Summary
Этот протокол описывает эффективный и воспроизводимый подход к гистологическим исследованиям мозга мышей, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию.
Abstract
Иммуногистохимическое окрашивание мозга мыши является рутинным методом, обычно используемым в неврологии для исследования центральных механизмов, лежащих в основе регуляции энергетического обмена и других нейробиологических процессов. Однако качество, надежность и воспроизводимость результатов гистологии мозга могут варьироваться в зависимости от лаборатории. Для каждого эксперимента по окрашиванию необходимо оптимизировать ключевые процедуры, основанные на различиях в видах, тканях, целевых белках и условиях работы реагентов. Эта статья демонстрирует надежный рабочий процесс в деталях, включая внутриаортальную перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию, за которыми могут легко следить исследователи в этой области.
Также обсуждается, как модифицировать эти процедуры для удовлетворения индивидуальных потребностей исследователей. Чтобы проиллюстрировать надежность и эффективность этого протокола, перинейрональные сетки были окрашены биотиновым меченым гглибутинином Wisteria florbunda (WFA) и аргининовым вазопрессином (AVP) антителом против AVP в мозге мыши. Наконец, были рассмотрены критические детали для всей процедуры и преимущества этого протокола по сравнению с другими протоколами. Взятый вместе, в этой статье представлен оптимизированный протокол для свободно плавающего иммуноокрашения ткани мозга мыши. Следование этому протоколу облегчает этот процесс как младшим, так и старшим ученым для улучшения качества, надежности и воспроизводимости иммуноокрашивающих исследований.
Introduction
Распространенность ожирения и связанных с ним сопутствующих заболеваний достигла уровня эпидемии, что приводит к огромному социально-экономическому бремени1,2. Различные мышиные модели были разработаны, чтобы лучше понять биологические процессы, ответственные за ожирение3,4. Поскольку центральные механизмы важны для регуляции энергетического гомеостаза на этих животных моделях, нейроанатомические исследования мозга мышей стали необходимой техникой в этой области. Тем не менее, качество, надежность и воспроизводимость методов гистологии мозга значительно различаются между лабораториями и даже исследователями в одной и той же лаборатории по разным причинам (например, антитела, ткани, методы лечения, виды, цели исследований). Поэтому необходимо установить общий протокол гистологических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, крепление тканей и визуализацию. Между тем, новички могут быстро изучить, освоить и настроить этот протокол для удовлетворения своих индивидуальных потребностей.
Иммуногистохимическое окрашивание является признанным методом, который широко используется для визуализации конкретных типов клеток, мРНК и белков в различных тканях (например, мозге и периферических тканях)5,6. Более конкретно, представляющий интерес антиген может быть меченым специфическим первичным антителом и соответствующим вторичным антителом, связанным с ферментом (например, хромогенной иммуногистохимией) или флуоресцентным красителем (флуоресцеин изотиоцианат)6. В качестве примера полезности этих методов β-эндорфин [один пептид, кодируемый про-опиомеланокортином (POMC)] и c-fos (маркер нейрональной активности) были окрашены в дугообразное ядро. Было показано, что делеция триптофангидроксилазы 2 (фермента, интегрального синтеза серотонина) в дорсальном ядре рафе снижает экспрессию c-fos в нейронах POMC в дугообразном ядре7. Кроме того, распределение мРНК рецептора витамина D было нанесено на карту в мозге мыши посредством гибридизации in situ (RNAscope)8. В данной работе представлен надежный и эффективный метод с пошаговым рабочим процессом для свободно плавающего иммуноокрашения, направленный на улучшение качества и воспроизводимости гистологических исследований мозга мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В настоящем исследовании использовались мыши C57BL/6J обоих полов (в возрасте 8-16 недель). Уход за всеми животными и все процедуры были одобрены комитетами по институциональному уходу и использованию животных Медицинского колледжа Бейлора.
1. Перфузия
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.1 - 1.6 выполняются в вытяжном шкафу.
- Анестезия
- Налейте 5 мл изофлурана (см. Таблицу материалов) на бумажное полотенце, расположенное в нижней части осушителя. Введите мышь на отверстие барьера внутри осушителя и подождите, пока признаки дыхания не исчезнут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Без дыхания у мыши все еще есть сердцебиение в течение короткого периода времени, и оно будет перфузировано до исчезновения сердцебиения. - Прежде чем продолжить, убедитесь, что нет рефлекса на защемление пальца ноги.
