Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

חיסון חופשי של מוחות עכבר

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62876
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1,4
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

Abstract

הכתמת אימונוהיסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה שגרתית הנפוצה במדעי המוח כדי לחקור מנגנונים מרכזיים שבבקרה את ויסות חילוף החומרים של האנרגיה ותהליכים נוירוביולוגיים אחרים. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין מעבדות. עבור כל ניסוי מכתים, יש צורך לייעל את ההליכים העיקריים המבוססים על הבדלים בין מינים, רקמות, חלבונים ממוקדים ותנאי העבודה של ריאגנטים. מאמר זה מדגים זרימת עבודה אמינה בפירוט, כולל זלוף תוך-בתחום, חתך מוחי, חיסון צף חופשי, הרכבת רקמות והדמיה, אשר ניתן לעקוב בקלות על ידי חוקרים בתחום זה.

כמו כן נדונים כיצד לשנות נהלים אלה כדי לספק את הצרכים האישיים של החוקרים. כדי להמחיש את האמינות והיעילות של פרוטוקול זה, רשתות פרינורונאליות הוכתמו עם ביוטין תווית ויסטריה florbunda agglutinin (WFA) ו ארגינין וזופרסין (AVP) עם נוגדן אנטי AVP במוח העכבר. לבסוף, הפרטים הקריטיים עבור ההליך כולו טופלו, ואת היתרונות של פרוטוקול זה לעומת אלה של פרוטוקולים אחרים. יחד, מאמר זה מציג פרוטוקול ממוטב לחיסון חופשי של רקמת מוח העכבר. בעקבות פרוטוקול זה מקל על מדענים זוטרים ובכירים כאחד לשפר את האיכות, האמינות והשחזור של מחקרים חיסוניים.

Introduction

השכיחות של השמנת יתר ותחלואה נלווית הגיעה לרמות מגיפה, גרימת נטל חברתי-כלכלי עצום1,2. מודלים עכבר שונים פותחו כדי להבין טוב יותר את התהליכים הביולוגיים האחראים להשמנת יתר3,4. מכיוון שמנגנונים מרכזיים חשובים לוויסות הומאוסטזיס אנרגטי במודלים אלה של בעלי חיים, מחקרים נוירואנטומיים של מוחות עכברים הפכו לטכניקה הכרחית בתחום זה. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של טכניקות היסטולוגיה במוח משתנות במידה ניכרת בין מעבדות ואפילו חוקרים באותה מעבדה מסיבות שונות (למשל, נוגדנים, רקמות, טיפולים, מינים, מטרות מחקר). לכן, יש צורך לקבוע פרוטוקול כללי למחקרים היסתולוגיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. בינתיים, מתחילים יכולים ללמוד במהירות, לשלוט ולהתאים פרוטוקול זה כדי לספק את הצרכים האישיים שלהם.

כתמים אימונוהיסטוכימיים היא שיטה מבוססת כי נעשה שימוש נרחב כדי לדמיין סוגי תאים ספציפיים, mRNAs, וחלבונים במגוון רחב של רקמות (למשל, המוח ורקמות היקפיות)5,6. ליתר דיוק, אנטיגן של עניין יכול להיות מתויג על ידי נוגדן ראשוני מסוים נוגדן משני מתאים מקושר אנזים (למשל, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית) או צבע פלואורסצנטי (פלואורסצין איזוטיוצינט)6. כדוגמה לתועלת של טכניקות אלה, β-אנדורפין [פפטיד אחד מקודד על ידי פרו-אופיומלאנוקורטין (POMC)] ו- c-fos (סמן של פעילות עצבית) הוכתמו בגרעין הארקואט. מחיקה של טריפטופן הידרוקסילאז 2 (אנזים אינטגרלי לסינתזת סרוטונין) בגרעין raphe גבית תורסאלי הוכח להקטין ביטוי c-fos נוירונים POMC בגרעין arcuate7. בנוסף, ההפצה של mRNA קולטן ויטמין D מופה במוח העכבר באמצעות הכלאה במקום (RNAscope)8. מאמר זה מציג שיטה אמינה ויעילה עם זרימת עבודה שלב אחר שלב עבור חיסון צף חופשי, במטרה לשפר את האיכות ואת הרבייה של מחקרים היסטולוגיים של מוח העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

C57BL / 6J עכברים משני המינים (8-16 שבועות של גיל) שימשו במחקר הנוכחי. טיפול בכל בעלי החיים וכל ההליכים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכללת ביילור.

1. זלוף

הערה: שלבים 1.1 - 1.6 מבוצעים במכסה אדים.

  1. הרדמה
    1. יוצקים 5 מ"ל של איזופלוראן (ראה שולחן החומרים) על מגבת נייר המונחת בתחתית חיטוי. הציגו את העכבר על המחסום התבצר בתוך התבשר והמתינו עד לסימני נשימה.
      הערה: ללא נשימה, העכבר עדיין יש פעימות לב לתקופה קצרה של זמן, וזה יהיה perfused לפני היעלמות פעימות הלב.
    2. לפני שתמשיך, אשר שאין רפלקס לצבוט בוהן.
    3. תקן את העכבר ללוח קצף על ידי נהיגה סיכה דרך כל רגל. ודא כי לוח הקצף ממוקם במגש כדי לאסוף נוזל נוזל.
  2. חשיפת הלב
    1. בצע תותח שטחי אורך לאורך קו האמצע מעל בית החזה והבטן, ולאחר מכן להזיז את העור הצידה כדי לחשוף את דופן השריר של בית החזה והבטן. לאחר מכן, לעשות נתק בשכבת השריר כדי לחשוף את הכבד ואת המעי. לבסוף, לחתוך את כלוב הצלעות עם מספריים כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב והריאות. השתמש במלקחיים hemostatic כדי למשוך את בית החזה הצידה כדי להרחיב את אזור העבודה.
  3. איסוף דם סופני (אופציונלי)
    1. הכנס מזרק של 1 מ"ל (ראה טבלת החומרים) בזהירות לתוך האטריום הימני של הלב עד שהקצה מוטבע לחלוטין. החזק את המזרק יציב ולשאוב דם לאט עד הנפח הרצוי הוא הגיע.
      הערה: הדאג לא לחדור מעבר לאטריום הנכון; אוסף של 300-400 μL של דם הוא בר השגה לכל עכבר מבוגר. תוספים כגון מאיץ קריש או נוגד קרישה עשוי לשמש, בהתאם למטרה של איסוף דם.
  4. מיקום צינורית זלוף
    1. למתחילים, לחתוך חור קטן (<1 מ"מ) בחדר השמאלי של הלב עם מספריים ולהכניס צינורית קהה (18 G מחט לעכברים צעירים ו 21 G מחט לעכברים זקנים) דרך החדר השמאלי לתוך aorta עולה. לחלופין, עבור ניסויים מנוסים, לחדור את חדר הלב השמאלי עם צינורית קהה ישירות ולהכניס אותו לתוך ביבי העורקים עולה בזהירות.
    2. מניחים סיכות סביב השילוב של הצינורית וצינורות מצמידים על לוח הקצף כדי למנוע תנועה במהלך זלוף. לחלופין, השתמש במלקחיים hemostatic כדי לתקן את הצינורית במקום. המשך לחתוך את האטריום הנכון כדי לאפשר את זרימת הדם מהמחזור.
      הערה: צינורית זלוף צינורות מצמידים מחוברים משאבת זלוף.
  5. זלוף עם תמיסת מלח
    1. הפעל את מתג לחץ המלח, ולפרוט את העכבר באופן transcardially עם 40-60 מ"ל של מלוחים (0.9% NaCl: 25 °C , pH 7.4). שימו לב לזרימה מהאטריום הימני ולצבע הכבד מקרוב.
      הערה: משאבת זלוף אוטומטית (ראה טבלת החומרים) משמשת לשטיפת הדם תוך 1-2 דקות. כמו טווח הלחץ של המשאבה הוא 1-300 מ"מ כ"ג, ניתן להתאים את המהירות בהתאם. אם תמיסת מלח דולפת מהאף ו/או שהריאה מנופחת, יש להפחית את הלחץ ולהתאים את הצינורית. ברגע שהזרימה כבר לא מכילה דם, המוח מוצף מספיק עם תמיסת מלח. בינתיים, הכבד נטול דם והופך לצבע חום-אפור.
  6. זלוף עם פורמלין
    1. כבה את מתג לחץ המלח והפעל את מתג הלחץ הפורמלין כדי לחדיר את העכבר עם 40 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (10% NBF: 25 °C ,pH 6.8-7.2, ראה טבלת החומרים). התבונן בגפיים של החיה לראיות לרעידות.
      הערה: תנועת זנב ניתן לראות גם לאחר עירוי של 10% NBF. זהירות: מכיוון ש- NBF מסוכן, מוצע כי החוקרים ילבשו ציוד מגן אישי (למשל, מכונת הנשמה מתאימה, מגן פנים) לאורך כל ההליך.
  7. בידוד מוחי9
    1. השתמש במספריים כדי להסיר את הראש. לעשות התנגשות קו אמצעי לאורך ההסתבכות כדי לחשוף את הגולגולת. לקצץ את העור ואת ההתקשרות שריר עם מספריים.
    2. לעשות לחתוך ברכס מסלולית, ולאחר מכן למקם את הקצה החד של מספריים קשתית לתוך מגנום foramen. לקדם את המספריים לאורך פני השטח הפנימיים של הגולגולת, שמירה על לחץ כלפי מעלה כדי למנוע נזק למוח. מוציאים את העצמות הקודקודיות/חזיתיות ומתקנים בזהירות. לבסוף, הסר את המוח מהגולגולת הפתוחה בעדינות.
  8. לאחר קיבוע
    1. מניחים את המוח בצינור 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של 5% NBF ו-15% סוכרוז עבור קיבעון לילה ב-4 °C (7%).
      הערה: כדי להכין 10 מ"ל של 5% NBF ו 15% סוכרוז, לשלב 5 מ"ל של 10% NBF ו 5 מ"ל של 30% סוכרוז (w / v, מומס לתוך תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), ראה את טבלת החומרים). ודא שנפח המאגר הקיבווני גדול לפחות פי 10 מהדגימה עצמה. בתחילה, המוח יצוף במאגר וישקע לתחתית לאחר קיבעון בן לילה.
  9. התייבשות
    1. העבר את דגימת המוח לצינור 15 מ"ל מלא 10 מ"ל של 30% סוכרוז להתייבשות ב 4 °C (70 °F) עד שהוא שוקע.

2. קריוזקציה (קטעים קורונל)

  1. הכנה
    1. מניחים קרח יבש על גבי צלחת התאמת הגובה של מיקרוטומיה מחליקה, וממתינים עד לקבלת כפור לבן. בזהירות להתפשט 5 מ"ל של 30% סוכרוז על גבי הצלחת כדי ליצור שכבה של בסיס מוצק לאחר פתרון סוכרוז קפוא לחלוטין. מקם את כל דגימות המוח (עד 5 דגימות מוח בקבוצה אחת) אופקית בשורה מעל סוכרוז, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של 30% סוכרוז לתחתית כל מוח.
      הערה: המוח ידבק מיד לבסיס סוכרוז הקפוא ויקפא בהדרגה מלמטה למעלה. מניחים סוכרוז נוסף סביב החלק הרכוב של המוח כדי ליצור בסיס חזק יותר לחיתוך.
  2. חתך לקטעים
    1. לאחר 5-10 דקות של הקפאה, כאשר המוח הפך קשה ולבן, לקצץ את המוח עד השכבה הרצויה / אזור הוא הגיע.
      הערה: התאימו את כמות הקרח היבש על הצלחת כדי לשלוט בטמפרטורה. הטמפרטורה נמוכה מדי כאשר גבישי קרח מופיעים על פני השטח של המוח. הטמפרטורה גבוהה מדי כאשר המוח הופך רך והוא כבר לא לבן.
    2. עבור ממצב חיתוך למצב הזנה ולרקמת המוח של המקטע לעובי של 25 מיקרומטר. הכן צלחת 48 באר מלאה PBS 1x, ולסמן חמש בארות למוח עכבר אחד. השתמש במברשת צבע כדי לאסוף כל מקטע מעכבר אחד ולהניח אותו בבאר אחת. לאסוף את החלק הבא של אותו עכבר ולמקם אותו לתוך הבאר השנייה .
    3. חזור על הפעולה 2.2.2 עד לבאר החמישית , הצבת קטעים 6-10 בבאר 1-5 וכן הלאה. חזור על אותו הליך עבור שאר המוחות בו זמנית. חזור על הפעולה עד שכל המקטעים מעכבר אחד נאספים לתוך 5 בארות בסדר אנטומי.
      הערה: בעקבות הליך זה, מקטעי המוח מכל עכבר הם aliquoted לתוך 5 סדרות, אשר ניתן להשתמש עד 5 מחקרים היסתולוגיים שונים.
  3. אחסון
    1. השתמש במכחול כדי להעביר את המקטעים מכל באר למיקרו-Tube בגודל 1.5 מ"ל מלא במאגר קריו-הגנה (20% גליצל, 30% אתילן גליקול ו-50% PBS), ולאחסן את הדגימות ב-20 °C (20 °F).
      הערה: קטעים אלה המאוחסנים בצינורות קטנים (1.5 מ"ל) יכולים לחסוך מקום פיזי במקפיא, ואת שלמות החלקים ניתן לשמר במשך מספר חודשים.

