Summary
Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.
Abstract
La colorazione immunoistochimica del cervello dei topi è una tecnica di routine comunemente usata nelle neuroscienze per studiare i meccanismi centrali alla base della regolazione del metabolismo energetico e di altri processi neurobiologici. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'istologia cerebrale possono variare tra i laboratori. Per ogni esperimento di colorazione, è necessario ottimizzare le procedure chiave in base alle differenze di specie, tessuti, proteine mirate e condizioni di lavoro dei reagenti. Questo documento dimostra un flusso di lavoro affidabile in dettaglio, tra cui perfusione intra-aortica, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging, che può essere seguito facilmente dai ricercatori in questo campo.
Sono inoltre discussi come modificare queste procedure per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Per illustrare l'affidabilità e l'efficienza di questo protocollo, le reti perineuronali sono state colorate con Listeria florbunda agglutinina (WFA) marcata con biotina e arginina vasopressina (AVP) con un anticorpo anti-AVP nel cervello del topo. Infine, sono stati affrontati i dettagli critici per l'intera procedura e i vantaggi di questo protocollo rispetto a quelli di altri protocolli. Nel complesso, questo documento presenta un protocollo ottimizzato per l'immunocolorazione fluttuante del tessuto cerebrale del topo. Seguire questo protocollo rende questo processo più facile sia per gli scienziati junior che senior per migliorare la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità degli studi di immunocolorazione.
Introduction
La prevalenza dell'obesità e delle comorbidità associate ha raggiunto livelli epidemici, causando un enorme onere socioeconomico1,2. Sono stati sviluppati vari modelli murini per comprendere meglio i processi biologici responsabili dell'obesità3,4. Poiché i meccanismi centrali sono importanti per la regolazione dell'omeostasi energetica in questi modelli animali, gli studi neuroanatomici sul cervello dei topi sono diventati una tecnica necessaria in questo campo. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità delle tecniche di istologia cerebrale variano considerevolmente tra i laboratori e persino i ricercatori all'interno dello stesso laboratorio per vari motivi (ad esempio, anticorpi, tessuti, trattamenti, specie, obiettivi di ricerca). Pertanto, è necessario stabilire un protocollo generale per gli studi istologici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Nel frattempo, i principianti possono imparare, padroneggiare e regolare rapidamente questo protocollo per soddisfare le loro esigenze individuali.
La colorazione immunoistochimica è un metodo consolidato che è stato ampiamente utilizzato per visualizzare specifici tipi di cellule, mRNA e proteine in una varietà di tessuti (ad esempio, cervello e tessuti periferici)5,6. Più specificamente, un antigene di interesse può essere etichettato da uno specifico anticorpo primario e da un corrispondente anticorpo secondario legato a un enzima (ad esempio, immunoistochimica cromogenica) o a un colorante fluorescente (isotiocianato di fluoresceina)6. Come esempio dell'utilità di queste tecniche, β-endorfina [un peptide codificato da pro-opiomelanocortina (POMC)] e c-fos (un marker di attività neuronale) sono stati colorati nel nucleo arcuato. La delezione della triptofano idrossilasi 2 (un enzima parte integrante della sintesi della serotonina) nel nucleo del rafe dorsale ha dimostrato di ridurre l'espressione di c-fos nei neuroni POMC nel nucleo arcuato7. Inoltre, la distribuzione dell'mRNA del recettore della vitamina D è stata mappata nel cervello del topo tramite ibridazione in situ (RNAscope)8. Questo documento presenta un metodo affidabile ed efficiente con un flusso di lavoro passo-passo per l'immunocolorazione fluttuante, con l'obiettivo di migliorare la qualità e la riproducibilità degli studi istologici del cervello del topo.
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Protocol
Topi C57BL/6J di entrambi i sessi (8-16 settimane di età) sono stati utilizzati nel presente studio. La cura di tutti gli animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Baylor College of Medicine.
1. Perfusione
NOTA: i passaggi da 1.1 a 1.6 vengono eseguiti in una cappa aspirante.
- Anestesia
- Versare 5 ml di isoflurano (vedi la Tabella dei materiali) su un tovagliolo di carta posto sul fondo di un essiccatore. Introdurre il mouse sulla barriera forata all'interno dell'essiccatore e attendere che i segni di respirazione siano scomparsi.
NOTA: Senza respirazione, il topo ha ancora battito cardiaco per un breve periodo di tempo e sarà perfuso prima della scomparsa del battito cardiaco. - Prima di procedere, confermare che non vi è alcun riflesso a un pizzico di punta.
- Fissare il mouse a una tavola di schiuma guidando un perno attraverso ogni piede. Assicurarsi che il pannello di schiuma sia posto in un vassoio per raccogliere lo spillover liquido.
- Versare 5 ml di isoflurano (vedi la Tabella dei materiali) su un tovagliolo di carta posto sul fondo di un essiccatore. Introdurre il mouse sulla barriera forata all'interno dell'essiccatore e attendere che i segni di respirazione siano scomparsi.
- Esporre il cuore
- Fare un'incisione superficiale longitudinale lungo la linea mediana sopra il torace e l'addome, quindi spostare la pelle da parte per esporre la parete muscolare del torace e dell'addome. Quindi, fare un'incisione nello strato muscolare per esporre il fegato e l'intestino. Infine, tagliare la gabbia toracica con le forbici per aprire il torace ed esporre il cuore e i polmoni. Utilizzare una pinza emostatica per tirare da parte la cassa toracica per allargare l'area di lavoro.
- Raccolta di sangue terminale (facoltativo)
- Inserire una siringa da 1 mL (vedere la Tabella dei materiali) con attenzione nell'atrio destro del cuore fino a quando la punta non è completamente incorporata. Tenere ferma la siringa e prelevare il sangue lentamente fino a raggiungere il volume desiderato.
NOTA: Fare attenzione a non penetrare oltre l'atrio destro; La raccolta di 300-400 μL di sangue è ottenibile per topo adulto. Possono essere utilizzati additivi come un acceleratore di coaguli o un anticoagulante, a seconda dello scopo della raccolta del sangue.
- Inserire una siringa da 1 mL (vedere la Tabella dei materiali) con attenzione nell'atrio destro del cuore fino a quando la punta non è completamente incorporata. Tenere ferma la siringa e prelevare il sangue lentamente fino a raggiungere il volume desiderato.
- Posizionamento della cannula di perfusione
- Per i principianti, tagliare un piccolo foro (<1 mm) nel ventricolo sinistro del cuore con le forbici e inserire una cannula smussata (ago da 18 G per topi giovani e ago da 21 G per topi anziani) attraverso il ventricolo sinistro nell'aorta ascendente. In alternativa, per gli sperimentatori esperti, penetrare direttamente nel ventricolo cardiaco sinistro con una cannula smussata e inserirla con attenzione nell'aorta ascendente.
- Posizionare i perni attorno alla congiunzione della cannula e del tubo accoppiato sul pannello di schiuma per impedire il movimento durante la perfusione. In alternativa, utilizzare una pinza emostatica per fissare la cannula in posizione. Procedere a tagliare l'atrio destro per consentire il deflusso del sangue dalla circolazione.
NOTA: La cannula di perfusione e il tubo accoppiato sono collegati alla pompa di perfusione.
- Perfusione con soluzione salina
- Accendere il pressostato salino e perfondere il mouse transcardialmente con 40-60 ml di soluzione salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Osservare da vicino il deflusso dall'atrio destro e il colore del fegato.
NOTA: Una pompa di perfusione automatizzata (vedere la tabella dei materiali) viene utilizzata per lavare il sangue entro 1-2 minuti. Poiché l'intervallo di pressione della pompa è 1-300 mmHg, la velocità può essere regolata di conseguenza. Se la soluzione salina fuoriesce dal naso e / o il polmone è gonfiato, diminuire la pressione e regolare la cannula. Una volta che il deflusso non contiene più sangue, il cervello è sufficientemente arrossato con soluzione salina. Nel frattempo, il fegato è privo di sangue e diventa di colore grigio-brunastro.
- Accendere il pressostato salino e perfondere il mouse transcardialmente con 40-60 ml di soluzione salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Osservare da vicino il deflusso dall'atrio destro e il colore del fegato.
- Perfusione con formalina
- Spegnere il pressostato salino e accendere il pressostato a formalina per perfondere il mouse con 40 ml di formalina tamponata neutra al 10% (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, vedere la Tabella dei materiali). Osserva gli arti dell'animale per prove di tremori.
NOTA: il movimento della coda può essere osservato anche dopo l'infusione del 10% di NBF. ATTENZIONE: Poiché l'NBF è pericoloso, si suggerisce ai ricercatori di indossare dispositivi di protezione individuale (ad esempio, respiratore appropriato, visiera) durante tutta la procedura.
- Spegnere il pressostato salino e accendere il pressostato a formalina per perfondere il mouse con 40 ml di formalina tamponata neutra al 10% (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, vedere la Tabella dei materiali). Osserva gli arti dell'animale per prove di tremori.
- Isolamento cerebrale9
- Usa le forbici per rimuovere la testa. Fai un'incisione della linea di mezzo lungo il tegumento per esporre il cranio. Tagliare la pelle e l'attaccamento muscolare con le forbici.
- Fai un taglio sulla cresta orbitale, quindi posiziona l'estremità affilata delle forbici dell'iride nel forame magnum. Far avanzare le forbici lungo la superficie interna del cranio, mantenendo la pressione verso l'alto per evitare danni al cervello. Rimuovere con cura le ossa parietali / frontali e le meningi. Infine, rimuovere delicatamente il cervello dal cranio aperto.
- Post-fissazione
- Posizionare il cervello in un tubo da 15 ml riempito con 10 mL di NBF al 5% e saccarosio al 15% per la fissazione notturna a 4 °C.
NOTA: Per preparare 10 mL di 5% NBF e 15% saccarosio, combinare 5 mL di 10% NBF e 5 mL di 30% saccarosio (p/v, disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), vedere la Tabella dei materiali). Assicurarsi che il volume del buffer fissativo sia almeno 10 volte più grande del campione stesso. Inizialmente, il cervello fluttuerà nel buffer e affonderà sul fondo dopo la fissazione notturna.
- Posizionare il cervello in un tubo da 15 ml riempito con 10 mL di NBF al 5% e saccarosio al 15% per la fissazione notturna a 4 °C.
- Disidratazione
- Trasferire il campione di cervello in un tubo da 15 ml riempito con 10 mL di saccarosio al 30% per la disidratazione a 4 °C fino a quando non affonda.
2. Criosezione (sezioni coronali)
- Preparazione
- Posizionare il ghiaccio secco sopra la piastra di regolazione dell'altezza di un microtomo scorrevole e attendere che il gelo bianco sia visibile. Stendere con cura 5 ml di saccarosio al 30% sulla parte superiore della piastra per formare uno strato di una base solida dopo che la soluzione di saccarosio è completamente congelata. Posizionare tutti i campioni di cervello (fino a 5 campioni di cervello in un lotto) orizzontalmente in una linea sopra il saccarosio, quindi aggiungere 0,5 ml di saccarosio al 30% sul fondo di ciascun cervello.
NOTA: Il cervello si attaccherà immediatamente alla base di saccarosio congelato e gradualmente si congelerà dal basso verso l'alto. Posizionare ulteriore saccarosio attorno alla parte montata del cervello per formare una base più robusta per il taglio.
- Posizionare il ghiaccio secco sopra la piastra di regolazione dell'altezza di un microtomo scorrevole e attendere che il gelo bianco sia visibile. Stendere con cura 5 ml di saccarosio al 30% sulla parte superiore della piastra per formare uno strato di una base solida dopo che la soluzione di saccarosio è completamente congelata. Posizionare tutti i campioni di cervello (fino a 5 campioni di cervello in un lotto) orizzontalmente in una linea sopra il saccarosio, quindi aggiungere 0,5 ml di saccarosio al 30% sul fondo di ciascun cervello.
- Taglio
- Dopo 5-10 minuti di congelamento, quando il cervello è diventato duro e bianco, tagliare il cervello fino a raggiungere lo strato / regione desiderata.
NOTA: Regolare la quantità di ghiaccio secco sulla piastra per controllare la temperatura. La temperatura è troppo bassa quando i cristalli di ghiaccio appaiono sulla superficie del cervello. La temperatura è troppo alta quando il cervello diventa morbido e non è più bianco. - Passare dalla modalità Trim alla modalità Feed e sezionare il tessuto cerebrale a 25 μm di spessore. Preparare una piastra a 48 pozzetti riempita con 1x PBS e contrassegnare cinque pozzetti per un cervello di topo. Usa un pennello per raccogliere ogni sezione da un mouse e posizionarla in un pozzetto. Raccogli la sezione successiva dello stesso mouse e posizionala nel 2 ° pozzo.
- Ripetere 2.2.2 fino a raggiungere il 5 ° pozzo, posizionando le sezioni 6-10 nel 1 ° -5 ° pozzo e così via. Ripeti la stessa procedura per il resto del cervello contemporaneamente. Ripetere fino a quando tutte le sezioni di un topo sono raccolte nei 5 pozzetti in ordine anatomico.
NOTA: Seguendo questa procedura, le sezioni cerebrali di ciascun topo vengono aliquotate in 5 serie, che possono essere utilizzate per un massimo di 5 diversi studi istologici.
- Dopo 5-10 minuti di congelamento, quando il cervello è diventato duro e bianco, tagliare il cervello fino a raggiungere lo strato / regione desiderata.
- Immagazzinamento
- Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni da ciascun pozzetto a un microtubo da 1,5 ml riempito con tampone crioprotettivo (20% glicerolo, 30% glicole etilenico e 50% PBS) e conservare i campioni a -20 °C.
NOTA: queste sezioni conservate in piccoli tubi (1,5 ml) possono risparmiare spazio fisico nel congelatore e l'integrità delle sezioni può essere conservata per diversi mesi.
- Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni da ciascun pozzetto a un microtubo da 1,5 ml riempito con tampone crioprotettivo (20% glicerolo, 30% glicole etilenico e 50% PBS) e conservare i campioni a -20 °C.
3. Colorazione WFA fluttuante e immunocolorazione anti-AVP
- Posizionare un colino cellulare in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti piena di PBS e utilizzare un pennello per trasferire una serie di sezioni cerebrali nel filtro cellulare. Risciacquare le sezioni in PBS trasferendo il filtro cellulare in un altro pozzo pieno di PBS. Risciacquare per 6 x 10 minuti su uno shaker per le sezioni conservate in tampone crioprotettivo e 3 x 10 minuti per le sezioni appena tagliate.
NOTA: Tutte le procedure di lavaggio vengono eseguite in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con un filtro cellulare all'interno di ciascun pozzetto (vedere la Tabella dei materiali). Ogni colino contiene le sezioni cerebrali di interesse di ciascun topo. Per risparmiare i reagenti, tutte le procedure di incubazione descritte di seguito vengono eseguite in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Tra le procedure di lavaggio e incubazione, utilizzare un pennello per trasferire le sezioni cerebrali tra ciascun colino cellulare e ciascun tubo. Per il lavaggio con PBS, 12 ml sono adeguati per ogni pozzetto. - Preparare 1 mL di soluzione WFA (1:1.000) marcata con biotina in tampone PBT (2,5 mL di Triton X-100 disciolto in 1.000 mL di PBS) in tubo da 1,5 mL. Trasferire le sezioni cerebrali dal filtro cellulare al tubo e incubare a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo ~ 50 giri / min durante la notte.
- Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 minuti come descritto in 3.1.
- Preparare 1 mL di soluzione di streptavidina-Dylight 488 (1:500) in PBT in un tubo da 1,5 mL. Trasferire le sezioni cerebrali nel tubo e incubare a temperatura ambiente per 2 ore su una piattaforma a dondolo a ~ 50 giri / min.
NOTA: Coprire la piastra con un foglio per evitare l'esposizione alla luce da questo passo in avanti. - Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 min. Incubare le sezioni cerebrali in tampone bloccante (3% di siero d'asino normale diluito in PBT) per 2 ore a temperatura ambiente.
NOTA: La scelta del siero bloccante è determinata dalla specie da cui viene generato l'anticorpo secondario. ad esempio, se l'anticorpo secondario proviene da capra, deve essere usato il normale siero di capra. - Incubare le sezioni cerebrali in anticorpi primari (coniglio anti-AVP, 1:500) a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a ~ 50 giri / min durante la notte.
NOTA: Preparare sia gli anticorpi primari che quelli secondari nel tampone di blocco. La concentrazione, la durata dell'incubazione e la temperatura di incubazione devono essere ottimizzate negli studi pilota. - Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 min. Incubare le sezioni cerebrali in anticorpi secondari (Alexa Flour 594 asino anti-coniglio IgG (H + L), 1: 500) a temperatura ambiente per 2 ore su una piattaforma a dondolo a ~ 50 giri / min. Risciacquare le sezioni cerebrali con PBS per 3 x 10 min.
4. Montaggio
- Riempire due piastre di Petri (un diametro di 150 mm) con 100 ml di 1x PBS ciascuna. Trasferire tutte le sezioni cerebrali da un colino al primo piatto e allineare le sezioni cerebrali in ordine neuroanatomico da caudale a rostrale.
NOTA: per evitare di mescolare sezioni di animali diversi, montare una serie di sezioni cerebrali da un animale alla volta. - Dopo che tutte le sezioni cerebrali sono allineate nel primo piatto, immergere un vetrino nel secondo piatto con un'estremità leggermente inclinata con un supporto (vedere Figura 1 e Figura 2). Usa un pennello sottile per posizionare delicatamente una sezione del cervello appena sotto l'interfaccia del buffer d'aria sulla diapositiva inclinata. Ripeti la stessa procedura con un'altra sezione cerebrale e montala fianco a fianco con la prima sezione.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lentamente e delicatamente il buffer per abbassarne il livello fino a quando entrambe le sezioni cerebrali sono completamente sopra l'interfaccia air-buffer.
NOTA: Fare attenzione a ridurre al minimo il disturbo della superficie tampone, o le sezioni cerebrali possono galleggiare via. Quando è asciutto, questa fila di sezioni cerebrali aderirà saldamente alla diapositiva. Se necessario, regolare delicatamente le sezioni sul vetrino per assicurarsi che non ci siano rughe o pieghe nel tessuto quando le sezioni sono ancora bagnate. - Ripetere questo processo fino a raggiungere la parte inferiore della diapositiva. Continuare a ripetere fino a quando tutte le sezioni non sono montate sulle diapositive.
5. Coverslipping
- Dopo che tutte le sezioni si sono asciugate (1-24 ore a temperatura ambiente), posizionare 80-100 μL di mezzo di montaggio anti-sbiadimento con DAPI (vedere la tabella dei materiali) sul vetrino e applicare delicatamente una copertura di vetro per coprire i campioni.
NOTA: Applicare la coverlip in vetro con attenzione e lentamente per evitare bolle. - Posizionare i vetrini in una scatola di vetrini per microscopio (vedere la Tabella dei materiali) e conservarli a 4 °C.
NOTA: Immagine di tutte le sezioni entro 1-3 giorni per evitare lo sbiadimento della fluorescenza e lo sviluppo dell'autofluorescenza.
6. Imaging
- Accendere lo scanner e il computer (vedere Tabella dei materiali). Posizionare le diapositive nel supporto della slitta con il dispositivo di caricamento e inserire il supporto nello scanner.
NOTA: lo scanner consente la scansione di più canali (ad esempio, 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), canali verdi e rossi) contemporaneamente. Lo scanner scansiona i vetrini solo con un ingrandimento di 20x e un microscopio fluorescente tradizionale (vedi Tabella dei materiali) può essere utilizzato quando è necessario un ingrandimento più elevato (ad esempio, 40x). - Aprire il software per lo scanner (vedere la Tabella dei materiali). Scegliere la posizione di archiviazione e il profilo di scansione appropriati.
- Avviare la scansione di anteprima facendo clic sul pulsante Avvia scansione anteprima . Dopo la scansione di anteprima, aprire la procedura guidata di rilevamento dei tessuti e cerchiare le regioni di interesse per l'imaging.
- Fare clic sul pulsante Avvia scansione dopo aver scelto le regioni per l'imaging. Attendere che la macchina finisca la scansione. Controlla il file dei risultati ed esporta le immagini.
NOTA: se il profilo non è adatto alla diapositiva, regolare rifocalizzando e modificando il tempo di esposizione o la forza della luce per adattare il profilo ai tessuti. Fare riferimento alle istruzioni per lo scanner per ulteriori dettagli tecnici (Tabella dei materiali).
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Representative Results
Il diagramma di flusso di questo protocollo è brevemente illustrato nella Figura 1. La procedura di criosezione di questo laboratorio è dimostrata nella Figura 2A, in cui sono stati sezionati contemporaneamente 5 campioni di cervello. Il montaggio delle sezioni cerebrali è mostrato nella Figura 2B e una diapositiva completamente montata con sezioni cerebrali è illustrata nella Figura 2C. Nella Figura 3, immagini immunoistochimiche a fluorescenza rappresentative di una sezione cerebrale di topo con co-colorazione di WFA e AVP a ingrandimento inferiore e superiore a Bregma -0,82 mm. Segnali AVP sono stati osservati nel nucleo paraventricolare e nel nucleo sopraottico. Segnali WFA sono stati osservati nell'area perifornica dell'ipotalamo anteriore e del nucleo reticolare.
Figura 1: Diagramma di flusso dell'immunoistochimica a fluorescenza con cervelli di topo. Dopo l'anestesia completa, un topo viene perfuso con soluzione salina e quindi 10% NBF. Il cervello viene accuratamente rimosso e tagliato in sezioni dopo la fissazione e la disidratazione. Le sezioni sono state incubate con WFA seguite da Streptavidin-Dylight 488 dopo tre lavaggi con PBS. Le sezioni cerebrali sono state bloccate e poi incubate con un anticorpo anti-AVP primario. Quindi, le sezioni sono state lavate 3 volte con PBS seguite da incubazione con l'anticorpo secondario, Alexa Flour 594 asino anti-coniglio IgG (H + L). Le sezioni cerebrali sono state montate su vetrini e coverslip posizionati sui vetrini con mezzo di montaggio anti-sfadamento con DAPI prima dell'imaging. Abbreviazioni: NBF = neutral buffered formalin; WFA = Glicine florbunda agglutinina; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; AVP = arginina vasopressina; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Foto che illustrano la criosezione pratica e il montaggio in laboratorio. (A) Costruire una base sopra la piastra con il 30% di saccarosio per contenere tutti i campioni orizzontalmente, tagliare i tessuti in sezioni (25 μm/sezione) e raccogliere le sezioni in una piastra di coltura cellulare a 48 pozzetti riempita con soluzione salina tamponata con fosfato. (B) Immergere un vetrino nel piatto con un'estremità leggermente inclinata con un supporto. Posizionare ogni fila di sezioni sotto l'interfaccia air-buffer e abbassare il buffer per portare le sezioni fuori dal buffer fino alla parte inferiore della diapositiva. La linea bianca indica l'interfaccia del buffer e dell'aria. (C) Una diapositiva completamente montata con sezioni cerebrali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Un esempio di doppia colorazione a immunofluorescenza. (A-D) Immagini microscopiche che mostrano la distribuzione di WFA (rosso, A), AVP (verde, B), DAPI (blu, C) e fuso (D) in sezioni cerebrali di topo coronale a Bregma -0,82 mm. Barre di scala = 200 μm. (E-H) Immagini microscopiche ad ingrandimento più elevato delle scatole bianche in A-D, rispettivamente. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: 3V = terzo ventricolo; PeFAH = area perifornica dell'ipotalamo anteriore; PVH = nucleo paraventricolare; RT = nucleo reticolare; SON = nucleo sopraottico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per studi neuroanatomici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento dei tessuti, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Tuttavia, alcuni dettagli chiave essenziali per risultati coerenti e affidabili devono essere ottimizzati.
La qualità della perfusione è fondamentale per una colorazione di successo. I risultati della colorazione potrebbero essere influenzati se il sangue rimane nel cervello, dato che le cellule del sangue (ad esempio, i globuli rossi) possono generare una colorazione artificiale "positiva"10. Deduciamo la presenza di un fegato grigio-brunastro per indicare un'alta qualità della perfusione, che di solito si traduce in cervelli privi di sangue. La pompa di perfusione automatizzata utilizzata in questo protocollo aiuta a perfondere con successo un animale in un breve periodo. Una fissazione insufficiente genererà sezioni cerebrali morbide e fragili nelle procedure successive, mentre l'eccessiva fissazione ridurrà la sensibilità delle reazioni antigeniche a causa del miglioramento della reticolazione della formaldeide delle proteine. Sono state testate diverse condizioni e la fissazione notturna a 4 ° C è stata sufficiente per la post-fissazione del cervello di topo. Oltre al 10% di NBF utilizzato nel presente protocollo come tampone fissativo, il 4% (p/v) di paraformaldeide (PFA) appena preparata in PBS è stato ampiamente utilizzato anche per la fissazione dei tessuti11.
Per quanto riguarda la criosezione, lo spessore delle sezioni deve essere deciso in base alle esigenze specifiche. Ad esempio, gli studi sull'RNAscopio richiedono uno spessore di 14 μm invece di 25 μm, comunemente usato nella colorazione fluttuante. Nel frattempo, gli studi sull'RNAscopio richiedono che tutte le procedure siano eseguite in soluzioni prive di RNAasi per preservare l'integrità degli mRNA bersaglio. Alcuni ricercatori utilizzano anche uno spessore di sezione di 30-40 μm per una varietà di procedure di colorazione. La criosezione convenzionale (cioè campioni incorporati in composti a temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) consente sezioni cerebrali molto più sottili (ad esempio, 10 μm) che potrebbero essere cruciali per le strutture intracellulari o altre applicazioni. La strategia di criosezione qui presentata non comporta necessariamente l'incorporamento di composti O.C.T. di campioni di cervello e consente sezioni di 14-40 μm. Potrebbe non esserci alcuna differenza significativa per la colorazione da 3,3-diaminobenzidina (DAB) utilizzando sezioni cerebrali spesse 25 o 40 μm. Tuttavia, le sezioni più sottili offrono immagini a fluorescenza di qualità migliore.
Il vantaggio della strategia qui presentata è che più campioni di cervello (fino a 5 cervelli) possono essere tagliati contemporaneamente. Tuttavia, il limite di questo metodo è che i campioni di cervello devono essere tagliati entro 1 settimana dalla disidratazione perché l'immersione nel 30% di saccarosio per troppo tempo ha maggiori probabilità di causare degradazione delle proteine e altri problemi. Per evitare questo potenziale problema, queste sezioni cerebrali possono essere trasferite nel tampone crioprotettivo e conservate a -20 °C. Per la colorazione flottante, la durata dell'incubazione e la concentrazione di anticorpi primari e secondari devono essere ottimizzate negli studi pilota. Generalmente, l'incubazione notturna a 4 °C o a temperatura ambiente con lieve agitazione è appropriata per la maggior parte degli anticorpi primari, se non diversamente istruita dai produttori. Per gli anticorpi secondari, l'incubazione a temperatura ambiente per 1-3 ore funziona bene nella maggior parte delle situazioni. Tuttavia, questi dettagli devono essere ottimizzati per varie circostanze. Ad esempio, per la colorazione c-fos, in genere incubamo le sezioni cerebrali con una concentrazione di 1:1.000 durante la notte a 4 ° C per la colorazione di immunofluorescenza. Tuttavia, utilizzando lo stesso anticorpo per la colorazione DAB c-fos, preferiamo incubare sezioni cerebrali con una concentrazione di 1:5.000 per 48 ore a 4 °C.
Un cocktail di anticorpi primari e anticorpi secondari potrebbe essere utilizzato per la doppia colorazione per accelerare la procedura. Più specificamente, due diversi anticorpi primari di specie diverse (ad esempio, uno proviene dal coniglio, l'altro è da porcellino d'India, pollo o topo) vengono miscelati prima dell'incubazione, così come i corrispondenti anticorpi secondari. La scelta dell'anticorpo secondario dipende dall'anticorpo primario. Se l'anticorpo primario proviene dal coniglio, l'anticorpo secondario deve essere anti-coniglio, ad esempio anti-coniglio d'asino o anti-coniglio di capra. La selezione del siero bloccante dipende dall'anticorpo secondario, ad esempio, verrà utilizzato il normale siero d'asino se l'anticorpo secondario proviene dall'asino. Il recupero dell'antigene è suggerito se l'immunocolorazione non funziona ancora anche se tutte le linee guida sono state seguite rigorosamente.
Il montaggio e il coverslipping delle sezioni cerebrali devono essere eseguiti in modo molto delicato. L'intero processo non richiede rughe, pieghe o bolle d'aria. Ci vorranno diverse prove per determinare il tempo di esposizione ottimale per l'imaging. Raccomandiamo lo stesso tempo di esposizione per lo stesso anticorpo in diverse sezioni, che è essenziale per confrontare le intensità del segnale tra diversi animali o gruppi. È ragionevole che il tempo di esposizione potrebbe non essere lo stesso per anticorpi diversi, anche nella stessa sezione. Ad esempio, il tempo di esposizione per DAPI potrebbe essere più breve del segnale c-fos nella maggior parte dei casi.
Alcune procedure presentate nel protocollo sono utili per migliorare sia l'affidabilità che l'efficienza durante l'intero processo. 1) L'utilizzo di una pompa di perfusione automatizzata per la perfusione può ridurre considerevolmente i tempi di perfusione e migliorare significativamente la qualità dei tessuti. 2) Questa strategia di criosezione consente di affettare più campioni di cervello contemporaneamente, il che è molto più efficiente della pratica convenzionale. Questo metodo è anche facile da imparare e padroneggiare per i nuovi ricercatori. 3) Per la colorazione fluttuante, poiché i campioni di cervello sono macchiati in sospensione, gli anticorpi possono penetrare nelle sezioni da entrambi i lati. Abbiamo ottimizzato la strategia di incubazione posizionando tutte le sezioni di un campione / serie in una provetta microcentrifuga da 1,5 ml per anticorpi primari e secondari, che salva gli anticorpi, in particolare quando abbiamo bisogno di macchiare campioni di cervello alla rinfusa. Un altro vantaggio dell'approccio free-floating è che può essere modificato e applicato ad altri metodi di colorazione istochimica (ad esempio, IHC cromogenico, ematossilina ed eosina, viola cresile) oltre alla colorazione immunofluorescenza12.
Tuttavia, una limitazione della colorazione fluttuante è che sezioni molto sottili possono essere difficili da gestire. Un metodo di colorazione su vetrino potrebbe essere preso in considerazione se solo poche sezioni devono essere raccolte e macchiate immediatamente, come spesso accade nella patologia clinica. Abbiamo anche testato il metodo di colorazione on-slide utilizzando sezioni cerebrali generate da questo protocollo e ha funzionato bene. Per fare ciò, montare le sezioni cerebrali su vetrini, attendere che le sezioni si asciughino e seguire un tradizionale protocollo di colorazione a sezione congelata su diapositiva. 4) Montare sezioni fluttuanti sulle diapositive può essere noioso per alcuni ricercatori, specialmente per i principianti. Usiamo un pennello fine per coassionare delicatamente le sezioni sulla diapositiva all'interfaccia del buffer dell'aria e quindi utilizziamo una pipetta di trasferimento per rimuovere delicatamente il buffer per abbassare l'interfaccia del buffer dell'aria mentre il montaggio avanza dall'alto verso il basso della diapositiva. Sebbene richieda molto tempo, questa strategia è amichevole per i principianti. Gli sperimentatori esperti possono montare tutte le sezioni del cervello sulle diapositive in PBS contemporaneamente e rimuovere il buffer solo per far uscire la diapositiva dopo che l'ultima sezione è stata montata. 5) Infine, utilizziamo uno scanner per l'imaging, che è più efficiente della microscopia a fluorescenza, specialmente quando ci sono un gran numero di diapositive per l'imaging. Lo scanner consente di scansionare fino a 12 diapositive in un lotto con un ingrandimento di 20x. In alternativa, la microscopia a fluorescenza standard può essere impiegata in determinate circostanze, ad esempio quando uno specifico gruppo di neuroni nel cervello deve essere mostrato con un ingrandimento più elevato (ad esempio, 40x o anche 60x)13,14.
In conclusione, questo documento presenta una metodologia consolidata per gli studi istologici sul cervello dei topi che ha dimostrato di essere riproducibile, affidabile ed efficiente. Il protocollo aiuterà a generare risultati istologici ottimali e coerenti tra diversi ricercatori e laboratori e servirà come riferimento per i principianti per imparare questa tecnica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli investigatori sono stati supportati da sovvenzioni del NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 e R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) e American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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