- Прикрепите мышь к пенопластовой доске, введя булавку через каждую ногу. Убедитесь, что пенопластовая плита помещена в лоток для сбора вторичных жидкостей.
- Налейте 5 мл изофлурана (см. Таблицу материалов) на бумажное полотенце, расположенное в нижней части осушителя. Введите мышь на отверстие барьера внутри осушителя и подождите, пока признаки дыхания не исчезнут.
- Обнажение сердца
- Сделайте продольный поверхностный разрез вдоль средней линии над грудной клеткой и животом, затем отодвиньте кожу в сторону, чтобы обнажить мышечную стенку грудной клетки и живота. Далее сделайте разрез в мышечном слое, чтобы обнажить печень и кишечник. Наконец, разрежьте грудную клетку ножницами, чтобы открыть грудную клетку и обнажить сердце и легкие. Используйте гемостатические щипцы, чтобы оттянуть грудную клетку в сторону, чтобы расширить рабочую зону.
- Забор терминальной крови (по желанию)
- Осторожно вставьте шприц объемом 1 мл (см. Таблицу материалов) в правое предсердие сердца до полного встраивания наконечника. Держите шприц неподвижно и медленно вытягивайте кровь, пока не будет достигнут желаемый объем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не проникнуть за пределы правого предсердия; Сбор 300-400 мкл крови достижим на одну взрослую мышь. Могут использоваться добавки, такие как ускоритель сгустков или антикоагулянт, в зависимости от цели сбора крови.
- Осторожно вставьте шприц объемом 1 мл (см. Таблицу материалов) в правое предсердие сердца до полного встраивания наконечника. Держите шприц неподвижно и медленно вытягивайте кровь, пока не будет достигнут желаемый объем.
- Размещение перфузионной канюли
- Для начинающих вырежьте ножницами небольшое отверстие (<1 мм) в левом желудочке сердца и вставьте тупую канюлю (игла 18 г для молодых мышей и игла 21 г для пожилых мышей) через левый желудочек в восходящую аорту. В качестве альтернативы, для опытных экспериментаторов, проникните в левый желудочек сердца тупой канюлей напрямую и аккуратно вставьте ее в восходящую аорту.
- Поместите штифты вокруг соединения канюли и спаренной трубки на пенопластовой доске, чтобы предотвратить движение во время перфузии. В качестве альтернативы, используйте гемостатические щипцы, чтобы зафиксировать канюлю на месте. Приступайте к разрезанию правого предсердия, чтобы обеспечить отток крови из кровообращения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная канюля и соединенная трубка соединены с перфузионным насосом.
- Перфузия с физиологическим раствором
- Включите переключатель давления физиологического раствора и перфьминируйте мышь транскардиально 40-60 мл физиологического раствора (0,9% NaCl: 25 °C, рН 7,4). Внимательно наблюдайте за оттоком из правого предсердия и цветом печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный перфузионный насос (см. Таблицу материалов) используется для промывки крови в течение 1-2 мин. Поскольку диапазон давления насоса составляет 1-300 мм рт.ст., скорость может быть отрегулирована соответствующим образом. Если физиологический раствор вытекает из носа и / или легкое раздувается, уменьшите давление и отрегулируйте канюлю. Как только отток перестает содержать кровь, мозг достаточно промывается физиологическим раствором. Между тем печень лишена крови и приобретает коричневато-серый цвет.
- Включите переключатель давления физиологического раствора и перфьминируйте мышь транскардиально 40-60 мл физиологического раствора (0,9% NaCl: 25 °C, рН 7,4). Внимательно наблюдайте за оттоком из правого предсердия и цветом печени.
- Перфузия с формалином
- Выключите реле давления физиологического раствора и включите переключатель давления формалина, чтобы перфузить мышь 40 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (10% NBF: 25 °C, рН 6,8-7,2, см. Таблицу материалов). Понаблюдайте за конечностями животного на наличие признаков тремора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Движение хвоста может также наблюдаться после инфузии 10% NBF. ВНИМАНИЕ: Поскольку NBF опасен, исследователям предлагается носить средства индивидуальной защиты (например, соответствующий респиратор, лицевой щиток) на протяжении всей процедуры.
- Выключите реле давления физиологического раствора и включите переключатель давления формалина, чтобы перфузить мышь 40 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (10% NBF: 25 °C, рН 6,8-7,2, см. Таблицу материалов). Понаблюдайте за конечностями животного на наличие признаков тремора.
- Изоляция мозга9
- Используйте ножницы, чтобы удалить голову. Сделайте разрез средней линии вдоль кожного покрова, чтобы обнажить череп. Обрежьте кожу и прикрепление мышц ножницами.
- Сделайте разрез на орбитальном гребне, а затем поместите острый конец ножниц радужной оболочки в отверстие magnum. Выдвигайте ножницы вдоль внутренней поверхности черепа, поддерживая давление вверх, чтобы избежать повреждения мозга. Осторожно удалите теменные/лобные кости и мозговые оболочки. Наконец, аккуратно извлеките мозг из вскрытого черепа.
- Постфиксация
- Поместите мозг в трубку объемом 15 мл, заполненную 10 мл 5% NBF и 15% сахарозы для ночной фиксации при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения 10 мл 5% NBF и 15% сахарозы соедините 5 мл 10% NBF и 5 мл 30% сахарозы (мас./об., растворенные в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), см. Таблицу материалов). Убедитесь, что объем фиксирующего буфера по крайней мере в 10 раз больше, чем сам образец. Первоначально мозг будет плавать в буфере и опустится на дно после ночной фиксации.
- Поместите мозг в трубку объемом 15 мл, заполненную 10 мл 5% NBF и 15% сахарозы для ночной фиксации при 4 °C.
- Обезвоживание
- Переместите образец мозга в пробирку объемом 15 мл, заполненную 10 мл 30% сахарозы для обезвоживания при 4 °C, пока она не утонет.
2. Криосекционирование (корональные сечения)
- Подготовка
- Поместите сухой лед поверх пластины регулировки высоты скользящего микротома и подождите, пока не будет виден белый иней. Аккуратно выложите 5 мл 30% сахарозы поверх пластины, чтобы сформировать слой твердой основы после того, как раствор сахарозы будет полностью заморожен. Поместите все образцы мозга (до 5 образцов мозга в одной партии) горизонтально в линию поверх сахарозы, а затем добавьте 0,5 мл 30% сахарозы в нижнюю часть каждого мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг сразу же прилипнет к замороженному основанию сахарозы и постепенно замерзнет снизу вверх. Поместите дополнительную сахарозу вокруг установленной части мозга, чтобы сформировать более прочную основу для резки.
- Поместите сухой лед поверх пластины регулировки высоты скользящего микротома и подождите, пока не будет виден белый иней. Аккуратно выложите 5 мл 30% сахарозы поверх пластины, чтобы сформировать слой твердой основы после того, как раствор сахарозы будет полностью заморожен. Поместите все образцы мозга (до 5 образцов мозга в одной партии) горизонтально в линию поверх сахарозы, а затем добавьте 0,5 мл 30% сахарозы в нижнюю часть каждого мозга.
- Секционирование
- После 5-10 минут замораживания, когда мозг стал твердым и белым, обрежьте мозг до тех пор, пока не будет достигнут желаемый слой / область.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество сухого льда на пластине, чтобы контролировать температуру. Температура слишком низкая, когда кристаллы льда появляются на поверхности мозга. Температура слишком высока, когда мозг становится мягким и больше не белым. - Переключитесь из режима Обрезки в режим Подачи и разреза ткани мозга толщиной 25 мкм. Подготовьте 48-луночную пластину, заполненную 1x PBS, и отметьте пять лунок для одного мозга мыши. Используйте кисть, чтобы собрать каждый участок от одной мыши и поместить его в один колодец. Соберите последующий участок той же мыши и поместите его во 2-й колодец .
- Повторяйте 2.2.2 до достижения 5-й скважины, помещая секции 6-10 в 1-5-ю скважину и так далее. Повторите ту же процедуру для остальной части мозга одновременно. Повторяйте до тех пор, пока все участки от одной мыши не будут собраны в 5 лунок в анатомическом порядке.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры участки мозга каждой мыши распределяются в 5 серий, которые могут быть использованы для 5 различных гистологических исследований.
- После 5-10 минут замораживания, когда мозг стал твердым и белым, обрежьте мозг до тех пор, пока не будет достигнут желаемый слой / область.
- Хранение
- Используйте кисть для переноса участков из каждой скважины в микропробирку объемом 1,5 мл, заполненную буфером криопротектора (20% глицерина, 30% этиленгликоля и 50% PBS), и храните образцы при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти секции, хранящиеся в небольших пробирках (1,5 мл), могут сэкономить физическое пространство в морозильной камере, а целостность секций может сохраняться в течение нескольких месяцев.
- Используйте кисть для переноса участков из каждой скважины в микропробирку объемом 1,5 мл, заполненную буфером криопротектора (20% глицерина, 30% этиленгликоля и 50% PBS), и храните образцы при -20 °C.
3. Свободно плавающее окрашивание WFA и анти-AVP иммуноокрашающее
- Поместите клеточный ситечко в колодец из 6-луночной пластины для культивирования клеток, заполненной PBS, и используйте кисть для переноса одной серии участков мозга в клеточный ситечко. Промыть участки в PBS, перенеся клеточный ситечко в другой колодец, заполненный PBS. Промыть в течение 6 х 10 мин на шейкере для секций, хранящихся в криопротекторном буфере и 3 х 10 мин для свежеразрезанных срезов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры промывки выполняются в 6-луночной клеточной культуральной пластине с клеточным сетчатым фильтром внутри каждой скважины (см. Таблицу материалов). Каждое ситечко содержит участки мозга, представляющие интерес для каждой мыши. Для экономии реагентов все описанные ниже процедуры инкубации выполняются в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Между промывкой и инкубационными процедурами используйте кисть для переноса участков мозга между каждым клеточным ситечком и каждой трубкой. Для промывки PBS достаточно 12 мл для каждой лунки. - Готовят 1 мл меченого биотином раствора WFA (1:1000) в буфере PBT (2,5 мл Triton X-100, растворенного в 1000 мл PBS) в пробирке объемом 1,5 мл. Перенесите участки мозга из клеточного ситечка в трубку и инкубируйте при комнатной температуре на качающейся платформе ~ 50 об/мин в течение ночи.
- Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин, как описано в 3.1.
- Готовят 1 мл раствора стрептавидина-Дилайта 488 (1:500) в ПБТ в пробирке объемом 1,5 мл. Перенесите срезы мозга в трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч на качающейся платформе при ~50 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте пластину фольгой, чтобы избежать воздействия света с этого шага вперед. - Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин. Инкубируют участки мозга в блокирующем буфере (3% нормальной ослиной сыворотки, разведенной в ПБТ) в течение 2 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор блокирующей сыворотки определяется видом, из которого генерируется вторичное антитело. Например, если вторичное антитело от козла, следует использовать нормальную козью сыворотку. - Инкубируют участки мозга в первичном антителе (анти-AVP кролика, 1:500) при комнатной температуре на качающейся платформе при ~50 об/мин в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получайте как первичные, так и вторичные антитела в блокирующем буфере. Концентрация, продолжительность инкубации и температура инкубации должны быть оптимизированы в пилотных исследованиях. - Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин. Инкубируют участки мозга во вторичных антителах (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) при комнатной температуре в течение 2 ч на качающейся платформе при ~50 об/мин. Промывайте участки мозга PBS в течение 3 x 10 мин.
4. Монтаж
- Наполните две чашки Петри (диаметром 150 мм) 100 мл по 1x PBS каждая. Переместите все участки мозга с одного ситечка в первую чашку и выровняйте участки мозга в нейроанатомическом порядке от каудального до рострального.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать смешивания секций разных животных, установите одну серию секций мозга от одного животного за раз. - После того, как все участки мозга выровнены в первой чашке, погрузите один слайд во второе блюдо с одним концом, слегка наклоненным подставкой (см. Рисунок 1 и Рисунок 2). Используйте тонкую кисть, чтобы аккуратно поместить секцию мозга чуть ниже интерфейса воздушного буфера на наклонном слайде. Повторите ту же процедуру с другим участком мозга и установите его бок о бок с первым отделом.
- Используйте передаточную пипетку, чтобы медленно и осторожно удалить буфер, чтобы понизить его уровень, пока оба отдела мозга не окажутся полностью над интерфейсом воздух-буфер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму нарушение буферной поверхности, иначе участки мозга могут уплыть. При высыхании этот ряд участков мозга будет прочно прилипать к слайду. При необходимости аккуратно отрегулируйте участки на слайде, чтобы убедиться, что в ткани нет морщин или складок, когда участки еще влажные. - Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет достигнута нижняя часть слайда. Продолжайте повторять до тех пор, пока все секции не будут установлены на слайд(ы).
5. Обшивка
- После того, как все секции высохнут (1-24 ч при комнатной температуре), поместите 80-100 мкл антивядающей монтажной среды с DAPI (см. Таблицу материалов) на слайд и аккуратно нанесите стеклянную крышку, чтобы покрыть образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите стеклянную крышку осторожно и медленно, чтобы избежать пузырьков. - Поместите слайды в коробку для слайдов микроскопа (см. Таблицу материалов) и храните их при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразите все участки в течение 1-3 дней, чтобы избежать затухания флуоресценции и развития автофлуоресценции.
6. Визуализация
- Включите сканер и компьютер (см. Таблицу материалов). Поместите слайды в держатель слайдов вместе с загрузочным устройством и вставьте держатель в сканер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканер позволяет сканировать несколько каналов (например, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), зеленый и красный каналы) одновременно. Сканер сканирует слайды только с 20-кратным увеличением, а традиционный флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалов) можно использовать, когда требуется более высокое увеличение (например, 40x). - Откройте программное обеспечение для сканера (см. Таблицу материалов). Выберите соответствующее место хранения и профиль сканирования.
- Запустите сканирование предварительного просмотра, нажав кнопку Начать предварительное сканирование . После предварительного сканирования откройте мастер обнаружения тканей и обведите кружком интересующие области для визуализации.
- Нажмите кнопку Начать сканирование после выбора областей для визуализации. Подождите, пока устройство завершит сканирование. Проверьте файл результатов и экспортируйте изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если профиль не подходит для слайда, отрегулируйте, перефокусировав и изменив время экспозиции или силу света, чтобы адаптировать профиль к тканям. Обратитесь к инструкции к сканеру для получения более подробной технической информации (Таблица материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Блок-схема этого протокола кратко проиллюстрирована на рисунке 1. Процедура криосечения в этой лаборатории показана на рисунке 2А, в котором 5 образцов мозга были разделены одновременно. Крепление участков мозга показано на рисунке 2B, а полностью смонтированный слайд с секциями мозга проиллюстрирован на рисунке 2C. На фиг.3 представлены репрезентативные флуоресцентные иммуногистохимические изображения участка мозга мыши с совместным окрашиванием WFA и AVP при все большем и большем увеличении при Брегме -0,82 мм. Сигналы AVP наблюдались в паравентрикулярном ядре и супраоптическом ядре. Сигналы WFA наблюдались в перифорнической области переднего гипоталамуса и ретикулярного ядра.
Рисунок 1: Блок-схема флуоресцентной иммуногистохимии с мозгом мыши. После полной анестезии мышь перфузируется физиологическим раствором, а затем 10% NBF. Мозг тщательно удаляется и разрезается на участки после фиксации и обезвоживания. Секции инкубировались с WFA, а затем Streptavidin-Dylight 488 после трех промывок PBS. Участки мозга блокировали, а затем инкубировали с первичным анти-AVP антителом. Затем секции промывали 3 раза PBS с последующим инкубацией с вторичным антителом Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L). Секции мозга были установлены на слайдах и крышках, размещенных на слайдах с антивядающей монтажной средой с DAPI перед визуализацией. Сокращения: NBF = нейтральный буферизованный формалин; WFA = глициния флорбунда агглютинин; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; AVP = аргинин вазопрессин; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фотографии, иллюстрирующие практическую криосечение и монтаж в лаборатории. (A) Построить основание поверх пластины с 30% сахарозой для горизонтального удержания всех образцов, разрезать ткани на участки (25 мкм / секция) и собрать секции в 48-луночную пластину для культивирования клеток, заполненную фосфатно-буферным физиологическим раствором. (Б) Погрузите горку в блюдо с одним концом, слегка наклоненным подставкой. Поместите каждый ряд секций под интерфейс воздушного буфера и опустите буфер, чтобы вывести разделы из буфера до нижней части слайда. Белая линия указывает на интерфейс буфера и воздуха. (C) Полностью установленный слайд с секциями мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пример двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. (A-D) Микроскопические изображения, показывающие распределение WFA (красный, A), AVP (зеленый, B), DAPI (синий, C) и слияние (D) в корональных участках мозга мыши в Брегма -0,82 мм. Шкала полос = 200 мкм. (E-H) Более высокое увеличение микроскопических изображений белых прямоугольников в A-D соответственно. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: 3V = третий желудочек; PeFAH = перифорническая область переднего гипоталамуса; PVH = паравентрикулярное ядро; RT = ретикулярное ядро; SON = супраоптическое ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает установленный метод нейроанатомических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение тканей, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию. Тем не менее, несколько ключевых деталей, необходимых для последовательных и надежных результатов, должны быть оптимизированы.
Качество перфузии имеет решающее значение для успешного окрашивания. Результаты окрашивания могут быть затронуты, если кровь остается в мозге, учитывая, что клетки крови (например, красные кровяные клетки) могут генерировать искусственное «положительное» окрашивание10. Мы выводим, что наличие коричневато-серой печени указывает на высокое качество перфузии, что обычно приводит к отсутствию крови мозга. Автоматизированный перфузионный насос, используемый в этом протоколе, помогает успешно перфузить одно животное в течение короткого периода. Недостаточная фиксация будет генерировать мягкие и хрупкие участки мозга в последующих процедурах, в то время как чрезмерная фиксация снизит чувствительность антигенных реакций из-за усиленного сшивания формальдегида белков. Были протестированы различные условия, и ночной фиксации при 4 °C было достаточно для постфиксации мозга мыши. В дополнение к 10% NBF, используемому в настоящем протоколе в качестве фиксаторного буфера, 4% (мас./об.) свежеприготовленного параформальдегида (PFA) в PBS также широко используется для фиксации тканей11.
Что касается криосекции, толщина секций должна быть определена в зависимости от конкретных потребностей. Например, исследования RNAscope требуют толщины 14 мкм вместо 25 мкм, обычно используемых в свободно плавающем окрашивании. Между тем, исследования RNAscope требуют, чтобы все процедуры выполнялись в растворах без РНКАазы для сохранения целостности целевых мРНК. Некоторые исследователи также используют толщину сечения 30-40 мкм для различных процедур окрашивания. Традиционная криосечение (т.е. оптимальная температура резания (O.C.T.) составные образцы) позволяет создавать гораздо более тонкие (например, 10 мкм) участки мозга, которые могут иметь решающее значение для внутриклеточных структур или других применений. Стратегия криосекции, представленная здесь, не обязательно включает в себя встраивание соединений O.C.T. образцов мозга и допускает 14-40 мкм секций. Может не быть существенной разницы для окрашивания 3,3-диаминобензидином (DAB) с использованием участков мозга толщиной 25 или 40 мкм. Тем не менее, более тонкие участки предлагают более качественные флуоресцентные изображения.
Преимущество представленной здесь стратегии заключается в том, что несколько образцов мозга (до 5 мозгов) могут быть вырезаны одновременно. Однако ограничение этого метода заключается в том, что образцы мозга должны быть вырезаны в течение 1 недели после обезвоживания, потому что погружение в 30% сахарозы слишком долго с большей вероятностью вызовет деградацию белка и другие проблемы. Чтобы избежать этой потенциальной проблемы, эти участки мозга могут быть перенесены в буфер криопротектора и сохранены при -20 ° C. Для свободно плавающего окрашивания продолжительность инкубации и концентрация как первичных, так и вторичных антител должны быть оптимизированы в пилотных исследованиях. Как правило, ночная инкубация при 4 °C или комнатной температуре с легким встряхиванием подходит для большинства первичных антител, если производители не проинструктированы иначе. Для вторичных антител инкубация при комнатной температуре в течение 1-3 ч хорошо работает в большинстве ситуаций. Однако эти детали должны быть оптимизированы для различных обстоятельств. Например, для окрашивания c-fos мы обычно инкубируем участки мозга с концентрацией 1:1000 в течение ночи при 4 ° C для иммунофлуоресцентного окрашивания. Однако, используя одно и то же антитело для окрашивания c-fos DAB, мы предпочитаем инкубировать участки мозга с концентрацией 1:5000 в течение 48 ч при 4 °C.
Коктейль из первичных антител и вторичных антител может быть использован для двойного окрашивания, чтобы ускорить процедуру. Более конкретно, перед инкубацией смешиваются два различных первичных антитела от разных видов (например, одно от кролика, другое от морской свинки, курицы или мыши), как и соответствующие вторичные антитела. Выбор вторичного антитела зависит от первичного антитела. Если первичное антитело от кролика, вторичное антитело должно быть анти-кроликом, например, ослик против кролика или коза против кролика. Выбор блокирующей сыворотки зависит от вторичного антитела, например, нормальная ослиная сыворотка будет использоваться, если вторичное антитело от осла. Извлечение антигена рекомендуется, если иммуноокрашивание все еще не работает, даже если все рекомендации строго соблюдаются.
Монтаж и обшивка отделов мозга должны выполняться очень деликатным образом. Весь процесс не требует морщин, складок или пузырьков воздуха. Потребуется несколько испытаний, чтобы определить оптимальное время экспозиции для визуализации. Мы рекомендуем одинаковое время воздействия одного и того же антитела на разных участках, что важно для сравнения интенсивности сигнала среди разных животных или групп. Разумно, что время воздействия может быть не одинаковым для разных антител, даже в одном и том же разделе. Например, время экспозиции для DAPI в большинстве случаев может быть короче, чем сигнал c-fos.
Несколько процедур, представленных в протоколе, полезны для повышения надежности и эффективности на протяжении всего процесса. 1) Использование автоматизированного перфузионного насоса для перфузии может значительно сократить время перфузии и значительно улучшить качество тканей. 2) Эта стратегия криосекции позволяет нарезать несколько образцов мозга одновременно, что намного эффективнее, чем обычная практика. Этот метод также легко освоить и освоить новым исследователям. 3) Для свободно плавающего окрашивания, поскольку образцы мозга окрашиваются в суспензии, антитела могут проникать в секции с обеих сторон. Мы оптимизировали стратегию инкубации, поместив все секции из одного образца / серии в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для первичных и вторичных антител, что экономит антитела, особенно когда нам нужно окрашивать образцы мозга оптом. Еще одним преимуществом свободно плавающего подхода является то, что он может быть модифицирован и применен к другим гистохимическим методам окрашивания (например, хромогенный IHC, гематоксилин и эозин, крезиловый фиолетовый) в дополнение к иммунофлуоресцентному окрашиванию12.
Тем не менее, одним из ограничений свободно плавающего окрашивания является то, что очень тонкие участки могут быть трудными для обработки. Метод окрашивания на слайде может быть рассмотрен, если только несколько участков должны быть собраны и окрашены немедленно, как это часто бывает в клинической патологии. Мы также протестировали метод окрашивания на слайде с использованием участков мозга, сгенерированных из этого протокола, и он работал хорошо. Для этого установите секции мозга на слайды, подождите, пока секции высохнут, и следуйте традиционному протоколу окрашивания замороженных секций на слайде. 4) Монтаж свободно плавающих секций на слайдах может быть утомительным для некоторых исследователей, особенно для начинающих. Мы используем тонкую кисть, чтобы аккуратно увязать секции на слайде на интерфейсе воздушного буфера, а затем используем передаточную пипетку, чтобы аккуратно удалить буфер, чтобы опустить интерфейс воздушного буфера по мере продвижения монтажа сверху вниз слайда. Хотя эта стратегия отнимает много времени, она дружелюбна для начинающих. Опытные экспериментаторы могут смонтировать все секции мозга на слайды в PBS за один раз и удалить буфер только для вывода слайда после того, как будет смонтирована последняя секция. 5) Наконец, мы используем сканер для визуализации, который более эффективен, чем флуоресцентная микроскопия, особенно когда есть большое количество слайдов для визуализации. Сканер позволяет сканировать до 12 слайдов в одной партии с 20-кратным увеличением. Альтернативно, стандартная флуоресцентная микроскопия может быть использована в определенных обстоятельствах, например, когда определенный кластер нейронов в мозге должен быть продемонстрирован с более высоким увеличением (например, 40x или даже 60x)13,14.
В заключение, в данной статье представлена устоявшаяся методология гистологических исследований мозга мышей, которая доказала свою воспроизводимость, надежность и эффективность. Протокол поможет генерировать оптимальные и последовательные гистологические результаты среди различных исследователей и лабораторий и послужит ориентиром для начинающих для изучения этой техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Исследователи были поддержаны грантами NIH (K01DK119471 для CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 и R01DK120858 to YX), USDA/CRIS (51000-064-01S to YX) и постдокторская стипендия Американской кардиологической ассоциации (#829565) в LT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H.
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