3. כתמי WFA צפים בחינם וחיסון נגד AVP

  1. מניחים מסננת תאים לתוך באר של צלחת תרבית תאים 6-well מלא PBS, ולהשתמש במכחול כדי להעביר סדרה אחת של מקטעי מוח לתוך מסננת התא. לשטוף את החלקים PBS על ידי העברת מסננת התא אחר מלא PBS. יש לשטוף במשך 6 x 10 דקות על שייקר עבור חלקים המאוחסנים במאגר קריו-הגנה ו-3x10 דקות למקטעים חתוכים טריים.
    הערה: כל הליכי הכביסה מבוצעים בצלחת תרבית תאים של 6 טוב עם מסננת תאים בתוך כל באר (ראה את טבלת החומרים). כל מסננת מחזיקה את חלקי המוח של עניין מכל עכבר. כדי להציל ריאגנטים, כל הליכי הדגירה המתוארים להלן מבוצעים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. בין הליכי כביסה ודגרה, השתמש במכחול כדי להעביר את מקטעי המוח בין כל מסננת תאים לכל צינור. לכביסה עם PBS, 12 מ"ל מתאימים לכל באר.
  2. הכן 1 מ"ל של פתרון WFA (1:1,000) עם תווית ביוטין ב- PBT (2.5 מ"ל של טריטון X-100 מומס ב-1,000 מ"ל של PBS) חוצץ בצינור 1.5 מ"ל. מעבירים מקטעי מוח מסננת התא לצינור ודגר בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה ~ 50 סל"ד לילה.
  3. לשטוף את מקטעי המוח עם PBS במשך 3 x 10 דקות כמתואר ב 3.1.
  4. הכן 1 מ"ל של פתרון סטרפטאבידין-Dylight 488 (1:500) ב- PBT בצינור 1.5 מ"ל. העבר מקטעי מוח לתוך הצינור ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד.
    הערה: לכסות את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור מצעד זה קדימה.
  5. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות. לדגור על מקטעי המוח בחסימת חיץ (3% סרום חמור רגיל מדולל PBT) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הבחירה של חסימת סרום נקבעת על ידי המינים שמהם נוצר הנוגדן המשני. למשל, אם הנוגדן המשני הוא מעז, יש להשתמש בסרום עזים רגיל.
  6. לדגור על מקטעי המוח בנוגדן העיקרי (ארנב נגד AVP, 1:500) בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד לילה.
    הערה: הכן נוגדנים ראשוניים ומשניים במאגר חסימה. הריכוז, משך הדגירה וטמפרטורת הדגירה צריכים להיות ממוטבים במחקרי פיילוט.
  7. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות. לדגור את מקטעי המוח בנוגדן משני (קמח אלכסה 594 חמור נגד ארנב IgG (H + L), 1:500) בטמפרטורת החדר עבור 2 שעות על פלטפורמת נדנדה ב ~ 50 סל"ד. יש לשטוף את מקטעי המוח ב-PBS למשך 3 x 10 דקות.

4. הרכבה

  1. מלא שתי מנות פטרי (קוטר של 150 מ"מ) עם 100 מ"ל של 1x PBS כל אחד. מעבירים את כל מקטעי המוח מסננת אחת למנה הראשונה, ומיישרים את מקטעי המוח בסדר נוירואנטומי מ-caudal ל-rostral.
    הערה: כדי להימנע מערבוב קטעים מבעלי חיים שונים, הר סדרה אחת של מקטעי מוח מבעל חיים אחד בכל פעם.
  2. לאחר שכל חלקי המוח מיושרים במנה הראשונה, הטביעו שקופית אחת לתוך המנה השנייה עם קצה אחד מוטה מעט עם מעמד (ראו איור 1 ואיור 2). השתמש במברשת צבע עדינה כדי למקם בעדינות מקטע מוח ממש מתחת לממשק חיץ האוויר על השקופית המוטה. חזור על אותו הליך עם קטע מוח אחר והרכב אותו זה לצד זה עם החלק הראשון.
  3. השתמש pipette העברה לאט ובעדינות להסיר את המאגר כדי להוריד את רמתו עד ששני חלקי המוח הם לגמרי מעל ממשק חיץ האוויר.
    הערה: יש להקפיד למזער את ההפרעה של משטח המאגר, או שמקטעי המוח עלולים לצוף. כאשר יבש, שורה זו של מקטעי המוח תדבוק בשקופית בחוזקה. במידת הצורך, להתאים בעדינות את החלקים בשקופית כדי להבטיח שאין קמטים או קפלים ברקמה כאשר החלקים עדיין רטובים.
  4. חזור על תהליך זה עד להגעה לתחתית השקופית. המשך לחזור על הפעולה עד שכל המקטעים ייטענו על השקופיות.

5. כיסויים

  1. לאחר שכל החלקים התייבשו (1-24 שעות בטמפרטורת החדר), מניחים 80-100 מיקרול של מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPI (ראה טבלת החומרים) בשקופית, והחלו בעדינות כיסוי זכוכית כדי לכסות את הדגימות.
    הערה: יש למרוח את כיסוי הזכוכית בזהירות ובאיטיות כדי למנוע בועות.
  2. מקם את השקופיות בתיבת שקופית מיקרוסקופ (ראה את טבלת החומרים) ולאחסן אותם ב 4 °C (7 °F).
    הערה: תמונה כל הסעיפים בתוך 1-3 ימים כדי למנוע דהייה של פלואורסצנטיות ופיתוח של autofluorescence.

6. הדמיה

  1. הפעלת הסורק והמחשב (ראה טבלת חומרים). מקם את השקופיות במחזיק השקופיות עם התקן הטעינה והכנס את המחזיק לסורק.
    הערה: הסורק מאפשר סריקה של ערוצים מרובים (למשל, 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), ערוצים ירוקים ואדומים) בו-זמנית. הסורק סורק שקופיות רק בהגדלה של פי 20, וניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי (ראה טבלת חומרים) כאשר יש צורך בהגדלה גבוהה יותר (למשל, פי 40).
  2. פתח את התוכנה עבור הסורק (עיין בטבלת החומרים). בחר את מיקום האחסון המתאים ואת פרופיל הסריקה.
  3. התחל את סריקת התצוגה המקדימה על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקה מקדימה . לאחר סריקת התצוגה המקדימה, פתח את אשף זיהוי הרקמות והקף את אזורי העניין להדמיה.
  4. לחץ על לחצן התחל סריקה לאחר בחירת האזורים להדמיה. המתן עד שהמכונה תסיים את הסריקה. בדוק את קובץ התוצאה וייצוא התמונות.
    הערה: אם הפרופיל אינו מתאים לשקופית, התאם על-ידי מיקוד מחדש ושינוי זמן החשיפה או עוצמת האור כדי להתאים את הפרופיל לרקמות. עיין בהוראות עבור הסורק לקבלת פרטים טכניים נוספים (טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מומחש בקצרה באיור 1. הליך ההקפאה של מעבדה זו מוצג באיור 2A, שבו 5 דגימות מוח נותחו בו זמנית. ההרכבה של מקטעי המוח מוצגת באיור 2B, ושקופית המותקנת במלואה עם מקטעי מוח מודגמת באיור 2C. באיור 3, תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של מקטע מוח עכבר עם כתמים משותפים של WFA ו-AVP בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר ב-Bregma -0.82 מ"מ. אותות AVP נצפו בגרעין הפרונטרי ובגרעין העל-טבעי. אותות WFA נצפו באזור הניפורני של ההיפותלמוס החלקירי ובגרעין הרשתית.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית עם מוחות עכבר. לאחר הרדמה מלאה, עכבר הוא perfused עם מלוחים ולאחר מכן 10% NBF. המוח מוסר בזהירות וחתוך לחלקים לאחר קיבעון והתייבשות. החלקים דוגרו עם WFA ואחריו סטרפטווידין-דילייט 488 לאחר שלוש שטיפות עם PBS. מקטעי המוח נחסמו ואז דוגרו בנוגדן אנטי-AVP ראשוני. לאחר מכן, החלקים נשטפו 3 פעמים עם PBS ואחריו דגירה עם הנוגדן המשני, קמח Alexa 594 חמור נגד ארנב IgG (H + L). מקטעי המוח הותקנו על שקופיות וכיסויים שהונחו על השקופיות עם מדיום הרכבה נגד תפירה עם DAPI לפני ההדמיה. קיצורים: NBF = פורמלין חוצץ נייטרלי; WFA = ויסטריה פלורבונדה אגלוטינין; PBS = תמיסת מלח עם אגירה בפוספט; AVP = arginine vasopressin; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות הממחישות פריצה מעשית והרכבה במעבדה. (A) לבנות בסיס על גבי הצלחת עם 30% סוכרוז להחזיק את כל הדגימות אופקית, לחתוך את הרקמות לחלקים (25 מיקרומטר / סעיף) ולאסוף את החלקים לתוך צלחת תרבית תאים 48 היטב מלא מלוחים חוצץ פוספט. (B) שקועים במגלשה בצלחת עם קצה אחד מוטה מעט עם מעמד. מקם כל שורת מקטעים מתחת לממשק מאגר האוויר והורד את המאגר כדי להוציא את המקטעים מהמאגר עד לתחתית השקופית. הקו הלבן מציין את הממשק של חיץ ואוויר. (C) שקופית המותקנת במלואה עם מקטעי מוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה להכתמת אימונופלואורסצנטיות כפולה. (A-D) תמונות מיקרוסקופיות המציגות את התפלגות WFA (אדום, A), AVP (ירוק, B), DAPI (כחול, C) וממוזגות (D) במקטעי מוח עכבר קורונל בברזמה -0.82 מ"מ. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (E-H) תמונות מיקרוסקופיות בהגדלה גבוהה יותר של הקופסאות הלבנות ב- A-D, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: 3V = חדר שלישי; PeFAH = אזור perifornical של ההיפותלמוס החלקירי; PVH = גרעין paraventricular; RT = גרעין רשתית; SON = גרעין על-גופרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת למחקרים נוירואנטומיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך רקמות, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. עם זאת, יש למטב כמה פרטים מרכזיים החיוניים לתוצאות עקביות ואמינות.

איכות הזלוף היא קריטית להכתמת מוצלחות. כתמי תוצאות עשויים להיות מושפעים אם הדם נשאר במוח, בהתחשב בכך שתאי דם (למשל, תאי דם אדומים) יכולים ליצור כתם מלאכותי 'חיובי'10. אנו מסיקים את נוכחותו של כבד חום-אפור כדי להצביע על איכות גבוהה של זלוף, אשר בדרך כלל גורם למוחות ללא דם. משאבת הזלוף האוטומטית המשמשת בפרוטוקול זה מסייעת לחדירה של חיה אחת בהצלחה בתוך פרק זמן קצר. קיבוע לא מספיק ייצור מקטעי מוח רכים ושבירים בהליכים הבאים, בעוד קיבוע יתר יפחית את הרגישות של תגובות אנטיגן בשל קישור צולב פורמלדהיד משופר של חלבונים. תנאים שונים נבדקו, קיבוע בן לילה ב 4 °C (4 °F) היה מספיק עבור לאחר קיבוע של מוחות עכבר. בנוסף 10% NBF בשימוש בפרוטוקול הנוכחי כחוצץ קיבוע, 4% (w / v) של paraformaldehyde מוכן טרי (PFA) ב PBS שימש גם בהרחבה עבור קיבוע רקמות11.

לגבי cryosectioning, עובי החלקים צריך להיות מוכרע בהתאם לצרכים הספציפיים. לדוגמה, מחקרי RNAscope דורשים עובי של 14 מיקרומטר במקום 25 מיקרומטר, נפוץ בכתמים צפים חופשיים. בינתיים, מחקרי RNAscope דורשים כי כל ההליכים מבוצעים בפתרונות ללא RNAase כדי לשמור על שלמות mRNAs היעד. חלק מהחוקרים משתמשים גם בעובי מקטע של 30-40 מיקרומטר למגוון הליכי הכתמה. דגימות מורכבות (קריוזקציה קונבנציונלית) (כלומר טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T) מאפשרת מקטעי מוח דקים בהרבה (למשל, 10 מיקרומטר) שעשויים להיות חיוניים למבנים תאיים או ליישומים אחרים. אסטרטגיית ההקפאה המוצגת כאן אינה.C כוללת בהכרח הטמעה מורכבת של דגימות מוח ומאפשרת 14-40 מקטעים מיקרומטר. ייתכן שאין הבדל משמעותי עבור 3,3-diaminobenzidine (DAB) כתמים באמצעות 25 או 40 מיקרומטר עבה מקטעי מוח. עם זאת, מקטעים דקים יותר מציעים תמונות פלואורסצנטיות באיכות טובה יותר.

היתרון של האסטרטגיה המוצגת כאן הוא כי דגימות מוח מרובות (עד 5 מוחות) ניתן לחתוך בבת אחת. עם זאת, המגבלה של שיטה זו היא כי דגימות המוח צריך להיחתך בתוך שבוע אחד לאחר התייבשות כי טביעה ב 30% סוכרוז במשך זמן רב מדי סביר יותר לגרום השפלת חלבון ובעיות אחרות. כדי למנוע בעיה פוטנציאלית זו, ניתן להעביר מקטעי מוח אלה לתוך מאגר cryoprotectant ולאחסן ב -20 °C (50 °F). עבור כתמים צפים חופשיים, משך הדגירה והריכוז של נוגדנים ראשוניים ומשניים כאחד צריך להיות מותאם במחקרי פיילוט. בדרך כלל, דגירה לילה ב 4 °C (5 °F) או טמפרטורת החדר עם רועד קל מתאים רוב הנוגדנים העיקריים, אם לא הורה אחרת על ידי היצרנים. עבור נוגדנים משניים, דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1-3 שעות עובד טוב ברוב המצבים. עם זאת, יש אופטימיזציה של פרטים אלה לנסיבות שונות. לדוגמה, עבור כתמי c-fos, אנחנו בדרך כלל לדגור על קטעי המוח עם ריכוז של 1:1,000 לילה ב 4 °C (70 °F) עבור כתמים אימונופלואורסצנטיות. עם זאת, באמצעות אותו נוגדן עבור כתמי DAB c-fos, אנו מעדיפים לדגור על מקטעי המוח עם ריכוז של 1:5,000 עבור 48 שעות ב 4 °C (4 °F).

קוקטייל של נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים עשוי לשמש להכתמה כפולה כדי להאיץ את ההליך. ליתר דיוק, שני נוגדנים עיקריים שונים ממינים שונים (למשל, אחד הוא מארנב, השני הוא משפן ניסיונות, עוף או עכבר) מעורבבים לפני הדגירה, כמו גם הנוגדנים המשניים המתאימים. הבחירה בנוגדן משני תלויה בנוגדן העיקרי. אם הנוגדן העיקרי הוא מארנב, הנוגדן המשני חייב להיות אנטי ארנב, למשל, נגד ארנב חמור או נגד ארנב עז. הבחירה של נסיוב חסימה תלוי בנוגדן המשני, למשל, סרום חמור רגיל ישמש אם הנוגדן המשני הוא מחמור. אחזור אנטיגן מוצע אם החיסונים עדיין לא עובד גם אם כל ההנחיות כבר אחריו בקפדנות.

הרכבה וכיסוי של מקטעי מוח חייבים להתבצע בצורה עדינה מאוד. כל התהליך אינו דורש קמטים, קפלים או בועות אוויר. זה ייקח כמה ניסויים כדי לקבוע את זמן החשיפה האופטימלי להדמיה. אנו ממליצים על אותו זמן חשיפה לאותו נוגדן על פני חלקים שונים, החיוניים להשוואת עוצמת האות בין בעלי חיים או קבוצות שונות. סביר שזמן החשיפה לא יהיה זהה לנוגדנים שונים, אפילו באותו סעיף. לדוגמה, זמן החשיפה עבור DAPI עשוי להיות קצר יותר מאשר אות c-fos ברוב המקרים.

כמה הליכים המוצגים בפרוטוקול מועילים לשיפור האמינות והיעילות לאורך כל התהליך. 1) שימוש במשאבת זלוף אוטומטית להזינה יכול לקצר במידה ניכרת את זמן הזלוף ולשפר באופן משמעותי את איכות הרקמות. 2) אסטרטגיית cryosectioning זו מאפשרת חיתוך דגימות מוח מרובות בו זמנית, וזה הרבה יותר יעיל מאשר בפועל קונבנציונלי. שיטה זו היא גם קלה עבור חוקרים חדשים ללמוד ולשלוט. 3) עבור כתמים צפים חופשיים, כמו דגימות המוח מוכתמות השעיה, נוגדנים יכולים לחדור את החלקים משני הצדדים. מיטבנו את אסטרטגיית הדגירה על ידי הצבת כל המקטעים מדגימה/סדרה אחת בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לנוגדנים ראשוניים ומשניים, מה שחוסך נוגדנים, במיוחד כאשר אנו צריכים להכתים דגימות מוח בכמות גדולה. יתרון נוסף של הגישה החופשית הוא שניתן לשנות אותה וליישם אותה על שיטות הכתמה היסטוכימיות אחרות (למשל, IHC כרומוגניים, המטוקסילין ואוסין, סגול קרסיל) בנוסף לכתמי אימונופלואורסצנטיות12.

עם זאת, מגבלה אחת של כתמים צפים חופשיים היא כי חלקים דקים מאוד יכול להיות קשה להתמודד. שיטת כתמים בשקופית עשויה להיחשב אם רק חלקים מעטים צריכים להיות נאספים ומוכתמים באופן מיידי, כפי שקורה לעתים קרובות בפתולוגיה קלינית. בדקנו גם את שיטת הכתמת השקופיות באמצעות מקטעי מוח שנוצרו מהפרוטוקול הזה, וזה עבד טוב. כדי לעשות זאת, טען את מקטעי המוח על שקופיות, המתן עד שהמקטעים יתייבשו ופעל לפי פרוטוקול הכתמת מקטע קפוא מסורתי בשקופית. 4) הרכבה של קטעים צפים חופשיים על השקופיות יכולה להיות מייגעת עבור חוקרים מסוימים, במיוחד למתחילים. אנו משתמשים במברשת צבע עדינה כדי לשדל בעדינות מקטעים לשקופית בממשק חיץ האוויר ולאחר מכן משתמשים בפיפטת העברה כדי להסיר בעדינות את המאגר כדי להוריד בעדינות את ממשק חיץ האוויר כהתקדמות הרכבה מלמעלה למטה של השקופית. למרות זמן רב, אסטרטגיה זו היא ידידותית למתחילים. ניסויים מנוסים יכולים לטעון את כל מקטעי המוח על השקופיות ב- PBS בבת אחת ולהסיר את המאגר רק כדי להוציא את השקופית לאחר טעינת המקטע האחרון. 5) לבסוף, אנו משתמשים בסורק להדמיה, שהיא יעילה יותר ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית, במיוחד כאשר יש מספר רב של שקופיות להדמיה. הסורק מאפשר סריקה של עד 12 שקופיות באצווה אחת עם הגדלה של פי 20. לחלופין, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית יכולה להיות מועסקת בנסיבות מסוימות, למשל, כאשר אשכול מסוים של נוירונים במוח חייב להיות לראווה עם הגדלה גבוהה יותר (למשל, 40x או אפילו 60x)13,14.

לסיכום, מאמר זה מציג מתודולוגיה מבוססת למחקרים היסתולוגיים של מוחות עכברים שהוכחו כניתנים לשחזור, אמינים ויעילים. הפרוטוקול יסייע לייצר תוצאות היסתולוגיות אופטימליות ועקביות בקרב חוקרים ומעבדות שונות וישמש התייחסות למתחילים ללמוד טכניקה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

החוקרים נתמכו על ידי מענקים מה- NIH (K01DK119471 ל- CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, ו- R01DK120858 ל- YX), USDA / CRIS (51000-064-01S ל- YX) ומלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (#829565) ל- LT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Tags

מדעי המוח גיליון 176
חיסון חופשי של מוחות עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M.,… More

Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter