Summary
このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。
Abstract
マウス脳の免疫構造化学的染色は、エネルギー代謝やその他の神経生物学的プロセスの調節の基礎となる中心的なメカニズムを調査するために神経科学で一般的に使用される日常的な技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、実験室によって異なる場合があります。染色実験ごとに、種、組織、標的タンパク質、試薬の作業条件の違いに基づいて重要な手順を最適化する必要があります。本論文では、大動脈灌流、脳切除、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、この分野の研究者が容易に追跡できる信頼性の高いワークフローを詳細に示す。
また、研究者の個々のニーズを満たすためにこれらの手順を変更する方法についても説明します。このプロトコルの信頼性と効率を説明するために、ペリニューロンネットは、マウス脳内の抗AVP抗体を有するビオチン標識藤フラルブダ凝集(WFA)およびアルギニンバソプレシン(AVP)で染色された。最後に、手順全体の重要な詳細が取り上げられており、このプロトコルの利点は他のプロトコルのそれと比較されます。本論文は、マウス脳組織の自由浮遊免疫染色に最適化されたプロトコルを提示する。このプロトコルに従うと、このプロセスは、ジュニアと上級の両方の科学者が免疫染色研究の品質、信頼性、および再現性を向上させることが容易になります。
Introduction
肥満とそれに伴う併存疾患の有病率は流行レベルに達し、社会経済的負担が大きい1,2を引き起こしている。肥満の原因となる生物学的プロセスをより深く理解するために、様々なマウスモデルが開発されました3,4。これらの動物モデルにおけるエネルギー恒常性の調節には中心的なメカニズムが重要であるため、マウス脳の神経解剖学的研究はこの分野で必要な技術となっています。しかし、脳組織学の技術の品質、信頼性、再現性は、様々な理由(例えば、抗体、組織、治療、種、研究目的)のために、同じ研究室内の研究室や研究者によってかなり異なります。したがって、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、マウス脳の組織学的研究のための一般的なプロトコルを確立する必要があります。一方、初心者は、迅速に学び、マスターし、個々のニーズを満たすために、このプロトコルを調整することができます。
免疫組織化学的染色は、様々な組織(例えば、脳および末梢組織)における特定の細胞タイプ、mRNA、およびタンパク質を可視化するために広く使用されてきた確立された方法である5,6。より具体的には、目的の抗原は、酵素(例えば、発色性免疫組織化学)または蛍光色素(フルオレセイン等性菌化)6に結合した特異的一次抗体および対応する二次抗体によって標識することができる。これらの技術の有用性の一例として、β-エンドルフィン(プロアピオメラノコルチン(POMC)でコードされる1つのペプチド)およびc-fos(ニューロン活性のマーカー)を円弧核に染色した。トリプトファンヒドロキシラーゼ2(セロトニン合成に不可欠な酵素)の欠失は、アルクアテ核中のPOMCニューロンにおけるc-fos発現を減少させることが示された。また、ビタミンD受容体mRNAの分布を、その領域ハイブリダイゼーション(RNAscope)8でマウス脳内にマッピングした。本論文は、マウス脳の組織学的研究の質と再現性を向上させることを目的として、自由浮遊免疫染色のためのステップバイステップのワークフローを用いて、信頼性の高い効率的な方法を提示する。
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Protocol
両性のC57BL/6Jマウス(8〜16週齢)を本研究で使用した。すべての動物のケアとすべての手順は、ベイラー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 灌流
注:ステップ 1.1-1.6 はヒュームフードで行われます。
- 麻酔
- 5 mL のイオブルラン( 材料表参照)を、デシケータの底に置いたペーパータオルに注ぎます。デシケータの内側に穴があいたバリアにマウスを導入し、呼吸の兆候が消えるまで待ちます。
注: 呼吸なしで、マウスは短時間の心拍を持ち、心拍が消失する前に、それが浸透します。 - 先に進む前に、つま先ピンチに反射がないことを確認してください。
- 各足を通してピンを駆動することにより、泡板にマウスを固定します。泡板が液体の波及を集めるために皿に置かれていることを確認して下ろします。
- 5 mL のイオブルラン( 材料表参照)を、デシケータの底に置いたペーパータオルに注ぎます。デシケータの内側に穴があいたバリアにマウスを導入し、呼吸の兆候が消えるまで待ちます。
- 心をさらけ出す
- 胸郭と腹部の上に正中線に沿って縦方向の表面的な切開を行い、胸部と腹部の筋肉壁を露出させるために皮膚を脇に移動します。次に、筋肉層を切開して肝臓と腸を露出させる。最後に、胸郭を開き、心臓と肺を露出させるためにはさみで肋骨ケージをカットします。止血鉗子を使用して胸部を引き離し、作業領域を広げます。
- 末端血液の収集(オプション)
- 先端が完全に埋め込まれるまで、1 mLのシリンジ( 材料表を参照)を心臓の右心房に慎重に挿入します。シリンジをしっかり保持し、所望のボリュームに達するまでゆっくりと血液を引きます。
注:右のアトリウムを越えて浸透しないように注意してください。300-400 μLの血液の収集は、成虫マウス1頭につき達成可能です。血栓促進剤または抗凝固剤などの添加剤は、採血の目的に応じて使用され得る。
- 先端が完全に埋め込まれるまで、1 mLのシリンジ( 材料表を参照)を心臓の右心房に慎重に挿入します。シリンジをしっかり保持し、所望のボリュームに達するまでゆっくりと血液を引きます。
- 灌流カニューレの配置
- 初心者のために、心臓の左心室に小さな穴(<1mm)をはさみで切り、左心室を通して鈍いカニューレ(若いマウスは18G針、老化したマウスは21G針)を左心室から上昇大根に挿入する。あるいは、経験豊富な実験者のために、鈍いカニューレで左心室を直接浸透させ、慎重に上昇大オルタに挿入する。
- カニューレと結合チューブの接続体の周りにピンを置き、発泡板にチューブを結合して、灌流中の動きを防ぎます。あるいは、止血鉗子を使用してカニューレを所定の位置に固定します。右心房を切って血液の循環からの流出を可能にする。
注:灌流カニューレと結合チューブは、灌流ポンプに接続されています。
- 生理食前の灌流
- 生理液圧スイッチをオンにし、マウスを40~60mLの生理的に透過して透過します(0.9%NaCl:25°C、pH 7.4)。右心房からの流出と肝臓の色を注意深く観察します。
注:自動灌流ポンプ( 材料表を参照)は、1〜2分以内に血液を洗い流すために使用されます。ポンプの圧力範囲は1-300 mmHgであるため、速度はそれに応じて調整することができます。生理が鼻から漏れている場合や肺が膨張している場合は、圧力を下げ、カニューレを調整します。流出が血液を含まなくなったら、脳は生理的に十分に洗い流される。一方、肝臓は血液を欠き、色が茶色がかった灰色になります。
- 生理液圧スイッチをオンにし、マウスを40~60mLの生理的に透過して透過します(0.9%NaCl:25°C、pH 7.4)。右心房からの流出と肝臓の色を注意深く観察します。
- ホルマリンの灌流
- 生理用圧力スイッチをオフにし、ホルマリン圧力スイッチをオンにして、マウスに10%中性緩衝ホルマリン(10%NBF:25°C、pH 6.8-7.2)の40 mLを使用してマウスを浸透させます( 材料表参照)。揺れの証拠のために動物の手足を観察してください。
注:10%NBFの注入後に尾の動きも観察されるかもしれません。注意:NBFは危険であるため、研究者は手順全体を通して個人的な保護具(例えば、適切な呼吸器、顔シールド)を着用することが示唆されています。
- 生理用圧力スイッチをオフにし、ホルマリン圧力スイッチをオンにして、マウスに10%中性緩衝ホルマリン(10%NBF:25°C、pH 6.8-7.2)の40 mLを使用してマウスを浸透させます( 材料表参照)。揺れの証拠のために動物の手足を観察してください。
- 脳分離9
- 頭を取り除くためにはさみを使用してください。頭蓋骨を露出させるために、インテグメントに沿って中間線の切開を行います。はさみで皮膚と筋肉の付着を切り落とします。
- 軌道尾根でカットを行い、虹彩はさみの鋭い端を奥のマグナムに入れ。頭蓋の内面に沿ってはさみを進め、脳の損傷を避けるために上圧を維持する。頭頂部/前頭骨と髄膜を慎重に取り除きます。最後に、開いた頭蓋骨から脳を優しく取り除きます。
- 後固定
- 脳を15mLのチューブに入れ、10mLの5%NBFと15%のスクロースを15%のスクロースで満たし、4°Cで一晩固定します。
注:5%NBFと15%スクロースの10 mLを調製するには、10%NBFの5 mLと30%スクロースの5 mLを組み合わせます(w/v、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、 材料表を参照してください。固定バッファーのボリュームがサンプル自体よりも少なくとも 10 倍大きいことを確認します。最初は、脳はバッファに浮かび、一晩固定した後に底に沈みます。
- 脳を15mLのチューブに入れ、10mLの5%NBFと15%のスクロースを15%のスクロースで満たし、4°Cで一晩固定します。
- 脱水
- 脳サンプルを、沈むまで4°Cで脱水するために、10 mLのスクロースを10 mLで満たしたチューブに移します。
2. クライオセクニング(コロナセクション)
- 準備
- スライド式ミクロトームの高さ調整プレートの上にドライアイスを置き、白霜が見えるまで待ちます。プレートの上に5mLのスクロースを慎重に広げ、スクロース溶液を完全凍結した後に固形塩基の層を形成する。すべての脳サンプル(1つのバッチで最大5つの脳サンプル)をスクロースの上の行に水平に配置し、各脳の底に30%のスクロースの0.5 mLを追加します。
注:脳はすぐに凍結スクロースベースに固執し、徐々に下から上に凍結します。脳の取り付けられた部分の周りに追加のスクロースを配置し、切断のための頑丈なベースを形成します。
- スライド式ミクロトームの高さ調整プレートの上にドライアイスを置き、白霜が見えるまで待ちます。プレートの上に5mLのスクロースを慎重に広げ、スクロース溶液を完全凍結した後に固形塩基の層を形成する。すべての脳サンプル(1つのバッチで最大5つの脳サンプル)をスクロースの上の行に水平に配置し、各脳の底に30%のスクロースの0.5 mLを追加します。
- セクショニング
- 凍結の5〜10分後、脳が硬く白くなったら、所望の層/領域に達するまで脳を整える。
メモ:温度を制御するためにプレート上のドライアイスの量を調整します。氷の結晶が脳の表面に現れると、温度が低すぎます。脳が柔らかくなり、白くなくなったとき、温度が高すぎます。 - トリムモードからフィードモードに切り替え、脳組織を25μmの厚さに切り替えます。1x PBSで満たされた48ウェルプレートを準備し、1つのマウス脳に5つの井戸をマークします。1つのマウスから各セクションを収集し、1つの井戸にそれを配置するために、ペイントブラシを使用しています。同じマウスの後続のセクションを収集し、第二の井戸にそれを配置します。
- 5番目 のウェルに達するまで2.2.2を繰り返し、セクション6-10を第1-5ウェル に配置します。脳の残りの部分に対して同じ手順を同時に繰り返します。1つのマウスからすべてのセクションが解剖学的順序で5つの井戸に集められるまで繰り返します。
注:この手順に従って、各マウスからの脳のセクションは、最大5つの異なる組織学的研究のために使用することができる5シリーズにアリクォートされています。
- 凍結の5〜10分後、脳が硬く白くなったら、所望の層/領域に達するまで脳を整える。
- 貯蔵
- 各ウェルから、クリオプロテクトバッファー(グリセロール20%、エチレングリコール30%、PBS50%)を充填した1.5mLマイクロチューブに切片を移し、サンプルを-20°Cで保存します。
注:小さなチューブ(1.5 mL)に保存されたこれらのセクションは、冷凍庫の物理的なスペースを節約することができ、セクションの整合性は数ヶ月間保持することができます。
- 各ウェルから、クリオプロテクトバッファー(グリセロール20%、エチレングリコール30%、PBS50%)を充填した1.5mLマイクロチューブに切片を移し、サンプルを-20°Cで保存します。
3. フリーフローティングWFA染色および抗AVP免疫染色
- PBSで満たされた6ウェルの細胞培養プレートのウェルに細胞ストレーナーを入れ、ペイントブラシを使用して1つの一連の脳セクションを細胞ストレーナーに移します。細胞ストレーナーをPBSで満たされた別の細胞に移すことによって、PBSのセクションをすすいだ。クライオプロテクタントバッファーに保管されているセクションのシェーカーで6 x 10分、切りたばかりのセクションでは3 x 10分のリンス。
注:すべての洗浄手順は、各ウェル内に細胞ストレーナーを備えた6ウェル細胞培養プレートで行われます( 材料表を参照)。各ストレーナーは、各マウスから関心のある脳のセクションを保持します。試薬を保存するために、以下に説明するすべてのインキュベーション手順は、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで行われます。洗浄とインキュベーションの間に、各細胞ストレーナーと各チューブの間で脳の切片を転移させるために絵筆を使用します。PBSで洗浄する場合、各ウェルに12mLが適しています。 - 1.5 mLチューブでPBT(トリトンX-100の2.5 mL)バッファーに1mLのビオチン標識WFA(1:1,000)溶液を調製します。脳切片を細胞ストレーナーからチューブに移し、一晩でロッキングプラットフォームで室温でインキュベートします。
- 3.1 で説明したように 3 x 10 分間 PBS で脳のセクションをすすい。
- PBTで1mLのストレプトアビジン-ダイライト488(1:500)溶液を1.5mLチューブで調製します。脳切片をチューブに移し、~50rpmで揺れるプラットホームで2時間室温でインキュベートする。
注:このステップからの光の露出を防ぐためにホイルでプレートを覆います。 - 3 x 10分間PBSで脳切片をすすいでください。脳切片をブロッキングバッファー(PBTで希釈した正常ロバ血清3%)で室温で2時間インキュベートする。
注:血清を遮断する選択は、二次抗体が生成される種によって決定されます。例えば、二次抗体がヤギからである場合、通常のヤギ血清を使用する必要があります。 - 一次抗体の脳切片(ウサギの抗AVP、1:500)を、ロッキングプラットフォーム上で一晩〜50rpmで室温でインキュベートする。
注: ブロッキング バッファーで一次抗体と 2 次抗体の両方を準備します。インキュベーションの濃度、持続時間、およびインキュベーションの温度は、パイロット研究で最適化する必要があります。 - 3 x 10分間PBSで脳切片をすすいでください。脳切片を二次抗体(Alexa Flour 594ロバ抗ウサギIgG(H+L)、1:500)のロッキングプラットフォーム上で2時間室温で、~50rpmでインキュベートします。3 x 10分間PBSで脳切片をすすいでください。
4. 取り付け
- 2つのペトリ皿(直径150mm)にそれぞれ100mLの1x PBSを充填します。1つのストレーナーから最初の皿にすべての脳セクションを転送し、尾部から鼻尾部までの神経解剖学的秩序で脳セクションを整列させます。
注:異なる動物からのセクションを混合しないように、一度に1つの動物から脳のセクションの1つのシリーズをマウントします。 - 最初の皿ですべての脳のセクションが整列した後、1つのスライドを2番目の皿に沈め、片方の端をスタンドでわずかに傾けます( 図1 と 図2を参照)。細かいペイントブラシを使用して、傾いたスライドのすぐ下に脳部をエアバッファインターフェースのすぐ下にそっと置きます。別の脳のセクションと同じ手順を繰り返し、最初のセクションと並んでそれをマウント.
- 両方の脳のセクションが完全に空気バッファーインターフェイスの上になるまで、ゆっくりと穏やかにバッファーを除去するために転送ピペットを使用します。
注:バッファー表面の乱れを最小限に抑えるように注意してください、 または脳のセクションが離れて浮かびます.乾いた場合、この行の脳セクションはスライドにしっかりと付着します。必要に応じて、スライド上のセクションをそっと調整して、セクションが濡れているときに組織にしわや折り目がないことを確認します。 - スライドの下部に到達するまで、この手順を繰り返します。すべてのセクションがスライドに取り付けられるまで繰り返し実行します。
5. カバーの切り抜き
- すべてのセクションが乾燥した後(室温で1-24時間)、80-100 μLのアンチフェーディング実装媒体をスライド上にDAPI( 材料表参照)を付けて、ガラスカバースリップをそっと塗布してサンプルを覆います。
注:ガラスカバースリップを慎重かつゆっくりと塗布して、泡を避けてください。 - スライドを顕微鏡スライドボックス( 材料表参照)に入れ、4°Cで保管します。
注:蛍光の退色や自己蛍光の発生を避けるために、1〜3日以内にすべてのセクションを画像化します。
6. イメージング
- スキャナとコンピュータの電源を入れます( 資料表を参照)。スライドをローディングデバイスでスライドホルダーに配置し、ホルダーをスキャナーに挿入します。
注:スキャナーは、複数のチャンネル(例えば、4′、6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)、緑、および赤色のチャンネル)を同時にスキャンできます。走査は20倍の倍率のみでスライドをスキャンし、より高い倍率(例えば40倍)が必要な場合には従来の蛍光顕微鏡( 材料表を参照)を使用できます。 - スキャナーのソフトウェアを開きます( 資料表を参照)。適切な保存場所とスキャン プロファイルを選択します。
- プレビュー スキャンを開始する] ボタンをクリックして 、プレビュー スキャンを開始 します。プレビュー スキャンの後、 組織検出 ウィザードを開き、イメージング用の対象領域を丸で囲みます。
- イメージングのリージョンを選択した後で、[ スキャンの開始 ]ボタンをクリックします。スキャンが完了するまで待ちます。結果ファイルを確認し、イメージをエクスポートします。
注:プロファイルがスライドに適していない場合は、露出時間または光強度を再調整して、プロファイルを組織に合わせて調整します。技術的な詳細については、スキャナの説明書を参照してください(資料表)。
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Representative Results
このプロトコルのフローチャートを 図 1 に簡単に示します。この研究室の凍結切除手順は、5つの脳サンプルを同時に切り離した 図2Aで実証されています。脳部の取り付けは 図2Bに示され、脳部を備えた完全に取り付けられたスライドを 図2Cに示す。 図3において、ブレグマ-0.82mmでのWFAとAVPの共染色を伴うマウス脳部の代表的な蛍光免疫検査画像が、傍室核および超視核においてAVPシグナルを観察した。WFAシグナルは、視床下部前視床下部および網状核の骨膜領域で観察された。
図1 マウス脳を用いた蛍光免疫検査のフローチャート 完全な麻酔に続いて、マウスは生理学と10%NBFと浸透する。脳は慎重に除去され、固定と脱水後のセクションに切断されます。セクションは、PBSで3回のスケートの後に、WFAと続いてストレプトアビジン-ダイライト488とインキュベートされた。脳切片をブロックし、その後、一次抗AVP抗体でインキュベートした。次いで、切片をPBSで3回洗浄し、続いて二次抗体でインキュベートした、アレクサ・フラワー594ロバ抗ウサギIgG(H+L)を用いた。脳のセクションは、イメージングの前にDAPIでアンチフェディングマウントメディアでスライドに置かれたスライドとカバースリップに取り付けられました。略語: NBF = 中性バッファホルマリン;WFA = 藤フラルバンダ凝集剤;PBS = リン酸緩衝生理食塩分;AVP = アルギニンバソプレシン;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実験室での実用的な凍結切除と取り付けを示す写真。 (A)プレートの上に30%のショ糖を積み上げて、すべてのサンプルを水平に保持し、組織を切り分け(25μm/section)に切り、リン酸緩衝生理食塩水で満たされた48ウェル細胞培養プレートにセクションを収集します。(B) 片端をスタンドで少し傾けた皿のスライドを水没させます。各セクションをエアバッファインターフェイスの下に配置し、バッファを下にして、セクションをスライドの底までバッファから取り出します。白い線は、バッファと空気のインターフェースを示します。(C)脳のセクションを備えた完全に取り付けられたスライド。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:二重免疫蛍光染色の例(A-D)、WFA(赤、A)、AVP(緑、B)、DAPI(青、C)、および結合(D)をブレグマ-0.82mmのコロナマウス脳切片で示す顕微鏡画像。スケールバー= 200 μm(E-H) A-Dの白い箱の拡大顕微鏡画像、 それぞれ。スケールバー= 100 μm略語: 3V = 第 3 心室;PeFAH = 前視床下部の心膜領域;PVH = 寄室核;RT = 網状核;SON =上視核。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、灌流、組織切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳の神経解剖学的研究のための確立された方法を提供する。ただし、一貫性のある信頼性の高い結果を得るには、いくつかの重要な詳細を最適化する必要があります。
灌流の質は、染色を成功させるために重要です。血液細胞(例えば、赤血球)が人工的な「陽性」染色10を生成できることを考えると、血液が脳に残っている場合、染色結果が影響を受ける可能性があります。我々は、通常、血液を含まない脳をもたらす灌流の高品質を示すために、褐色がかった灰色の肝臓の存在を推測する。このプロトコルで使用される自動灌流ポンプは、短期間で正常に1匹の動物を浸透させるのに役立ちます。不十分な固定は、その後の手順で柔らかく、脆弱な脳切片を生成します, 過剰固定は、タンパク質の強化されたホルムアルデヒド架橋による抗原反応の感受性を低下させます.異なる条件を試験し、マウス脳の後固定には4°Cでの夜間固定で十分であった。固定性緩衝液として本プロトコルで使用される10%のNBFに加えて、PBS中で調製した新たに調製されたパラホルムアルデヒド(PFA)の4%(w/v)も組織固定化に広く使用されている。
凍結切断については、特定のニーズに応じてセクションの厚さを決定する必要があります。例えば、RNAscopeの研究では、自由浮遊染色で一般的に使用される25 μmではなく14 μmの厚さが必要です。一方、RNAscopeの研究では、標的mRNAの完全性を維持するために、RNAase-freeソリューションですべての手順を実行することが必要です。一部の研究者は、染色手順の様々な30〜40 μmのセクション厚さを使用しています。従来の凍結切断(すなわち、最適な切断温度(O.C.T.)化合物組込みサンプル)は、細胞内構造または他のアプリケーションに不可欠である可能性のあるはるかに薄い(例えば、10 μm)の脳セクションを可能にする。ここで示す凍結切除戦略は、必ずしも脳サンプルのO.C.T.複合埋め込みを伴うものではなく、14〜40 μmのセクションを可能にします。25または40μmの厚い脳切片を用いた3,3-ジアミノベンジジン(DAB)染色に有意差はない。しかし、薄いセクションはより良い品質の蛍光画像を提供する。
ここで提示される戦略の利点は、複数の脳サンプル(最大5脳)を一度にカットできることです。しかし、この方法の制限は、30%スクロースの水中の沈み込みがタンパク質分解やその他の問題を引き起こす可能性が高いため、脱水後1週間以内に脳サンプルを切断する必要があることである。この潜在的な問題を避けるために、これらの脳切片は、凍結保護剤緩衝液に移され、-20°Cで保存することができる。 自由浮遊染色の場合、一次および二次抗体のインキュベーションおよび濃度の持続時間は、パイロット研究で最適化されるべきである。一般的に、4°Cまたは軽度の揺れの室温での夜間インキュベーションは、製造業者によって指示されない限り、ほとんどの一次抗体に適しています。二次抗体の場合、室温での1~3時間のインキュベーションは、ほとんどの状況でうまく機能します。ただし、これらの詳細はさまざまな状況に合わせて最適化する必要があります。例えば、c-fos染色の場合、免疫蛍光染色のために4°Cで一晩1:1000の濃度で脳切片をインキュベートします。しかし、c-fos DAB染色に同じ抗体を使用して、4°Cで48時間1:5,000の濃度の脳切片をインキュベートすることを好む。
一次抗体および二次抗体のカクテルは、手順をスピードアップするために二重染色に使用される可能性があります。より具体的には、異なる種からの2つの異なる一次抗体(例えば、1つはウサギから、もう1つはモルモット、ニワトリ、またはマウスからのもの)が、対応する二次抗体と同様にインキュベーション前に混合される。二次抗体の選択は、一次抗体に依存する。一次抗体がウサギからの場合、二次抗体は抗ウサギ、例えばロバ抗ウサギまたはヤギ抗ウサギである必要があります。ブロッキング血清の選択は二次抗体に依存し、例えば、二次抗体がロバからである場合には正常ロバ血清が使用される。すべてのガイドラインに厳密に従っている場合でも、免疫染色が依然として機能しない場合は、抗原検索が提案されます。
脳のセクションの取り付けとカバーの切り込みは、非常に繊細な方法で行う必要があります。全体のプロセスはしわ、折り目、または気泡を必要としません。イメージングに最適な露光時間を決定するには、いくつかの試行が必要です。異なる動物やグループ間でシグナル強度を比較するために不可欠な、異なるセクション間の同じ抗体に対して同じ暴露時間をお勧めします。同じセクションであっても、異なる抗体の露光時間が同じではない可能性があることは合理的です。たとえば、ほとんどの場合、DAPI の露出時間は c-fos 信号よりも短い場合があります。
プロトコルに示されているいくつかの手順は、プロセス全体の信頼性と効率の両方を向上させるために役立ちます。1)灌流のための自動化された灌流ポンプを使用して、大幅に灌流時間を短縮し、組織の品質を大幅に向上させることができます。2)この凍結切除戦略は、複数の脳サンプルを同時にスライスすることを可能にし、これは従来の練習よりもはるかに効率的である。また、新しい研究者が学び、習得することも容易です。3)自由浮遊染色のために、脳サンプルが懸濁液で染色されるように、抗体は両側から切片に浸透することができる。インキュベーション戦略は、1つのサンプル/シリーズのすべてのセクションを、一次および二次抗体用の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに配置することで最適化され、特に脳サンプルを大量に染色する必要がある場合に抗体を保存します。自由浮遊アプローチのもう一つの利点は、免疫蛍光染色に加えて、他のヒストケミカル染色法(例えば、発色性IHC、ヘマトキシリンおよびエオシン、クレシルバイオレット)に修飾および適用できることである。
しかし、フリーフローティング染色の1つの制限は、非常に薄いセクションを扱うのが難しいということです。臨床病理学によくあるように、少数のセクションを収集し、すぐに染色する必要がある場合は、オンスライド染色法が考慮される可能性があります。また、このプロトコルから生成された脳のセクションを使用してオンスライド染色法をテストし、うまくいきました。これを行うには、スライドに脳のセクションをマウントし、セクションが乾燥するのを待ってから、従来の凍結されたセクションのスライド染色プロトコルに従ってください。4)スライド上にフリーフローティングセクションを取り付けることは、特に初心者のために、特定の研究者のために退屈することができます。私たちは、空気バッファインターフェイスのスライドに静かにセクションを同化するために細かいペイントブラシを使用し、その後、静かにスライドの上から底に取り付けの進めとして空気バッファインターフェイスを下げるためにバッファを削除するために転送ピペットを使用しています。時間はかかりますが、この戦略は初心者に優しいです。経験豊富な実験者は、PBSのスライドに一度にすべての脳セクションをマウントし、最後のセクションが取り付けられた後にスライドを取り出すためにバッファを取り外すことができます。5) 最後に、イメージング用のスライドが多数ある場合は特に蛍光顕微鏡よりも効率的な画像処理用スキャナーを使用します。スキャナーは、20倍の倍率で1つのバッチで最大12枚のスライドをスキャンできます。あるいは、標準的な蛍光顕微鏡は、例えば脳内のニューロンの特定のクラスターがより高い倍率(例えば、40xまたは60x)13,14で示されなければならない場合など、特定の状況で採用することができる。
結論として、この論文は、再現性、信頼性、および効率的であることが証明されたマウス脳の組織学的研究のための確立された方法論を提示する。このプロトコルは、異なる研究者や研究所の間で最適で一貫した組織学的結果を生成するのに役立ち、初心者がこの技術を学ぶための参考として役立ちます。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
調査官はNIH(K01DK119471からCWへの助成金)によって支えられました。P01DK113954、R01DK115761、R01DK117281、R01DK125480、R01DK120858からYX、USDA/CRIS(51000-064-01SからYX)、および米国心臓協会の博士研究員(LTX)829565
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
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