn der primäre Antikörper von Kaninchen stammt, muss der sekundäre Antikörper Anti-Kaninchen sein, zum Beispiel Esel Anti-Kaninchen oder Ziege Anti-Kaninchen. Die Auswahl des blockierenden Serums hängt vom sekundären Antikörper ab, zum Beispiel wird normales Eselserum verwendet, wenn der sekundäre Antikörper vom Esel stammt. Antigen-Retrieval wird vorgeschlagen, wenn die Immunfärbung immer noch nicht funktioniert, auch wenn alle Richtlinien strikt befolgt wurden.

Das Montieren und Abdecken von Hirnschnitten muss auf sehr vorsichtige Weise erfolgen. Der gesamte Prozess erfordert keine Falten, Falten oder Luftblasen. Es wird mehrere Versuche erfordern, um die optimale Belichtungszeit für die Bildgebung zu bestimmen. Wir empfehlen die gleiche Expositionszeit für denselben Antikörper über verschiedene Abschnitte hinweg, was für den Vergleich der Signalintensitäten zwischen verschiedenen Tieren oder Gruppen unerlässlich ist. Es ist vernünftig, dass die Expositionszeit für verschiedene Antikörper möglicherweise nicht gleich ist, selbst im selben Abschnitt. Beispielsweise kann die Belichtungszeit für DAPI in den meisten Fällen kürzer sein als das c-fos-Signal.

Einige im Protokoll vorgestellte Verfahren sind hilfreich, um sowohl die Zuverlässigkeit als auch die Effizienz während des gesamten Prozesses zu verbessern. 1) Die Verwendung einer automatisierten Perfusionspumpe für die Perfusion kann die Perfusionszeit erheblich verkürzen und die Gewebequalität erheblich verbessern. 2) Diese Kryosektionsstrategie ermöglicht das gleichzeitige Schneiden mehrerer Gehirnproben, was viel effizienter ist als die herkömmliche Praxis. Diese Methode ist auch für neue Forscher leicht zu erlernen und zu beherrschen. 3) Für die frei schwebende Färbung, da Gehirnproben in Suspension gefärbt werden, können Antikörper die Abschnitte von beiden Seiten durchdringen. Wir haben die Inkubationsstrategie optimiert, indem wir alle Abschnitte aus einer Probe / Serie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für primäre und sekundäre Antikörper gegeben haben, wodurch Antikörper eingespart werden, insbesondere wenn wir Gehirnproben in großen Mengen färben müssen. Ein weiterer Vorteil des Free-Floating-Ansatzes besteht darin, dass er modifiziert und neben der Immunfluoreszenzfärbung auch auf andere histochemische Färbemethoden (z. B. chromogene IHC, Hämatoxylin und Eosin, Kresylviolett) angewendet werden kann12.

Eine Einschränkung der frei schwebenden Färbung besteht jedoch darin, dass sehr dünne Abschnitte schwer zu handhaben sein können. Eine On-Slide-Färbemethode kann in Betracht gezogen werden, wenn nur wenige Abschnitte sofort gesammelt und gefärbt werden müssen, wie es in der klinischen Pathologie häufig der Fall ist. Wir haben auch die On-Slide-Färbemethode mit Gehirnschnitten getestet, die aus diesem Protokoll generiert wurden, und es hat gut funktioniert. Um dies zu tun, montieren Sie die Gehirnabschnitte auf Objektträgern, warten Sie, bis die Abschnitte getrocknet sind, und befolgen Sie ein traditionelles Gefrierschnittprotokoll auf dem Objektträger. 4) Die Montage von frei schwebenden Abschnitten auf den Folien kann für bestimmte Forscher, insbesondere für Anfänger, mühsam sein. Wir verwenden einen feinen Pinsel, um Abschnitte an der Luft-Puffer-Schnittstelle sanft auf den Schlitten zu koaxieren, und verwenden dann eine Transferpipette, um den Puffer vorsichtig zu entfernen, um die Luftpufferschnittstelle abzusenken, während die Montage von oben nach unten auf dem Schlitten voranschreitet. Obwohl zeitaufwendig, ist diese Strategie für Anfänger freundlich. Erfahrene Experimentatoren können alle Gehirnabschnitte gleichzeitig auf die Folien in PBS montieren und nur den Puffer entfernen, um die Folie herauszuholen, nachdem der letzte Abschnitt montiert wurde. 5) Schließlich verwenden wir einen Scanner für die Bildgebung, der effizienter ist als die Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere wenn es eine große Anzahl von Objektträgern für die Bildgebung gibt. Der Scanner ermöglicht das Scannen von bis zu 12 Dias in einem Stapel mit einer 20-fachen Vergrößerung. Alternativ kann die Standard-Fluoreszenzmikroskopie unter bestimmten Umständen eingesetzt werden, z. B. wenn ein bestimmter Cluster von Neuronen im Gehirn mit einer höheren Vergrößerung (z. B. 40x oder sogar 60x) dargestellt werden muss 13,14.

Zusammenfassend stellt diese Arbeit eine etablierte Methodik für histologische Studien von Mausgehirnen vor, die sich als reproduzierbar, zuverlässig und effizient erwiesen hat. Das Protokoll wird dazu beitragen, optimale und konsistente histologische Ergebnisse zwischen verschiedenen Forschern und Labors zu generieren und als Referenz für Anfänger zu dienen, um diese Technik zu erlernen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Forscher wurden durch Zuschüsse des NIH unterstützt (K01DK119471 an CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 und R01DK120858 an YX), USDA/CRIS (51000-064-01S an YX) und American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) an LT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

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References

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  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
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  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
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  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

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Neuroscience Ausgabe 176
Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen
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Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

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