Summary
이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.
Abstract
마우스 뇌의 면역 히스토케미칼 염색은 에너지 대사 및 기타 신경 생물학적 과정의 조절의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 신경 과학에 일반적으로 사용되는 일상적인 기술입니다. 그러나, 품질, 신뢰성, 그리고 뇌 역사학 결과의 재현성 실험실 마다 다를 수 있습니다. 각 염색 실험에 대해, 종, 조직, 표적 단백질 및 시약의 작업 조건의 차이에 따라 주요 절차를 최적화할 필요가 있습니다. 이 논문은 대동맥 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 스테인링, 조직 마운팅 및 이미징을 포함하여 신뢰할 수있는 워크플로우를 자세히 보여줍니다.
또한 연구원의 개별적인 필요를 충족시키기 위하여 이 절차를 수정하는 방법 토론입니다. 이 프로토콜의 신뢰성과 효율성을 설명하기 위해, 페리뉴런 그물은 마우스 두뇌에 있는 항 AVP 항체를 가진 비오틴 표지된 Wisteria florbunda agglutinin (WFA) 및 아르기닌 바소프레신 (AVP)로 염색되었습니다. 마지막으로 전체 절차에 대한 중요한 세부 정보가 해결되었으며 이 프로토콜의 이점은 다른 프로토콜과 비교됩니다. 이 논문은 마우스 뇌 조직의 자유로운 부동 면역 염색을 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에 따라 이 과정을 통해 주니어 및 고위 과학자 모두 면역 염색 연구의 품질, 신뢰성 및 재현성을 쉽게 개선할 수 있습니다.
Introduction
비만과 관련 된 comorbidities의 보급은 엄청난 사회 경제적 부담을 일으키는 원인이 되는 전염병 수준에 도달했습니다1,2. 다양한 마우스 모델은 비만에 대한 책임이 있는 생물학적 과정을 더 잘 이해하기 위해 개발되었다3,4. 중앙 메커니즘은 이러한 동물 모델에서 에너지 항상성의 조절에 중요 하기 때문에, 마우스 두뇌의 신경 해부학 연구이 분야에서 필요한 기술이 되었다. 그러나, 뇌 조직학 기술의 품질, 신뢰성 및 재현성은 여러 가지 이유로 실험실 과 심지어 연구자 들 사이에서 상당히 변화 (예를 들어, 항체, 조직, 치료, 종, 연구 목표). 따라서 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌의 조직학적 연구를 위한 일반적인 프로토콜을 수립할 필요가 있다. 한편, 초보자는 신속하게 학습, 마스터, 자신의 개별 요구를 충족하기 위해이 프로토콜을 조정할 수 있습니다.
면역조직화학염색은 다양한 조직(예를 들어, 뇌 및 말초 조직)5,6에서 특정 세포 유형, mRNA 및 단백질을 시각화하기 위해 광범위하게 사용되어 온 확립된 방법입니다. 보다 구체적으로, 관심있는 항원물질은 효소(예를 들어, 염색체 면역히토케미크) 또는 형광염(형광제 이소토오카네이트)6에 연결된 특정 1차 항체 및 대응하는 이차 항체에 의해 표지될 수 있다. 이러한 기술의 유용성의 예로, β-엔돌핀[프로-오피오멜라노코르틴(POMC)] 및 c-fos(뉴런 활성의 마커)에 의해 인코딩된 펩타이드 1개가 아크추아테 핵에 염색되었다. 등쪽 라페 핵에서 트립토판 하이드록실라제 2(세로토닌 합성에 필수적인 효소)의 결실은 arcuate 핵에서 POMC 뉴런에서 c-fos 발현을 감소시키는 것으로 나타났다7. 또한, 비타민 D 수용체 mRNA의 분포는 시투 혼성화(RNAscope)8을 통해 마우스 뇌에 매핑되었다. 이 논문은 마우스 뇌의 조직학 연구의 품질과 재현성을 향상시키는 것을 목표로 자유로운 부동 면역 스테인링을위한 단계별 워크플로우와 신뢰할 수있는 효율적인 방법을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6J 마우스는 남녀(8-16주)의 쥐가 본 연구에서 사용되었다. 모든 동물과 모든 절차의 치료는 의학의 베일러 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. 관류
참고: 1.1 - 1.6 단계는 연기 후드로 수행됩니다.
- 마취
- 이소플루란 5mL( 재료 표 참조)를 건조기 바닥에 놓인 종이 타월에 붓습니다. 건조기 내부의 구멍이 뚫은 장벽에 마우스를 소개하고 호흡의 징후가 사라질 때까지 기다립니다.
참고 : 호흡없이, 마우스는 여전히 짧은 기간 동안 심장 박동을 가지고 있으며, 심장 박동이 사라지기 전에 퍼프됩니다. - 진행하기 전에 발가락 핀치에 반사가 없는지 확인합니다.
- 각 발을 통해 핀을 운전하여 거품 보드에 마우스를 고정합니다. 거품 보드가 액체 유출을 수집하기 위해 트레이에 배치되었는지 확인합니다.
- 이소플루란 5mL( 재료 표 참조)를 건조기 바닥에 놓인 종이 타월에 붓습니다. 건조기 내부의 구멍이 뚫은 장벽에 마우스를 소개하고 호흡의 징후가 사라질 때까지 기다립니다.
- 심장 노출
- 흉부와 복부를 통해 중간선을 따라 세로 피상절개를 한 다음 흉부와 복부의 근육 벽을 노출하기 위해 피부를 옆으로 움직입니다. 다음으로, 간과 창자를 노출하는 근육 층에 절개를합니다. 마지막으로 흉곽을 열고 심장과 폐를 노출하기 위해 가위로 흉곽을 잘라냅니다. 혈전성 집게를 사용하여 흉곽을 옆으로 당겨 작업 영역을 넓힙니다.
- 말단 혈액 의 수집 (선택 사항)
- 팁이 완전히 내장될 때까지 심장의 오른쪽 아트리움에 1mL 주사기( 재료 표 참조)를 조심스럽게 삽입합니다. 주사기를 안정적으로 잡고 원하는 부피에 도달할 때까지 천천히 혈액을 그립니다.
참고: 올바른 아트리움을 지나관통하지 않도록 주의하십시오. 300-400 μL의 혈액 수집은 성인 마우스 당 달성 할 수 있습니다. 혈전 가속기 또는 항응고제와 같은 첨가제가 혈액 수집의 목적에 따라 사용될 수 있다.
- 팁이 완전히 내장될 때까지 심장의 오른쪽 아트리움에 1mL 주사기( 재료 표 참조)를 조심스럽게 삽입합니다. 주사기를 안정적으로 잡고 원하는 부피에 도달할 때까지 천천히 혈액을 그립니다.
- 관류 캐뉼라의 배치
- 초보자를 위해, 가위로 심혼의 왼쪽 심실에 작은 구멍 (<1 mm)를 잘라 고 무딘 캐뉼라를 삽입 (젊은 마우스에 대 한 18 G 바늘 과 21 숙성 쥐에 대 한 G 바늘) 상승 대 동맥에 왼쪽 심실을 통해. 또는 숙련된 실험자의 경우 무딘 캐뉼러로 왼쪽 심장 심실을 직접 관통하고 오름차순 대동맥에 조심스럽게 삽입하십시오.
- 관류 중 의 움직임을 방지하기 위해 칸누라와 결합 된 튜브의 결합 주위에 핀을 배치합니다. 또는 혈전성 집게를 사용하여 캐뉼라를 제자리에 고정하십시오. 혈액이 순환에서 유출될 수 있도록 올바른 아트리움을 자르기 위해 진행합니다.
참고: 관류 캐뉼라와 결합된 튜브는 관류 펌프에 연결되어 있습니다.
- 식염수가 있는 관류
- 식염수 압력 스위치를 켜고 40-60 mL의 식염수 (0.9 % NaCl : 25 ° C, pH 7.4)로 마우스를 트랜스카디어로 퍼블니다. 오른쪽 아트리움에서 유출과 간 의 색상을 밀접하게 관찰하십시오.
참고: 자동 관류 펌프( 재료 표 참조)는 1-2분 이내에 혈액을 플러시하는 데 사용됩니다. 펌프의 압력 범위는 1-300 mmHg이기 때문에 그에 따라 속도를 조정할 수 있습니다. 식염수가 코에서 누출되고 있고 폐가 팽창되면 압력을 줄이고 캐뉼라를 조정하십시오. 유출이 더 이상 혈액을 포함하지 않는 후, 뇌는 충분히 식염수로 플러시됩니다. 한편, 간은 혈액이 없고 갈색 회색이됩니다.
- 식염수 압력 스위치를 켜고 40-60 mL의 식염수 (0.9 % NaCl : 25 ° C, pH 7.4)로 마우스를 트랜스카디어로 퍼블니다. 오른쪽 아트리움에서 유출과 간 의 색상을 밀접하게 관찰하십시오.
- 포르말린이 있는 관류
- 식염수 압력 스위치를 끄고 포르말린 압력 스위치를 켜서 10% 중성 버퍼포름의 40mL로 마우스를 인퓨즈한다(10% NBF: 25°C, pH 6.8-7.2, 재료의 표 참조). 떨림의 증거를 위해 동물의 팔다리를 관찰하십시오.
참고: 10% NBF를 주입한 후에도 꼬리 움직임이 관찰될 수 있다. 주의: NBF는 위험하기 때문에, 연구원은 절차 내내 개인 보호 장비 (예를 들면, 적당한 호흡보호구, 얼굴 방패)를 착용하는 것이 좋습니다.
- 식염수 압력 스위치를 끄고 포르말린 압력 스위치를 켜서 10% 중성 버퍼포름의 40mL로 마우스를 인퓨즈한다(10% NBF: 25°C, pH 6.8-7.2, 재료의 표 참조). 떨림의 증거를 위해 동물의 팔다리를 관찰하십시오.
- 뇌 절연9
- 가위를 사용하여 머리를 제거합니다. 두개골을 노출하는 정각을 따라 중간 선 절개를합니다. 가위로 피부와 근육 부착물을 잘라내보시면 됩니다.
- 궤도 능선에서 잘라 낸 다음 홍채 가위의 날카로운 끝을 포라멘 매그넘에 놓습니다. 두개골의 내부 표면을 따라 가위를 진행하여 뇌의 손상을 피하기 위해 위쪽으로 압력을 유지합니다. 정수리/정면 뼈와 수막을 조심스럽게 제거합니다. 마지막으로, 열린 두개골에서 뇌를 부드럽게 제거합니다.
- 수정 후
- 뇌를 15mL 튜브에 5% NBF의 10mL, 4°C에서 하룻밤 고정을 위해 15% 자당으로 채우십시오.
참고: 5% NBF와 15% 자당 10mL를 준비하려면 5mL의 10% NBF와 30% 자당 5mL(인산염 완충식식염수(PBS)에 용해됨)을 결합 하십시오. 고정 버퍼의 부피가 샘플 자체보다 10배 이상 큰지 확인합니다. 처음에 뇌는 버퍼에 떠 있고 하룻밤 고정 후 바닥으로 가라 앉습니다.
- 뇌를 15mL 튜브에 5% NBF의 10mL, 4°C에서 하룻밤 고정을 위해 15% 자당으로 채우십시오.
- 탈수
- 뇌 샘플을 4°C에서 탈수에 대한 30% 자당 10mL로 채워진 15mL 튜브로 옮기고 가라앉을 때까지 전달한다.
2. 극저온 절제 (관상 섹션)
- 준비
- 슬라이딩 마이크로톤의 높이 조절 판 위에 드라이 아이스를 놓고 흰 서리가 보일 때까지 기다립니다. 자당 용액이 완전히 동결 된 후 고체 염기층을 형성하기 위해 플레이트 위에 30 % 자당 5 mL을 조심스럽게 확산시면. 모든 뇌 샘플(최대 5개의 뇌 샘플을 한 배치로) 자당 위에 있는 선에 수평으로 놓고 각 뇌의 바닥에 30% 자당0.5mL를 넣습니다.
참고: 뇌는 즉시 얼어 붙은 자당 염기위에 달라붙어 서서히 아래에서 위로 얼어 붙습니다. 절단을 위한 튼튼한 기지를 형성하기 위하여 두뇌의 장착한 부분 의 주위에 추가 자당을 놓습니다.
- 슬라이딩 마이크로톤의 높이 조절 판 위에 드라이 아이스를 놓고 흰 서리가 보일 때까지 기다립니다. 자당 용액이 완전히 동결 된 후 고체 염기층을 형성하기 위해 플레이트 위에 30 % 자당 5 mL을 조심스럽게 확산시면. 모든 뇌 샘플(최대 5개의 뇌 샘플을 한 배치로) 자당 위에 있는 선에 수평으로 놓고 각 뇌의 바닥에 30% 자당0.5mL를 넣습니다.
- 단면화
- 5-10 분 동안 동결 후 뇌가 단단하고 하얗게되면 원하는 층 / 부위에 도달 할 때까지 뇌를 다듬습니다.
참고: 플레이트의 드라이 아이스 양을 조정하여 온도를 조절합니다. 얼음 결정이 뇌 표면에 나타날 때 온도가 너무 낮습니다. 뇌가 부드러워지고 더 이상 흰색이 될 때 온도가 너무 높습니다. - 트림 모드에서 피드 모드로 전환하고 뇌 조직을 25 μm 두께로 전환합니다. 1x PBS로 채워진 48웰 플레이트를 준비하고 마우스 뇌 1개를 위한 5개의 우물을 표시합니다. 페인트 브러시를 사용하여 한 마우스에서 각 섹션을 수집하고 하나의 마우스에 배치합니다. 동일한 마우스의 후속 섹션을 수집하고 2번째 마우스에 잘 배치합니다.
- 5일 우물까지 2.2.2를 반복하여 1-5번 홀에서 6-10구간을 배치합니다. 뇌의 나머지 부분에 대해 동시에 동일한 절차를 반복하십시오. 한 마우스의 모든 섹션이 해부학 적 순서로 5 개의 우물로 수집 될 때까지 반복합니다.
참고 : 이 절차에 따라 각 마우스의 뇌 섹션은 5 시리즈로 알리 인용되어 최대 5 가지 조직학 연구에 사용할 수 있습니다.
- 5-10 분 동안 동결 후 뇌가 단단하고 하얗게되면 원하는 층 / 부위에 도달 할 때까지 뇌를 다듬습니다.
- 보관
- 페인트브러시를 사용하여 각 웰에서 극저온 보호제 버퍼(글리세롤 20%, 에틸렌 글리콜 30%, PBS 50% PBS)로 채워진 1.5mL 마이크로튜브로 섹션을 전송하고 샘플을 -20°C에 저장합니다.
참고: 작은 튜브(1.5mL)에 저장된 이 섹션은 냉동고의 물리적 공간을 절약할 수 있으며 섹션의 무결성을 몇 달 동안 보존할 수 있습니다.
- 페인트브러시를 사용하여 각 웰에서 극저온 보호제 버퍼(글리세롤 20%, 에틸렌 글리콜 30%, PBS 50% PBS)로 채워진 1.5mL 마이크로튜브로 섹션을 전송하고 샘플을 -20°C에 저장합니다.
3. 자유 부동 WFA 염색 및 안티 AVP 면역 스테인닝
- 세포 스트레이너를 PBS로 채워진 6웰 세포 배양 판의 우물에 넣고 페인트 브러시를 사용하여 한 일련의 뇌 섹션을 세포 스트레이너로 옮습니다. 세포 여과기를 PBS로 잘 채워진 다른 부분으로 전송하여 PBS의 섹션을 헹구세요. 냉동 보호 제 버퍼에 저장된 섹션에 대한 셰이커에 6 x 10 분 헹구고 갓 잘라 섹션에 대한 3 x 10 분.
참고: 모든 세척 절차는 각 우물 안에 셀 스트레이너가 있는 6웰 세포 배양 판에서 수행됩니다( 재료표 참조). 각 스트레이너는 각 마우스에서 관심의 뇌 섹션을 보유하고 있습니다. 시약을 저장하기 위해 아래에 설명된 모든 잠복 절차는 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서 수행됩니다. 세척과 잠복 절차 사이에 페인트 브러시를 사용하여 각 세포 스트레이너와 각 튜브 사이의 뇌 섹션을 전달합니다. PBS로 세척할 때, 12mL는 각 웰마다 적합합니다. - 1.5mL 튜브에서 PBT(TRIton X-100의 2.5mL 의 2.5mL) 용액1mL을 PBT(TRIton X-100의 2.5mL)에서 1mL의 비틴 라벨WFA(1:1,000) 용액을 1.5mL 튜브로 준비한다. 세포 스트레이너에서 튜브로 뇌 섹션을 옮기고 밤새 흔들 플랫폼 ~50 rpm의 실온에서 배양하십시오.
- 3.1에 설명된 바와 같이 3 x 10 분 동안 PBS로 뇌 섹션을 헹구는다.
- 1.5mL 튜브에서 PBT에서 스트렙타비딘 다이라이트 488(1:500) 용액 1mL을 준비한다. 뇌 섹션을 튜브로 옮기고 실온에서 ~50 rpm의 흔들 플랫폼에서 2 시간 동안 배양하십시오.
참고: 이 단계에서 빛이 앞으로 노출되지 않도록 호일로 접시를 덮습니다. - 3 x 10 분 동안 PBS로 뇌 섹션을 헹구는다. 실내 온도에서 2 시간 동안 버퍼 (PBT에서 희석 된 3 % 정상 당나귀 혈청)에서 뇌 섹션을 배양하십시오.
참고: 혈청 차단의 선택은 이차 항체가 생성되는 종에 의해 결정됩니다. 예를 들어, 이차 항체가 염소로부터 온 경우, 정상적인 염소 혈청을 사용해야 한다. - 1 차적인 항체에 있는 두뇌 단면도를 배양합니다 (토끼 반대로 AVP, 1:500) 하룻밤 ~50 rpm에 흔들 플랫폼에 실온에서.
참고: 버퍼 차단에 1차 및 이차 항체를 모두 준비합니다. 농도, 인큐베이션 의 지속 시간 및 인큐베이션의 온도는 파일럿 연구에서 최적화될 필요가 있습니다. - 3 x 10 분 동안 PBS로 뇌 섹션을 헹구는다. 이차 항체의 뇌 섹션을 배양 (알렉사 밀가루 594 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L), 1:500) 실온에서 2 시간 동안 흔들 플랫폼에서 ~ 50 rpm. 3 x 10 분 동안 PBS로 뇌 섹션을 헹구는다.
4. 마운팅
- 페트리 요리 2개(직경 150mm)에 각각 100mL의 1x PBS를 채웁니다. 한 여과기에서 첫 번째 접시에 모든 뇌 섹션을 전송하고, 코달에서 장밋빛에 신경 해부학 순서의 뇌 섹션을 정렬합니다.
참고: 다른 동물의 섹션을 혼합하지 않으려면 한 번에 한 동물의 뇌 섹션 한 계열을 장착하십시오. - 모든 뇌 섹션이 첫 번째 접시에 정렬 된 후, 스탠드와 약간 기울어진 한쪽 끝으로 두 번째 접시에 하나의 슬라이드를 침수 ( 그림 1 및 그림 2 참조). 미세한 페인트 브러시를 사용하여 공기 버퍼 인터페이스 바로 아래에 뇌 섹션을 기울인 슬라이드에 부드럽게 배치합니다. 다른 뇌 섹션과 동일한 절차를 반복하고 첫 번째 섹션과 나란히 장착합니다.
- 전송 파이펫을 사용하여 버퍼를 천천히 부드럽게 제거하여 두 뇌 섹션이 공기 버퍼 인터페이스 위에 완전히 올라갈 때까지 레벨을 낮춥니다.
참고: 완충 표면의 교란을 최소화하거나 뇌 섹션이 떠있을 수 있습니다. 건조하면 이 뇌 섹션이 슬라이드를 단단히 부착합니다. 필요한 경우 슬라이드의 섹션을 부드럽게 조정하여 단면도가 여전히 젖어있을 때 조직에 주름이나 주름이 없는지 확인합니다. - 슬라이드의 맨 아래에 도달할 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 모든 섹션이 슬라이드에 장착될 때까지 계속 반복합니다.
5. 커버슬립
- 모든 섹션이 건조(실온에서 1-24h)를 말린 후, 슬라이드에 DAPI( 재료 표 참조)를 사용하여 변색 방지 장착 매체의 80-100 μL을 배치하고, 샘플을 덮기 위해 유리 커버슬립을 부드럽게 적용한다.
참고: 거품을 피하기 위해 유리 커버슬립을 신중하고 천천히 적용합니다. - 슬라이드를 현미경 슬라이드 상자에 놓고( 재료 표 참조) 4°C에 보관합니다.
참고: 형광의 퇴색과 자동 형광의 발달을 피하기 위해 1-3 일 이내에 모든 섹션을 이미지합니다.
6. 이미징
- 스캐너와 컴퓨터를 켭니다( 재료 표 참조). 슬라이드를 로딩 장치와 함께 슬라이드 홀더에 배치하고 스캐너에 홀더를 삽입합니다.
참고: 스캐너를 사용하면 여러 채널(예: 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI), 녹색 및 빨간색 채널)을 동시에 스캔할 수 있습니다. 스캐너는 20배율로슬라이드를 스캔하며, 더 높은 배율(예: 40x)이 필요할 때 기존의 형광 현미경( 재료 표 참조)을 사용할 수 있습니다. - 스캐너용 소프트웨어를 엽니 다(재료 표 참조). 적절한 저장소 위치 및 검색 프로필을 선택합니다.
- 미리 보기 시작 스캔 버튼을 클릭하여 미리 보기 스캔을 시작합니다. 미리 보기 스캔 후 조직 검출 마법사를 열고 이미징에 대한 관심 영역을 동그라미로 이동합니다.
- 이미징을 위한 영역을 선택한 후 시작 스캔 버튼을 클릭합니다. 기계가 스캔을 완료할 때까지 기다립니다. 결과 파일을 확인하고 이미지를 내보냅니다.
참고: 프로파일이 슬라이드에 적합하지 않은 경우 노출 시간 또는 광 강도를 다시 초점 조정하여 프로파일을 조직에 맞게 조정합니다. 자세한 기술적 세부 정보(재료 표)는 스캐너의 지침을 참조하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜의 흐름 차트는 그림 1에 간략하게 설명되어 있습니다. 이 실험실의 극저온 절제 절차는 5개의 두뇌 견본이 동시에 단면된 그림 2A에서 입증됩니다. 뇌 섹션의 장착은 도 2B에 표시되며, 뇌 섹션이 있는 완전히 장착된 슬라이드는 도 2C에 설명되어 있습니다. 도 3에서, 브레그마 -0.82mm에서 WFA 및 AVP의 공동 염색을 통한 마우스 뇌 섹션의 대표적인 형광 면역히스토화학 이미지가 구형 핵 및 슈프라옵틱 핵에서 관찰되었다. WFA 신호는 전방 시상 하부 및 망상 핵의 주변 영역에서 관찰되었다.
그림 1: 마우스 두뇌를 가진 형광 면역 조직 화학의 흐름 차트. 완전한 마취에 따라 마우스는 식염수와 10 % NBF로 침투합니다. 두뇌는 신중하게 제거 하 고 고정 및 탈수 후 섹션으로 잘라. 섹션은 PBS와 세 번의 세 번의 세정 후 스트렙타비딘 - Dylight 488 다음에 WFA와 배양되었다. 뇌 섹션차단 하 고 다음 기본 안티 AVP 항체와 배양. 이어서, 섹션은 PBS로 3회 세척되었고, 이차 항체인 알렉사 밀가루 594 당나귀 안티래빗 IgG(H+L)를 배양하였다. 뇌 섹션은 이미징 전에 DAPI로 파싱 장착 매체로 슬라이드에 배치된 슬라이드 및 커버립에 장착되었습니다. 약어: NBF = 중립 버퍼링 포르말린; WFA = 위스테리아 플로르분다 아글루티닌; PBS = 인산염 완충식식염; AVP = 아르기닌 바소프레신; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험실에서 실용적인 냉동 절제 및 장착을 보여주는 사진. (A) 모든 샘플을 수평으로 고정하고, 조직을 섹션(25 μm/section)으로 자르고, 인산염 완충식식염으로 채워진 48웰 세포 배양 판으로 섹션을 수집하기 위해 30% 자당으로 플레이트 위에 베이스를 구축합니다. (B) 한쪽 끝이 스탠드로 약간 기울어진 접시에 슬라이드를 담급니다. 에어 버퍼 인터페이스 아래에 섹션의 각 행을 배치하고 버퍼를 낮추어 슬라이드의 맨 아래까지 버퍼에서 섹션을 가져옵니다. 흰색 선은 버퍼와 공기의 인터페이스를 나타냅니다. (C) 뇌 섹션이 있는 완전히 장착된 슬라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 이중 면역형광 염색의 예. (A-D) Bregma -0.82 mm에서 관상 마우스 뇌 섹션에서 WFA (빨간색, A), AVP (녹색, B), DAPI (파란색, C) 및 병합 (D)의 분포를 보여주는 현미경 이미지. 스케일 바 = 200 μm. (E-H) A-D의 흰색 상자의 높은 배율 현미경 이미지, 각각. 스케일 바 = 100 μm. 약어: 3V = 제3심실; PeFAH = 전방 시상 하부의 주변 영역; PVH = 심실 핵; RT = 망상 핵; SON = 수프라옵틱 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 관류, 조직 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 장착 및 이미징을 포함한 마우스 뇌의 신경 해부학 적 연구를위한 확립 된 방법을 제공합니다. 그러나 일관되고 신뢰할 수 있는 결과에 필수적인 몇 가지 주요 세부 사항을 최적화해야 합니다.
관류의 품질은 성공적인 염색에 매우 중요합니다. 혈액세포(예: 적혈구)가 인공적인 '양성' 염색10을 생성할 수 있다는 점을 감안할 때 혈액이 뇌에 남아 있다면 염색 결과는 영향을 받을 수 있습니다. 우리는 일반적으로 혈액이없는 뇌의 결과 관류의 높은 품질을 나타내는 갈색 회색 간의 존재를 추론. 이 프로토콜에 사용되는 자동 관류 펌프는 단기간 내에 한 동물을 성공적으로 perfuse하는 데 도움이 됩니다. 고정이 부족하면 후속 절차에서 부드럽고 깨지기 쉬운 뇌 섹션을 생성하며, 고정을 통해 단백질의 향상된 포름알데히드 교차 연결로 인한 항원 반응의 감도를 감소시게 됩니다. 다른 조건이 테스트되었고, 4°C에서 하룻밤 고정은 마우스 뇌의 후고에 충분했다. 고정 완충제로 본 프로토콜에 사용되는 10% NBF 외에도 PBS에서 새로 준비된 파라포름데히드(PFA)의 4%(w/v)도 조직 고정에 광범위하게 사용되고 있다.
극저온 절제와 관련하여 특정 요구에 따라 섹션의 두께를 결정해야합니다. 예를 들어 RNAscope 연구는 25 μm 대신 14 μm의 두께가 필요하며, 일반적으로 자유 부동 염색에 사용됩니다. 한편, RNAscope 연구는 대상 mRNA의 무결성을 유지하기 위해 모든 절차가 RNAase가없는 솔루션에서 수행될 것을 요구합니다. 일부 연구자들은 또한 다양한 염색 절차를 위해 30-40 μm의 단면 두께를 사용합니다. 기존의 극저온 절제(즉, 최적의 절삭 온도(O.C.T.) 화합물 임베디드 샘플)은 세포내 구조 또는 기타 응용 분야에서 중요할 수 있는 훨씬 더 얇은(예: 10 μm) 뇌 섹션을 허용합니다. 여기에 제시된 극저온 절제 전략은 반드시 뇌 샘플의 O.C.T. 복합 포함을 포함하지 않으며 14-40 μm 단면도를 허용합니다. 25 또는 40 μm 두께의 뇌 섹션을 사용하여 염색하는 3,3-diaminobenzidine (DAB)에 대한 유의한 차이가 없을 수 있습니다. 그러나, 얇은 섹션은 더 나은 품질의 형광 이미지를 제공합니다.
여기에 제시 된 전략의 장점은 여러 뇌 샘플 (최대 5 두뇌)이 한 번에 절단 할 수 있다는 것입니다. 그러나, 이 방법의 한계는 두뇌 견본이 너무 오래 30% 자당에 잠수하기 때문에 탈수 후에 1 주 안에 절단될 필요가 있다는 것입니다 단백질 분해 및 그밖 문제점을 일으키는 원인이 되기 위하여 확률이 높습니다. 이러한 잠재적인 문제를 피하기 위해 이러한 뇌 섹션은 냉동 보호 제 버퍼로 옮겨져 -20 °C에 저장될 수 있습니다. 자유 부동 염색의 경우, 1 차 및 이차 항체의 인큐베이션 및 농도의 지속 시간을 파일럿 연구에서 최적화해야합니다. 일반적으로, 4°C 또는 온화한 흔들림을 가진 실온에서 하룻밤 잠복은 대부분의 1 차적인 항체에 적합합니다, 제조 업체에 의해 달리 지시하지 않는 경우에. 이차 항체의 경우, 1-3 h의 실온에서 의 배큐베이션은 대부분의 상황에서 잘 작동합니다. 그러나 이러한 세부 사항은 다양한 상황에 맞게 최적화되어야 합니다. 예를 들어, c-fos 염색의 경우, 우리는 일반적으로 면역 형광 염색을 위해 4 °C에서 하룻밤 사이에 1:1,000의 농도로 뇌 섹션을 배양합니다. 그러나, c-fos DAB 염색을 위해 동일한 항체를 사용하여, 우리는 4°C에서 48h에 대해 1:5,000의 농도로 뇌 단면을 배양하는 것을 선호합니다.
1 차적인 항체 및 이차 항체의 칵테일은 절차를 가속화하기 위하여 이중 염색을 위해 이용될 수 있습니다. 보다 구체적으로, 상이한 종으로부터의 두 가지 상이한 1차 항체(예를 들어, 하나는 토끼로부터, 다른 하나는 기니피그, 닭 또는 마우스로부터) 인큐베이션 전에 혼합되며, 상응하는 이차 항체와 마찬가지로. 이차 항체의 선택은 1 차적인 항체에 달려 있습니다. 1차 항체가 토끼로부터 온 경우, 이차 항체는 항토끼여야 하며, 예를 들어 당나귀 안티래빗 또는 염소 안티래빗이어야 한다. 차단 혈청의 선택은 이차 항체에 따라 달라 지며, 예를 들어, 이차 항체가 당나귀로부터 인 경우 정상적인 당나귀 혈청이 사용될 것이다. 항원 회수는 모든 지침이 엄격하게 준수되더라도 면역 염색이 여전히 작동하지 않는 경우에 건의됩니다.
뇌 섹션의 장착 및 커버링은 매우 섬세한 방식으로 수행해야합니다. 전체 공정에는 주름, 주름 또는 기포가 필요하지 않습니다. 이미징을 위한 최적의 노출 시간을 결정하기 위해 여러 번의 시험이 소요됩니다. 우리는 다른 동물 또는 단 중 신호 강도를 비교하기 위해 필수적이다 다른 섹션에서 동일한 항체에 대한 동일한 노출 시간을 권장합니다. 노출 시간이 동일한 섹션에서도 다른 항체에 대해 동일하지 않을 수도 있다는 것이 합리적입니다. 예를 들어 DAPI의 노출 시간은 대부분의 경우 c-fos 신호보다 짧을 수 있습니다.
프로토콜에 제시된 몇 가지 절차는 전체 프로세스에서 신뢰성과 효율성을 모두 향상시키는 데 도움이 됩니다. 1) 관류용 자동 관류 펌프를 사용하면 관류 시간을 상당히 단축하고 조직의 품질을 크게 향상시킬 수 있습니다. 2) 이 극저온 절제 전략은 여러 뇌 샘플을 동시에 슬라이스 할 수 있게해 주며, 이는 기존의 관행보다 훨씬 효율적입니다. 이 방법은 새로운 연구원이 배우고 마스터하는 것도 쉽습니다. 3) 뇌 샘플이 현탁액에 얼룩되기 때문에 자유 부동 염색의 경우 항체가 양쪽에서 섹션을 관통 할 수 있습니다. 우리는 특히 뇌 샘플을 대량으로 얼룩지게해야 할 때 항체를 저장하는 1 차 및 이차 항체를위한 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 하나의 샘플 / 시리즈의 모든 섹션을 배치하여 인큐베이션 전략을 최적화했습니다. 자유 부동 접근법의 또 다른 이점은 면역 플루오레시스 스테닝12 이외에 다른 히스토케노컬 염색 방법(예를 들어, 염색체 IHC, 헤마톡슬린 및 에신, 크레실 바이올렛)에 변형및 적용할 수 있다는 것이다.
그러나, 자유 부동 염색의 한 가지 제한은 매우 얇은 섹션을 처리하기 어려울 수 있다는 것입니다. 임상 병리학의 경우와 같이 몇 가지 섹션만 즉시 수집하고 염색해야 하는 경우 슬라이드 염색 방법을 고려할 수 있습니다. 우리는 또한이 프로토콜에서 생성 된 뇌 섹션을 사용하여 슬라이드 염색 방법을 테스트, 그것은 잘 작동. 이렇게하려면 뇌 섹션을 슬라이드에 장착하고 섹션이 마르기를 기다린 다음 슬라이드 염색 프로토콜의 기존 냉동 섹션을 따릅니다. 4) 슬라이드에 자유 부동 섹션을 장착하는 것은 특정 연구원, 특히 초보자를위해 지루할 수 있습니다. 우리는 미세 한 페인트 브러시를 사용하여 공기 버퍼 인터페이스의 슬라이드에 섹션을 부드럽게 동축 한 다음 전달 파이펫을 사용하여 버퍼를 부드럽게 제거하여 장착이 슬라이드의 상단에서 바닥으로 진행됨에 따라 공기 버퍼 인터페이스를 낮춥니다. 시간이 많이 걸리지만 이 전략은 초보자에게 친숙합니다. 숙련된 실험자는 한 번에 모든 뇌 섹션을 PBS슬라이드에 장착하고 마지막 섹션이 장착된 후 슬라이드를 꺼내기 위해 버퍼만 제거할 수 있습니다. 5) 마지막으로, 우리는 특히 이미징을위한 많은 수의 슬라이드가있을 때 형광 현미경 검사법보다 더 효율적인 이미징용 스캐너를 사용합니다. 이 스캐너를 사용하면 20배 배율로 한 배치로 최대 12개의 슬라이드를 스캔할 수 있습니다. 대안적으로, 표준 형광 현미경 검사는 특정 상황에서 사용될 수 있습니다, 예를 들어, 뇌의 뉴런의 특정 클러스터가 더 높은 배율로 전시되어야 할 때 (예를 들어, 40x 또는 60x)13,14.
결론적으로, 이 논문은 재현 가능하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 것으로 입증된 마우스 뇌의 조직학 연구를 위한 확립된 방법론을 제시합니다. 이 프로토콜은 다른 연구자와 실험실 사이에서 최적이고 일관된 조직학적 결과를 생성하는 데 도움이되며 초보자가이 기술을 배울 수있는 참조 역할을합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
조사관은 NIH (K01DK119471에서 CW에 대한 보조금)의 보조금으로 지원되었습니다. P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, R01DK125480, R01DK125480 YX), USDA/CRIS (510000-064-01S YX), 미국 하트 펠로우십(51000-064-01S) 및 미국 하트 펠로우십(미국 하트닥터)829565.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H.
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
