Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Frittflytende immunostaining av musehjerner

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/62876
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1,4
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv og reproduserbar tilnærming for musehjerne histologiske studier, inkludert perfusjon, hjerneseksjon, frittflytende immunostaining, vevsmontering og avbildning.

Abstract

Immunhiistokjemisk farging av musehjerner er en rutinemessig teknikk som vanligvis brukes i nevrovitenskap for å undersøke sentrale mekanismer som ligger til grunn for regulering av energimetabolisme og andre nevrobiologiske prosesser. Kvaliteten, påliteligheten og reproduserbarheten av hjerne histologiresultater kan imidlertid variere mellom laboratorier. For hvert fargingsforsøk er det nødvendig å optimalisere nøkkelprosedyrene basert på forskjeller i arter, vev, målrettede proteiner og reagensenes arbeidsforhold. Dette dokumentet demonstrerer en pålitelig arbeidsflyt i detalj, inkludert intraaortisk perfusjon, hjerneseksjon, frittflytende immunostaining, vevsmontering og avbildning, som lett kan følges av forskere på dette feltet.

Også diskutert er hvordan du endrer disse prosedyrene for å tilfredsstille forskernes individuelle behov. For å illustrere påliteligheten og effektiviteten til denne protokollen ble perineuronale garn farget med biotin-merket Wisteria florbunda agglutinin (WFA) og arginin vasopressin (AVP) med et anti-AVP-antistoff i musehjernen. Til slutt er de kritiske detaljene for hele prosedyren adressert, og fordelene med denne protokollen sammenlignet med andre protokoller. Samlet sett presenterer dette papiret en optimalisert protokoll for frittflytende immunstaining av musens hjernevev. Å følge denne protokollen gjør denne prosessen enklere for både junior- og seniorforskere å forbedre kvaliteten, påliteligheten og reproduserbarheten til immundempende studier.

Introduction

Utbredelsen av fedme og tilhørende komorbiditeter har nådd epidemiske nivåer, noe som forårsaker en enorm sosioøkonomisk byrde1,2. Ulike musemodeller er utviklet for å bedre forstå de biologiske prosessene som er ansvarlige for fedme3,4. Fordi sentrale mekanismer er viktige for regulering av energi homeostase i disse dyremodellene, har nevroanatomiske studier av musehjerner blitt en nødvendig teknikk på dette feltet. Kvaliteten, påliteligheten og reproduserbarheten av hjerne histologiteknikker varierer imidlertid betydelig mellom laboratorier og til og med forskere i samme laboratorium av ulike årsaker (f.eks. antistoffer, vev, behandlinger, arter, forskningsmål). Derfor er det nødvendig å etablere en generell protokoll for histologiske studier av musehjernen, inkludert perfusjon, hjerneseksjon, frittflytende immunostaining, vevsmontering og avbildning. I mellomtiden kan nybegynnere raskt lære, mestre og justere denne protokollen for å tilfredsstille deres individuelle behov.

Immunhiistokjemisk farging er en etablert metode som har blitt brukt mye for å visualisere spesifikke celletyper, mRNAer og proteiner i en rekke vev (f.eks. hjerne- og perifert vev)5,6. Mer spesifikt kan et antigen av interesse merkes av et bestemt primært antistoff og et tilsvarende sekundært antistoff knyttet til et enzym (f.eks. kromogene immunhiistokjemi) eller et fluorescerende fargestoff (fluorescein isothiocyanate)6. Som et eksempel på nytten av disse teknikkene ble β-endorfin [ett peptid kodet av pro-opiomelanocortin (POMC)] og c-fos (en markør for nevronal aktivitet) farget i den buede kjernen. Sletting av tryptofan hydroksylase 2 (et enzym integrert i serotoninsyntese) i dorsal raphe kjernen ble vist å redusere c-fos uttrykk i POMC nevroner i arcuate kjernen7. I tillegg ble fordelingen av vitamin D-reseptor mRNA kartlagt i musehjernen via in situ hybridisering (RNAscope)8. Dette dokumentet presenterer en pålitelig og effektiv metode med en trinnvis arbeidsflyt for frittflytende immunostaining, med sikte på å forbedre kvaliteten og reproduserbarheten av histologiske studier av musehjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

C57BL/6J mus av begge kjønn (8-16 ukers alder) ble brukt i denne studien. Pleie av alle dyr og alle prosedyrer ble godkjent av Baylor College of Medicine's Institutional Animal Care and Use Committees.

1. Perfusjon

MERK: Trinn 1.1 - 1.6 utføres i en avtrekkshette.

  1. Anestesi
    1. Hell 5 ml isofluran (se materialbordet) på et papirhåndkle plassert på bunnen av en desiccator. Introduser musen på den holed barrieren inne i desiccator og vent til tegn på åndedrett har forsvunnet.
      MERK: Uten åndedrett har musen fortsatt hjerterytme i en kort periode, og den vil bli perfundert før hjerterytmen forsvinner.
    2. Før du fortsetter, bekreft at det ikke er noen refleks til en tåklemme.
    3. Fest musen til et skumbrett ved å kjøre en pinne gjennom hver fot. Pass på at skumplaten er plassert i et brett for å samle væskesøl.
  2. Utsette hjertet
    1. Lag et langsgående overfladisk snitt langs midtlinjen over thoraxen og magen, og flytt deretter huden til side for å avsløre muskelveggen til thoraxen og magen. Deretter gjør du et snitt i muskellaget for å eksponere leveren og tarmen. Til slutt kutt ribbeburet med saks for å åpne thoraxen og eksponere hjertet og lungene. Bruk hemostatiske tang for å trekke ribbeina til side for å utvide arbeidsområdet.
  3. Innsamling av terminalt blod (valgfritt)
    1. Sett en 1 ml sprøyte (se materialtabellen) forsiktig inn i høyre atrium i hjertet til spissen er helt innebygd. Hold sprøyten stødig og trekk blodet sakte til ønsket volum er nådd.
      MERK: Pass på at du ikke trenger forbi riktig atrium; Samling av 300-400 μL blod er oppnåelig per voksen mus. Tilsetningsstoffer som en blodproppakselerator eller antikoagulant kan brukes, avhengig av formålet med blodoppsamlingen.
  4. Plassering av perfusjonskanylen
    1. For nybegynnere, kutt et lite hull (<1 mm) i venstre ventrikel i hjertet med saks og sett inn en stump kanyle (18 G nål for unge mus og 21 G nål for eldre mus) gjennom venstre ventrikel inn i stigende aorta. Alternativt, for erfarne eksperimenter, trenger du inn i venstre hjerte ventrikel med en stump kanyle direkte og setter den inn i stigende aorta nøye.
    2. Plasser pinner rundt konjunksjonen av kanylen og koblede slanger på skumbrettet for å forhindre bevegelse under perfusjonen. Alternativt kan du bruke hemostatiske tang for å fikse kanylen på plass. Fortsett å kutte riktig atrium for å tillate utstrømning av blod fra sirkulasjon.
      MERK: Perfusjonskanylen og koblede slanger er koblet til perfusjonspumpen.
  5. Perfusjon med saltvann
    1. Slå på saltvannstrykkbryteren, og perfuse musen transcardialt med 40-60 ml saltvann (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Vær oppmerksom på utstrømningen fra høyre atrium og fargen på leveren nøye.
      MERK: En automatisert perfusjonspumpe (se materialtabellen) brukes til å skylle blodet innen 1-2 min. Siden trykkområdet til pumpen er 1-300 mmHg, kan hastigheten justeres tilsvarende. Hvis saltvann lekker fra nesen og/eller lungen blåses opp, reduser trykket og juster kanylen. Når utstrømningen ikke lenger inneholder blod, blir hjernen tilstrekkelig spylt med saltvann. I mellomtiden er leveren blottet for blod og blir brunaktig grå i fargen.
  6. Perfusjon med formalin
    1. Slå av saltvannstrykkbryteren og slå på formalintrykkbryteren for å parfyme musen med 40 ml 10% nøytral bufret formalin (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, se materialtabellen). Observer dyrets lemmer for bevis på skjelvinger.
      MERK: Halebevegelsen kan også observeres etter infusjon av 10 % NBF. FORSIKTIG: Siden NBF er farlig, anbefales det at forskeren bruker personlig verneutstyr (f.eks. passende åndedrettsvern, ansiktsskjerm) gjennom hele prosedyren.
  7. Hjerneisolasjon9
    1. Bruk saks for å fjerne hodet. Lag et midtlinje snitt langs integumentet for å avsløre skallen. Trim av huden og muskelfestet med saks.
    2. Lag et kutt på orbitalryggen, og legg deretter den skarpe enden av iris saks inn i foramen magnum. Før saksen langs den indre overflaten av skallen, opprettholde oppadgående trykk for å unngå skade på hjernen. Fjern parietal / frontal bein og meninges forsiktig. Til slutt fjerner du hjernen forsiktig fra den åpnede skallen.
  8. Etter fiksering
    1. Plasser hjernen i et 15 ml rør fylt med 10 ml 5% NBF og 15% sukrose for overnattingsfiksering ved 4 °C.
      MERK: For å forberede 10 ml 5% NBF og 15% sukrose, kombiner 5 ml 10% NBF og 5 ml 30% sukrose (m/v, oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS), se materialtabellen). Kontroller at volumet på den korrigerende bufferen er minst 10 ganger større enn selve prøven. I utgangspunktet vil hjernen flyte i bufferen og synke til bunnen etter overnattingsfiksering.
  9. Dehydrering
    1. Overfør hjerneprøven til et 15 ml rør fylt med 10 ml 30 % sukrose for dehydrering ved 4 °C til det synker.

2. Kryoosectioning (koronal seksjoner)

  1. Forberedelse
    1. Legg tørris på toppen av høydejusteringsplaten til en glidende mikrotom, og vent til hvit frost er synlig. Spred forsiktig 5 ml 30% sukrose på toppen av platen for å danne et lag med en solid base etter at sukroseoppløsningen er helt frossen. Plasser alle hjerneprøver (opptil 5 hjerneprøver i en batch) horisontalt i en linje på toppen av sukrose, og tilsett deretter 0,5 ml 30% sukrose til bunnen av hver hjerne.
      MERK: Hjernen vil umiddelbart holde seg til den frosne sukrosebasen og gradvis fryse fra bunn til topp. Plasser ytterligere sukrose rundt den monterte delen av hjernen for å danne en kraftigere base for kutting.
  2. Snitting
    1. Etter 5-10 min frysing, når hjernen har blitt hard og hvit, trim hjernen til ønsket lag / region er nådd.
      MERK: Juster mengden tørris på platen for å kontrollere temperaturen. Temperaturen er for lav når iskrystaller vises på overflaten av hjernen. Temperaturen er for høy når hjernen blir myk og ikke lenger er hvit.
    2. Bytt fra trimmodus til matemodus og seksjon hjernevev til 25 μm tykkelse. Forbered en 48-brønns plate fylt med 1x PBS, og merk fem brønner for en musehjerne. Bruk en pensel til å samle hver seksjon fra en mus og plassere den i en brønn. Samle den etterfølgende delen av samme mus og plasser den i den andre brønnen.
    3. Gjenta 2.2.2 til den femte brønnen er nådd, og plasser seksjonene 6-10 i 1.-5. Gjenta den samme prosedyren for resten av hjernen samtidig. Gjenta til alle seksjonene fra en mus samles inn i de 5 brønnene i anatomisk rekkefølge.
      MERK: Etter denne prosedyren blir hjerneseksjonene fra hver mus aliquoted i 5-serien, som kan brukes til opptil 5 forskjellige histologiske studier.
  3. Lagring
    1. Bruk en pensel til å overføre seksjonene fra hver brønn til et 1,5 ml mikrorør fylt med kryotoprotektant buffer (20% glyserol, 30% etylenglykol og 50% PBS), og lagre prøvene ved -20 °C.
      MERK: Disse seksjonene som er lagret i små rør (1,5 ml) kan spare fysisk plass i fryseren, og integriteten til seksjonene kan bevares i flere måneder.

3. Frittflytende WFA-farging og anti-AVP-immunstaining

  1. Plasser en cellesil i en brønn av en 6-brønns cellekulturplate fylt med PBS, og bruk en pensel til å overføre en serie hjerneseksjoner til cellesilen. Skyll seksjonene i PBS ved å overføre cellesilen til en annen brønn fylt med PBS. Skyll i 6 x 10 min på en shaker for seksjoner som er lagret i kryopregetektant buffer og 3 x 10 min for nyskårne seksjoner.
    MERK: Alle vaskeprosedyrene utføres i en 6-brønns cellekulturplate med en cellesil inne i hver brønn (se materialtabellen). Hver sil holder hjernedelene av interesse fra hver mus. For å redde reagenser utføres alle inkubasjonsprosedyrene beskrevet nedenfor i et 1,5 ml mikrosenterrør. Mellom vaske- og inkubasjonsprosedyrer, bruk en pensel for å overføre hjernedelene mellom hver cellesil og hvert rør. For vask med PBS er 12 ml tilstrekkelig for hver brønn.
  2. Forbered 1 ml biotinmerket WFA (1:1000) oppløsning i PBT (2,5 ml Triton X-100 oppløst i 1000 ml PBS) buffer i 1,5 ml rør. Overfør hjerneseksjoner fra cellesilen til røret og inkuber ved romtemperatur på en gyngeplattform ~ 50 rpm over natten.
  3. Skyll hjerneseksjonene med PBS i 3 x 10 min som beskrevet i 3.1.
  4. Forbered 1 ml streptavidin-Dylight 488 (1:500) oppløsning i PBT i et 1,5 ml rør. Overfør hjerneseksjoner inn i røret og inkuber ved romtemperatur i 2 timer på en gyngeplattform ved ~ 50 rpm.
    MERK: Dekk platen med folie for å unngå lyseksponering fra dette trinnet fremover.
  5. Skyll hjerneseksjonene med PBS i 3 x 10 min. Inkuber hjerneseksjonene i blokkeringsbuffer (3% normalt eselserum fortynnet i PBT) i 2 timer ved romtemperatur.
    MERK: Valget av blokkering av serum bestemmes av arten som sekundært antistoff genereres fra. f.eks. hvis det sekundære antistoffet er fra geit, bør normalt geitserum brukes.
  6. Inkuber hjerneseksjonene i primært antistoff (kanin anti-AVP, 1:500) ved romtemperatur på en gyngeplattform ved ~ 50 rpm over natten.
    MERK: Klargjør både primære og sekundære antistoffer i blokkeringsbufferen. Konsentrasjonen, varigheten av inkubasjon og temperaturen på inkubasjon må optimaliseres i pilotstudier.
  7. Skyll hjerneseksjonene med PBS i 3 x 10 min. Inkuber hjerneseksjonene i sekundært antistoff (Alexa Flour 594 esel anti-kanin IgG (H +L), 1:500) ved romtemperatur i 2 timer på en gyngeplattform ved ~ 50 rpm. Skyll hjerneseksjonene med PBS i 3 x 10 min.

4. Montering

  1. Fyll to Petri-retter (en diameter på 150 mm) med 100 ml 1x PBS hver. Overfør alle hjerneseksjonene fra en sil til den første parabolen, og juster hjerneseksjonene i nevroanatomisk rekkefølge fra kaudal til rostral.
    MERK: For å unngå å blande seksjoner fra forskjellige dyr, monter en serie hjerneseksjoner fra ett dyr om gangen.
  2. Etter at alle hjerneseksjonene er justert i den første parabolen, senk en glide inn i den andre parabolen med den ene enden litt vippet med et stativ (se figur 1 og figur 2). Bruk en fin pensel til å plassere en hjerneseksjon forsiktig rett under luftbuffergrensesnittet på den vippede lysbildet. Gjenta den samme prosedyren med en annen hjerneseksjon og monter den side om side med den første delen.
  3. Bruk en overføringspipette til å fjerne bufferen langsomt og forsiktig for å senke nivået til begge hjernedelene er helt over luftbuffergrensesnittet.
    MERK: Pass på at bufferoverflaten forstyrrer, ellers kan hjernedelene flyte bort. Når den er tørr, vil denne raden med hjerneseksjoner holde seg fast til lysbildet. Juster om nødvendig forsiktig seksjonene på lysbildet for å sikre at det ikke er rynker eller folder i vevet når seksjonene fortsatt er våte.
  4. Gjenta denne prosessen til bunnen av lysbildet er nådd. Fortsett å gjenta til alle seksjonene er montert på lysbildene.

5. Dekslerlipping

  1. Etter at alle seksjoner har tørket (1-24 timer ved romtemperatur), plasser 80-100 μL anti-fading monteringsmedium med DAPI (se materialtabellen) på lysbildet, og påfør forsiktig en glassdeksler for å dekke prøvene.
    MERK: Påfør glassdekslene forsiktig og sakte for å unngå bobler.
  2. Plasser lysbildene i en mikroskopsklieboks (se materialtabellen) og oppbevar dem ved 4 °C.
    MERK: Bilde alle seksjoner innen 1-3 dager for å unngå falming av fluorescens og utvikling av autofluorescens.

6. Bildebehandling

  1. Slå på skanneren og datamaskinen (se Tabell over materialer). Plasser lysbildene i skyveholderen med lasteenheten, og sett holderen inn i skanneren.
    MERK: Skanneren gjør det mulig å skanne flere kanaler (f.eks. 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), grønne og røde kanaler) samtidig. Skanneren skanner lysbilder bare med en 20x forstørrelse, og et tradisjonelt fluorescerende mikroskop (se Materialfortegnelse) kan brukes når en høyere forstørrelse (f.eks. 40x) er nødvendig.
  2. Åpne programvaren for skanneren (se materiallisten). Velg riktig lagringssted og skanneprofil.
  3. Start forhåndsvisningsskanningen ved å klikke på Start forhåndsvisningsskanning-knappen . Etter forhåndsvisningsskanningen åpner du veiviseren for vevsgjenkjenning og sirkler rundt områdene av interesse for avbildning.
  4. Klikk på Start skanning-knappen etter å ha valgt områdene for avbildning. Vent til maskinen er ferdig med skanningen. Kontroller resultatfilen, og eksporter bildene.
    MERK: Hvis profilen er uegnet for lysbildet, justerer du ved å fokusere på nytt og endre eksponeringstiden eller lysstyrken for å tilpasse profilen til vevet. Se instruksjonene for skanneren hvis du vil ha mer teknisk informasjon (Materialfortegnelse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flytskjemaet for denne protokollen er kort illustrert i figur 1. Dette laboratoriets kryosectioning prosedyre er demonstrert i figur 2A, der 5 hjerneprøver ble seksjonert samtidig. Montering av hjerneseksjoner er vist i figur 2B, og en fullt montert lysbilde med hjerneseksjoner er illustrert i figur 2C. I figur 3 ble det observert representative fluorescensimmunohistokjemibilder av en musehjernesedel med samtidig farging av WFA og AVP ved lavere og høyere forstørrelse ved Bregma -0,82 mm. AVP-signaler i den paraventricular kjernen og den supraoptiske kjernen. WFA-signaler ble observert i det periforniske området av den fremre hypothalamus og den retikulære kjernen.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema over fluorescensimmunohistokjemi med musehjerner. Etter fullstendig anestesi er en mus perfundert med saltvann og deretter 10% NBF. Hjernen fjernes forsiktig og kuttes i seksjoner etter fiksering og dehydrering. Seksjonene ble inkubert med WFA etterfulgt av Streptavidin-Dylight 488 etter tre vasker med PBS. Hjerneseksjonene ble blokkert og deretter inkubert med et primært anti-AVP-antistoff. Deretter ble seksjonene vasket 3 ganger med PBS etterfulgt av inkubasjon med det sekundære antistoffet, Alexa Flour 594 esel anti-kanin IgG (H + L). Hjerneseksjonene ble montert på lysbilder og deksler plassert på lysbildene med antifading monteringsmedium med DAPI før avbildning. Forkortelser: NBF = nøytral bufret formalin; WFA = Wisteria florbunda agglutinin; PBS = fosfatbufret saltvann; AVP = arginin vasopressin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bilder som illustrerer praktisk kryoseksjon og montering i laboratoriet. (A) Bygg opp en base på toppen av platen med 30% sukrose for å holde alle prøver horisontalt, kutt vevet i seksjoner (25 μm / seksjon) og samle seksjonene i en 48-brønns cellekulturplate fylt med fosfatbufret saltvann. (B) Senk en sklie i fatet med den ene enden litt vippet med et stativ. Plasser hver rad med seksjoner under luftbuffergrensesnittet, og senk bufferen for å få delene ut av bufferen til bunnen av lysbildet. Den hvite linjen angir grensesnittet mellom buffer og luft. (C) En fullt montert sklie med hjerneseksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Et eksempel på dobbel immunfluorescensfarging. (A-D) Mikroskopiske bilder som viser fordelingen av WFA (rød, A), AVP (grønn, B), DAPI (blå, C) og fusjonert (D) i koronalmushjerneseksjoner ved Bregma -0,82 mm. Skalastolper = 200 μm. (E-H) Høyere forstørrelsesmikroskopiske bilder av de hvite boksene i henholdsvis A-D. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: 3V = tredje ventrikel; PeFAH = perifornisk område av den fremre hypothalamus; PVH = paraventrikulær kjerne; RT = retikulær kjerne; SON = supraoptisk kjerne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en etablert metode for nevroanatomiske studier av musehjernen, inkludert perfusjon, vevsseksjon, frittflytende immunstaining, vevsmontering og avbildning. Noen få viktige detaljer som er avgjørende for konsistente og pålitelige resultater, må imidlertid optimaliseres.

Kvaliteten på perfusjon er avgjørende for vellykket farging. Fargingsresultater kan påvirkes hvis blodet forblir i hjernen, gitt at blodceller (f.eks. røde blodlegemer) kan generere en kunstig 'positiv' farging10. Vi utleder tilstedeværelsen av en brungrå lever for å indikere en høy kvalitet på perfusjon, noe som vanligvis resulterer i blodfrie hjerner. Den automatiserte perfusjonspumpen som brukes i denne protokollen, bidrar til å parfyme ett dyr vellykket i løpet av kort tid. Utilstrekkelig fiksering vil generere myke og skjøre hjerneseksjoner i de påfølgende prosedyrene, mens over fiksering vil redusere følsomheten til antigenreaksjoner på grunn av den forbedrede formaldehyd krysskoblingen av proteiner. Ulike forhold ble testet, og overnattingsfiksering ved 4 °C var tilstrekkelig for etterfiksering av musehjerner. I tillegg til 10% NBF som brukes i den nåværende protokollen som en fikseringsbuffer, har 4% (w / v) av nylaget paraformaldehyd (PFA) i PBS også blitt mye brukt til vevsfiksering11.

Når det gjelder kryosectioning, må tykkelsen på seksjoner bestemmes avhengig av de spesifikke behovene. For eksempel krever RNAscope-studier en tykkelse på 14 μm i stedet for 25 μm, vanligvis brukt i frittflytende flekker. I mellomtiden krever RNAscope-studier at alle prosedyrer utføres i RNAasefrie løsninger for å bevare integriteten til mål-mRNAene. Noen forskere bruker også en seksjonstykkelse på 30-40 μm for en rekke fargingsprosedyrer. Konvensjonell kryosectioning (dvs. optimal skjæretemperatur (O.C.T.) sammensatte innebygde prøver) gir mye tynnere (f.eks. 10 μm) hjerneseksjoner som kan være avgjørende for intracellulære strukturer eller andre applikasjoner. Kryoosectioning strategien presentert her involverer ikke nødvendigvis O.C.T. sammensatt-innebygging av hjerneprøver og tillater 14-40 μm seksjoner. Det kan ikke være noen signifikant forskjell for 3,3-diaminobenzidin (DAB) farging ved hjelp av 25 eller 40 μm tykke hjerneseksjoner. Tynnere seksjoner gir imidlertid fluorescensbilder av bedre kvalitet.

Fordelen med strategien som presenteres her er at flere hjerneprøver (opptil 5 hjerner) kan kuttes samtidig. Begrensningen av denne metoden er imidlertid at hjerneprøver må kuttes innen 1 uke etter dehydrering fordi nedsenking i 30% sukrose for lenge er mer sannsynlig å forårsake proteinforringelse og andre problemer. For å unngå dette potensielle problemet kan disse hjernedelene overføres til kryopreotektantbufferen og lagres ved -20 °C. For frittflytende farging bør varigheten av inkubasjon og konsentrasjon av både primære og sekundære antistoffer optimaliseres i pilotstudier. Vanligvis er overnatting inkubasjon ved 4 °C eller romtemperatur med mild risting egnet for de fleste primære antistoffer, hvis ikke instruert ellers av produsenter. For sekundære antistoffer fungerer inkubasjon ved romtemperatur i 1-3 timer godt i de fleste situasjoner. Disse detaljene må imidlertid optimaliseres under ulike omstendigheter. For eksempel, for c-fos farging, inkuberer vi vanligvis hjerneseksjonene med en konsentrasjon på 1:1000 over natten ved 4 °C for immunfluorescensfarging. Men ved hjelp av det samme antistoffet for c-fos DAB-farging, foretrekker vi å inkubere hjerneseksjoner med en konsentrasjon på 1:5,000 i 48 timer ved 4 °C.

En cocktail av primære antistoffer og sekundære antistoffer kan brukes til dobbeltfarging for å fremskynde prosedyren. Mer spesifikt blandes to forskjellige primære antistoffer fra forskjellige arter (f.eks. den ene er fra kanin, den andre er fra marsvin, kylling eller mus) før inkubasjon, det samme er de tilsvarende sekundære antistoffene. Valget av sekundært antistoff er avhengig av det primære antistoffet. Hvis det primære antistoffet er fra kanin, må det sekundære antistoffet være anti-kanin, for eksempel esel anti-kanin eller geit anti-kanin. Valget av blokkerende serum avhenger av det sekundære antistoffet, for eksempel vil normalt eselserum bli brukt hvis det sekundære antistoffet er fra esel. Antigenuthenting foreslås dersom immunoppfinningen fortsatt ikke virker selv om alle retningslinjer har blitt fulgt strengt.

Montering og dekslerlipping av hjerneseksjoner må utføres på en veldig delikat måte. Hele prosessen krever ingen rynker, folder eller luftbobler. Det vil ta flere forsøk å bestemme optimal eksponeringstid for avbildning. Vi anbefaler samme eksponeringstid for det samme antistoffet på tvers av forskjellige seksjoner, noe som er viktig for å sammenligne signalintensitetene mellom forskjellige dyr eller grupper. Det er rimelig at eksponeringstiden kanskje ikke er den samme for forskjellige antistoffer, selv i samme seksjon. Eksponeringstiden for DAPI kan for eksempel være kortere enn c-fos-signalet i de fleste tilfeller.

Noen få prosedyrer som presenteres i protokollen er nyttige for å forbedre både pålitelighet og effektivitet gjennom hele prosessen. 1) Bruk av en automatisert perfusjonspumpe for perfusjon kan forkorte perfusjonstiden betydelig og forbedre vevskvaliteten betydelig. 2) Denne kryoseksjonsstrategien gjør det mulig å kutte flere hjerneprøver samtidig, noe som er mye mer effektivt enn konvensjonell praksis. Denne metoden er også enkel for nye forskere å lære og mestre. 3) For frittflytende farging, da hjerneprøver er farget i suspensjon, kan antistoffer trenge inn i seksjonene fra begge sider. Vi optimaliserte inkubasjonsstrategien ved å plassere alle seksjoner fra en prøve / serie i et 1,5 ml mikrosenterrifugerør for primære og sekundære antistoffer, noe som sparer antistoffer, spesielt når vi trenger å flekke hjerneprøver i bulk. En annen fordel med den frittflytende tilnærmingen er at den kan modifiseres og brukes på andre histokjemiske fargingsmetoder (f.eks. kromogene IHC, hematoksylin og eosin, cresylfiolett) i tillegg til immunfluorescensfarging12.

En begrensning ved friflytende farging er imidlertid at svært tynne seksjoner kan være vanskelige å håndtere. En fargemetode på lysbildet kan vurderes hvis bare noen få seksjoner må samles og farges umiddelbart, som det ofte er tilfelle i klinisk patologi. Vi testet også fargingsmetoden på lysbildet ved hjelp av hjerneseksjoner generert fra denne protokollen, og den fungerte bra. For å gjøre dette, monter hjerneseksjonene på lysbilder, vent til seksjonene tørker, og følg en tradisjonell frossen seksjon på lysbildefargingsprotokollen. 4) Montering av frittflytende seksjoner på lysbildene kan være kjedelig for visse forskere, spesielt for nybegynnere. Vi bruker en fin pensel for å forsiktig koaksialisere seksjoner på lysbildet ved luftbuffergrensesnittet og deretter bruke en overføringspipette for å forsiktig fjerne bufferen for å senke luftbuffergrensesnittet når monteringen går fra toppen til bunnen av lysbildet. Selv om den er tidkrevende, er denne strategien vennlig for nybegynnere. Erfarne eksperimenter kan montere alle hjerneseksjonene på lysbildene i PBS samtidig og bare fjerne bufferen for å få lysbildet ut etter at den siste delen er montert. 5) Til slutt bruker vi en skanner for avbildning, som er mer effektiv enn fluorescensmikroskopi, spesielt når det er et stort antall lysbilder for avbildning. Skanneren gjør det mulig å skanne opptil 12 lysbilder i én bunke med en 20x forstørrelse. Alternativt kan standard fluorescensmikroskopi brukes under visse omstendigheter, for eksempel når en bestemt klynge av nevroner i hjernen må vises frem med en høyere forstørrelse (f.eks. 40x eller til og med 60x) 13,14.

Til slutt presenterer dette dokumentet en etablert metodikk for histologiske studier av musehjerner som har vist seg å være reproduserbare, pålitelige og effektive. Protokollen vil bidra til å generere optimale og konsistente histologiske resultater blant forskjellige forskere og laboratorier og tjene som en referanse for nybegynnere å lære denne teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Etterforskerne ble støttet av tilskudd fra NIH (K01DK119471 til CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 og R01DK120858 til YX), USDA/CRIS (51000-064-01S til YX) og American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) til LT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21207
 30% Sucrose VWR 470302 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
 Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe BD 309597
48 Well Cell Culture Plate Corning 3548
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
Antifading mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1200
Autoclavable plastic desiccator Thermo Scientific Nalgene 5315-0150
AVP antibody Phoenix Pharmaceuticals H-065-07
Cell Strainer Corning 431752
Cryoprotectant buffer User preference Not applicable 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope Leica Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place) VWR Not applicable
PBT User preference Not applicable 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System Leica 39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x VWR VWRVE703-1L 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450 ThermoFisher Microm HM450
Sodium Chloride RICCA Chemical 7220-32 0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488 ThermoFisher #21832
Triton X-100 Sigma-Aldrich 089k01921
WFA antibody Sigma-Aldrich L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner Zeiss Not applicable
Zen 3.1 software scanner software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Tags

Nevrovitenskap utgave 176
Frittflytende immunostaining av musehjerner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M.,… More

Tu, L., Zhang, N., Conde, K. M., Bean, J. C., Wang, C., Xu, Y. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. J. Vis. Exp. (176), e62876, doi:10.3791/62876 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter