Fritt flytande immunstaining av mushjärnor

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv och reproducerbar strategi för mushjärnhjärnens histologiska studier, inklusive perfusion, hjärnsektion, fritt flytande immunstaining, vävnad montering och imaging.

Abstract

Immunohistochemical färgning av mushjärnor är en rutinteknik som ofta används inom neurovetenskap för att undersöka centrala mekanismer som ligger till grund för regleringen av energimetabolism och andra neurobiologiska processer. Kvaliteten, tillförlitligheten och reproducerbarheten av hjärnans histologi resultat kan dock variera mellan laboratorier. För varje färgningsexperiment är det nödvändigt att optimera de viktigaste förfarandena baserat på skillnader i arter, vävnader, riktade proteiner och reagensernas arbetsförhållanden. Detta dokument visar ett tillförlitligt arbetsflöde i detalj, inklusive intra-aorta perfusion, hjärnan sektionering, fritt flytande immunstaining, vävnad montering och imaging, som lätt kan följas av forskare inom detta område.

Också diskuteras hur man ändrar dessa förfaranden för att tillgodose forskarnas individuella behov. För att illustrera tillförlitligheten och effektiviteten i detta protokoll, perineuronal nät färgades med biotin-märkt Wisteria florbunda agglutinin (WFA) och arginin vasopressin (AVP) med en anti-AVP antikroppar i mushjärnan. Slutligen har de kritiska detaljerna för hela förfarandet tagits upp och fördelarna med detta protokoll jämfört med andra protokoll. Sammantaget presenterar detta dokument ett optimerat protokoll för fritt flytande immunstaining av mushjärnvävnad. Att följa detta protokoll gör denna process enklare för både yngre och seniora forskare att förbättra kvaliteten, tillförlitligheten och reproducerbarheten av immunstaining studier.

Introduction

Förekomsten av fetma och tillhörande samsjuklighet har nått epidemiska nivåer, vilket orsakar en enorm socioekonomisk ^börda1,2. Olika musmodeller har utvecklats för att bättre förstå de biologiska processer som är ansvariga för ^fetma3,4. Eftersom centrala mekanismer är viktiga för regleringen av energihomeostas i dessa djurmodeller, har neuroanatomiska studier av mushjärnor blivit en nödvändig teknik inom detta område. Kvaliteten, tillförlitligheten och reproducerbarheten hos hjärnans histologitekniker varierar dock avsevärt mellan laboratorier och till och med forskare inom samma laboratorium av olika skäl (t.ex. antikroppar, vävnader, behandlingar, arter, forskningsmål). Därför är det nödvändigt att upprätta ett allmänt protokoll för histologiska studier av mushjärnan, inklusive perfusion, hjärnsektion, fritt flytande immunstaining, vävnad montering och imaging. Under tiden kan nybörjare snabbt lära sig, behärska och justera detta protokoll för att tillfredsställa sina individuella behov.

Immunohistochemical färgning är en etablerad metod som har använts i stor utsträckning för att visualisera specifika celltyper, mRNAs och proteiner i en mängd olika vävnader (t.ex. hjärnan och perifera vävnader)^5,6. Mer specifikt kan ett antigen av intresse märkas med en specifik primär antikropp och en motsvarande sekundär antikropp kopplad till ett enzym (t.ex. kromogen immunohistokemi) eller ett fluorescein isotiocanate)⁶. Som ett exempel på nyttan av dessa tekniker, β-endorfin [en peptid kodad av pro-opiomelanocortin (POMC)] och c-fos (en markör för neuronal aktivitet) färgades i arcuate kärnan. Borttagning av tryptofan hydroxylas 2 (ett enzym integrerad i serotonin syntes) i dorsal raphe kärnan visade sig minska c-fos uttryck i POMC nervceller i arcuate ^kärnan7. Dessutom kartlades fördelningen av D-vitaminreceptor mRNA i mushjärnan via in situ hybridisering (RNAscope)⁸. Detta dokument presenterar en pålitlig och effektiv metod med ett steg-för-steg-arbetsflöde för fritt flytande immunstaining, som syftar till att förbättra kvaliteten och reproducerbarheten av histologiska studier av mushjärnan.

Protocol

C57BL/6J möss av båda könen (8-16 veckors ålder) användes i den aktuella studien. Vård av alla djur och alla förfaranden godkändes av Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committees.

1. Perfusion

OBS: Steg 1.1 - 1.6 utförs i en rökhuv.

1. Anestesi
   1. Häll 5 ml isofluran (se materialtabellen) på en pappershandduk placerad längst ner på en desiccator. För in musen på hålbarriären inuti desiccatorn och vänta tills tecken på andning har försvunnit.
      OBS: Utan andning har musen fortfarande hjärtslag under en kort tid, och den kommer att perfuseras innan hjärtslagen försvinner.
   2. Innan du fortsätter, bekräfta att det inte finns någon reflex till en toe-pinch.
   3. Fäst musen på en skumbräda genom att köra en stift genom varje fot. Se till att skumskivan placeras i en bricka för att samla vätskespill.
2. Exponera hjärtat
   1. Gör ett längsgående ytligt snitt längs mittlinjen över bröstkorgen och buken och flytta sedan huden åt sidan för att exponera bröstkorgens och bukens muskelvägg. Gör sedan ett snitt i muskelskiktet för att exponera levern och tarmarna. Skär slutligen revbenskorgen med sax för att öppna bröstkorgen och exponera hjärtat och lungorna. Använd hemostatiska tångar för att dra bröstkorgen åt sidan för att bredda arbetsområdet.
3. Insamling av terminalblod (valfritt)
   1. Sätt försiktigt in en 1 ml-spruta (se materialbordet) i hjärtats högra förmak tills spetsen är helt inbäddad. Håll sprutan stadig och dra långsamt blod tills önskad volym har uppnåtts.
      OBS: Var försiktig så att du inte tränger förbi rätt förmak; Insamling av 300-400 μL blod kan uppnås per vuxen mus. Tillsatser som en proppaccelerator eller antikoagulantia kan användas, beroende på syftet med bloduppsamlingen.
4. Placering av perfusionskaylen
   1. För nybörjare, skär ett litet hål (<1 mm) i hjärtats vänstra kammare med sax och sätt in en trubbig kanyl (18 G nål för unga möss och 21 G nål för åldrade möss) genom vänster ventrikel i den stigande aortan. Alternativt, för erfarna experimenterare, penetrera vänster hjärta ventrikel med en trubbig kanyl direkt och sätt in den i den stigande aortan noggrant.
   2. Placera stift runt kanylens konjunktion och kopplade slangar på skumbrädan för att förhindra rörelse under perfusionen. Alternativt kan du använda hemostatiska tångar för att fixera kanylen på plats. Fortsätt att skära rätt förmak för att tillåta utflödet av blod från cirkulationen.
      OBS: Perfusions cannula och kopplade slangar är anslutna till perfusionspumpen.
5. Perfusion med saltlösning
   1. Slå på saltlösningstryckbrytaren och perfusera musen transkartärt med 40-60 ml saltlösning (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observera utflödet från rätt förmak och leverns färg noga.
      OBS: En automatiserad perfusionspump (se materialregistret) används för att spola blodet inom 1-2 min. Eftersom pumpens tryckområde är 1-300 mmHg kan hastigheten justeras i enlighet därmed. Om saltlösning läcker från näsan och/eller lungan är uppblåst, minska trycket och justera kanylen. När utflödet inte längre innehåller blod spolas hjärnan tillräckligt med saltlösning. Under tiden saknar levern blod och blir brungrå i färg.
6. Perfusion med formalin
   1. Stäng av saltlösningstryckbrytaren och slå på formalintryckbrytaren för att perfusera musen med 40 ml 10% neutralt buffrat formalin (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, se materialtabellen). Observera djurets lemmar för tecken på skakningar.
      OBS: Svansrörelser kan också observeras efter infusion av 10% NBF. VARNING: Eftersom NBF är farligt föreslås det att forskare bär personlig skyddsutrustning (t.ex. lämplig andningsskydd, ansiktsskydd) under hela proceduren.
7. ^{Hjärnisolering9}
   1. Använd sax för att ta bort huvudet. Gör ett mittlinjesnitt längs integumentet för att exponera skallen. Trimma av huden och muskelfästet med sax.
   2. Gör ett snitt vid omloppsbanans ås och placera sedan den skarpa änden av irissaxen i foramen magnum. För saxen längs skallens inre yta och håll uppåttryck för att undvika skador på hjärnan. Ta bort parietal/frontalben och hjärnhinnor försiktigt. Slutligen ta bort hjärnan från den öppnade skallen försiktigt.
8. Efterfixering
   1. Placera hjärnan i ett 15 ml-rör fyllt med 10 ml 5% NBF och 15% sackaros för över natten fixering vid 4 °C.
      OBS: För att förbereda 10 ml 5% NBF och 15% sackaros, kombinera 5 ml 10% NBF och 5 ml 30% sackaros (w/v, upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), se materialtabellen). Kontrollera att volymen för fixativebufferten är minst 10x större än själva exemplet. Inledningsvis kommer hjärnan att flyta i bufferten och sjunka till botten efter över natten fixering.
9. Uttorkning
   1. Överför hjärnprovet till ett 15 ml-rör fyllt med 10 ml 30% sackaros för uttorkning vid 4 °C tills det sjunker.

2. Cryosectioning (koronalsektioner)

1. Förberedelse
   1. Placera torr is ovanpå höjdjusteringsplattan på en glidande mikrotom och vänta tills vit frost är synlig. Sprid försiktigt 5 ml 30% sackaros ovanpå plattan för att bilda ett lager av en fast bas efter att sackaroslösningen är helt frusen. Placera alla hjärnprover (upp till 5 hjärnprover i ett parti) horisontellt i en linje ovanpå sackarosen och tillsätt sedan 0,5 ml 30% sackaros till botten av varje hjärna.
      OBS: Hjärnan kommer omedelbart att hålla fast vid den frusna sackarosbasen och gradvis frysa från botten till toppen. Placera ytterligare sackaros runt den monterade delen av hjärnan för att bilda en kraftigare bas för skärning.
2. Snittning
   1. Efter 5-10 minuters frysning, när hjärnan har blivit hård och vit, trimma hjärnan tills önskat lager / region nås.
      OBS: Justera mängden torris på plattan för att kontrollera temperaturen. Temperaturen är för låg när iskristaller dyker upp på hjärnans yta. Temperaturen är för hög när hjärnan blir mjuk och inte längre vit.
   2. Växla från trimläget till matningsläget och sektionens hjärnvävnad till 25 μm tjocklek. Förbered en 48-brunnsplatta fylld med 1x PBS och markera fem brunnar för en mushjärna. Använd en pensel för att samla varje sektion från en mus och placera den i en brunn. Samla den efterföljande delen av samma mus och placera den i den ^andra brunnen.
   3. Upprepa 2.2.2 tills den 5^{: e} brunnen har nåtts och placera sektionerna 6-10 i den 1^{: a-5: e} brunnen och så vidare. Upprepa samma procedur för resten av hjärnan samtidigt. Upprepa tills alla sektioner från en mus samlas in i de 5 brunnarna i anatomisk ordning.
      OBS: Efter denna procedur, hjärnan sektioner från varje mus är aliquoted i 5-serien, som kan användas för upp till 5 olika histologiska studier.
3. Lagring
   1. Använd en pensel för att överföra sektionerna från varje brunn till ett 1,5 ml mikrorör fyllt med kryoprotekterande buffert (20% glycerol, 30% etylenglykol och 50% PBS) och lagra proverna vid -20 °C.
      OBS: Dessa sektioner lagrade i små rör (1,5 ml) kan spara fysiskt utrymme i frysen, och sektionernas integritet kan bevaras i flera månader.

3. Fritt flytande WFA-färgning och anti-AVP-immunstaining

1. Placera en cellsil i en brunn på en 6-väl cellodlingsplatta fylld med PBS och använd en pensel för att överföra en serie hjärnsektioner till cellsilen. Skölj sektionerna i PBS genom att överföra cellsilen till en annan välfylld med PBS. Skölj i 6 x 10 min på en shaker för sektioner lagrade i kryoprotektörsbuffert och 3 x 10 min för nyskurna sektioner.
   OBS: Alla tvättprocedurer utförs i en 6-väl cellodlingsplatta med en cellsil inuti varje brunn (se materialtabellen). Varje sil håller hjärnsektionerna av intresse från varje mus. För att spara reagenser utförs alla inkubationsförfaranden som beskrivs nedan i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör. Mellan tvätt- och inkubationsprocedurer, använd en pensel för att överföra hjärnsektionerna mellan varje cellsil och varje rör. För tvättning med PBS är 12 ml tillräckligt för varje brunn.
2. Förbered 1 mL biotinmärkt WFA-lösning (1:1 000) i PBT (2,5 ml Triton X-100 upplöst i 1 000 ml PBS) buffert i 1,5 ml rör. Överför hjärnsektioner från cellsilen till röret och inkubera vid rumstemperatur på en gungplattform ~ 50 rpm över natten.
3. Skölj hjärnsektionerna med PBS i 3 x 10 min enligt beskrivningen i 3.1.
4. Förbered 1 mL streptavidin-Dylight 488 (1:500) lösning i PBT i ett 1,5 ml-rör. Överför hjärnsektioner i röret och inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar på en gungplattform vid ~ 50 rpm.
   OBS: Täck plattan med folie för att undvika ljusexponering från detta steg framåt.
5. Skölj hjärnsektionerna med PBS i 3 x 10 min. Inkubera hjärnsektionerna i blockerande buffert (3% normalt åsneserum utspädd i PBT) i 2 h vid rumstemperatur.
   OBS: Valet av blockerande serum bestäms av den art från vilken den sekundära antikroppen genereras. t.ex. om den sekundära antikroppen kommer från get, bör normalt getserum användas.
6. Inkubera hjärnsektionerna i primär antikropp (kanin anti-AVP, 1:500) vid rumstemperatur på en gungplattform vid ~ 50 rpm över natten.
   OBS: Förbered både primära och sekundära antikroppar i blockeringsbufferten. Koncentrationen, inkubationstiden och inkubationstemperaturen måste optimeras i pilotstudier.
7. Skölj hjärnsektionerna med PBS i 3 x 10 min. Inkubera hjärnsektionerna i sekundär antikropp (Alexa Flour 594 åsne antikanin IgG (H +L), 1:500) vid rumstemperatur i 2 timmar på en gungplattform vid ~50 rpm. Skölj hjärnsektionerna med PBS i 3 x 10 min.

4. Montering

1. Fyll två Petri-rätter (en diameter på 150 mm) med 100 ml 1x PBS vardera. Överför alla hjärnsektioner från en sil till den första skålen och justera hjärnsektionerna i neuroanatomisk ordning från kaudala till rostral.
   OBS: För att undvika att blanda sektioner från olika djur, montera en serie hjärnsektioner från ett djur i taget.
2. När alla hjärnsektioner är justerade i den första skålen, sänk ner en bild i den andra skålen med ena änden något lutad med ett stativ (se figur 1 och figur 2). Använd en fin pensel för att försiktigt placera en hjärnsektion precis under luftbuffertgränssnittet på den lutande bilden. Upprepa samma procedur med en annan hjärnsektion och montera den sida vid sida med den första sektionen.
3. Använd en överföringspipeett för att långsamt och försiktigt ta bort bufferten för att sänka dess nivå tills båda hjärnsektionerna är helt ovanför luftbuffertgränssnittet.
   OBS: Var noga med att minimera störningarna på buffertytan, annars kan hjärnsektionerna flyta iväg. När den är torr kommer denna rad av hjärnsektioner att hålla fast vid glidningen ordentligt. Om det behövs, justera försiktigt sektionerna på bilden för att säkerställa att det inte finns några rynkor eller veck i vävnaden när sektionerna fortfarande är våta.
4. Upprepa den här processen tills bildens nederkant har nåtts. Fortsätt att upprepa tills alla sektioner är monterade på bilderna.

5. Täckslirning

1. När alla sektioner har torkat (1-24 h vid rumstemperatur), placera 80-100 μL anti-blekningsmonteringsmedium med DAPI (se materialtabellen) på bilden och applicera försiktigt ett glastäcke för att täcka proverna.
   OBS: Applicera glasskyddet försiktigt och långsamt för att undvika bubblor.
2. Placera bilderna i en bildruta för mikroskop (se materialtabellen) och förvara dem vid 4 °C.
   OBS: Avbilda alla sektioner inom 1-3 dagar för att undvika blekning av fluorescens och utveckling av autofluorescens.

6. Bildbehandling

1. Slå på skannern och datorn (se Materialförteckning). Placera bilderna i skjuthållaren med laddningsenheten och sätt in hållaren i skannern.
   OBS: Skannern möjliggör skanning av flera kanaler (t.ex. 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), gröna och röda kanaler) samtidigt. Skannern skannar endast bilder med en 20x förstoring, och ett traditionellt fluorescerande mikroskop (se Materialtabell) kan användas när en högre förstoring (t.ex. 40x) behövs.
2. Öppna programvaran för skannern (se tabellen över material). Välj lämplig lagringsplats och skanningsprofil.
3. Starta förhandsgranskningssökningen genom att klicka på knappen Starta förhandsgranskningssökning . Efter förhandsgransknings genomsökningen öppnar du vävnads identifierings guiden och cirklar in de regioner som är av intresse för avbildning.
4. Klicka på knappen Starta skanning när du har valt områden för avbildning. Vänta tills maskinen är klar med skanningen. Kontrollera resultatfilen och exportera bilderna.
   OBS: Om profilen är olämplig för bilden, justera genom att fokusera om och ändra exponeringstiden eller ljusstyrkan för att anpassa profilen till vävnaderna. Mer teknisk information finns i anvisningarna för skannern (Materialtabell).

Representative Results

Flödesschemat för detta protokoll illustreras kortfattat i figur 1. Detta laboratorium kryosektion förfarande visas i figur 2A, där 5 hjärnprover var sektionerade samtidigt. Monteringen av hjärnsektioner visas i figur 2B, och en fullt monterad bild med hjärnsektioner illustreras i figur 2C. I figur 3 observerades representativa fluorescens immunohistokemi bilder av en mus hjärnan avsnitt med co-staining av WFA och AVP vid lägre och högre förstoring vid Bregma -0,82 mm. AVP signaler observerades i paraventricular kärnan och supraoptic kärnan. WFA signaler observerades i bukhinnan området i främre hypotalamus och reticular kärnan.

Figur 1: Flödesschema över fluorescensimmunistokemi med mushjärnor. Efter fullständig anestesi perfunderas en mus med saltlösning och sedan 10% NBF. Hjärnan avlägsnas försiktigt och skärs i sektioner efter fixering och uttorkning. Sektionerna inkuberades med WFA följt av Streptavidin-Dylight 488 efter tre tvättar med PBS. Hjärnsektionerna blockerades och inkuberades sedan med en primär anti-AVP-antikropp. Sedan tvättades sektionerna 3 gånger med PBS följt av inkubation med den sekundära antikroppen, Alexa Flour 594 åsne anti-kanin IgG (H +L). Hjärnsektionerna monterades på diabilder och täckglas placerade på rutschkanorna med antifading monteringsmedium med DAPI före avbildning. Förkortningar: NBF = neutral buffrad formalin; WFA = Wisteria florbunda agglutinin; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; AVP = arginin vasopressin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 2: Bilder som illustrerar praktisk kryosektion och montering i laboratoriet. (A) Anla en bas ovanpå plattan med 30 % sackaros för att hålla alla prover horisontellt, skära vävnaderna i sektioner (25 μm/sektion) och samla sektionerna i en 48-brunnscellsodlingsplatta fylld med fosfatbuffrad saltlösning. (B) Doppa en rutschkana i skålen med ena änden något lutad med ett stativ. Placera varje rad med sektioner under luftbuffertgränssnittet och sänk bufferten för att få ut sektionerna ur bufferten tills bildens nederkant. Den vita linjen anger gränssnittet mellan buffert och luft. (C) En fullt monterad rutschkana med hjärnsektioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3: Ett exempel på dubbel immunofluorescensfärgning. (A-D) Mikroskopiska bilder som visar fördelningen av WFA (röd, A), AVP (grön, B), DAPI (blå, C) och sammanslagna (D) i koronalmushjärnsektioner vid Bregma -0,82 mm. Skalningsstaplar = 200 μm. (E-H) Högre förstoring mikroskopiska bilder av de vita rutorna i A-D. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: 3V = tredje ventrikeln; PeFAH = perifornical område av den främre hypotalamus; PVH = paraventrikulär kärna; RT = reticular kärna; SON = supraoptisk kärna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Detta protokoll ger en etablerad metod för neuroanatomical studier av mushjärnan, inklusive perfusion, vävnad avsnitt, fritt flytande immunostaining, vävnad montering och imaging. Några viktiga detaljer som är viktiga för konsekventa och tillförlitliga resultat måste dock optimeras.

Kvaliteten på perfusion är avgörande för framgångsrik färgning. Färgning resultat kan påverkas om blod finns kvar i hjärnan, med tanke på att blodkroppar (t.ex. röda blodkroppar) kan generera en artificiell "positiv" ^färgning10. Vi drar slutsatsen närvaron av en brungrå lever för att indikera en hög kvalitet på perfusion, vilket vanligtvis resulterar i blodfria hjärnor. Den automatiserade perfusionspumpen som används i detta protokoll hjälper till att perfusera ett djur framgångsrikt inom en kort period. Otillräcklig fixering kommer att generera mjuka och bräckliga hjärnsektioner i de efterföljande procedurerna, medan överfixering kommer att minska känsligheten hos antigenreaktioner på grund av den förbättrade formaldehydkorsningen av proteiner. Olika villkor testades, och över natten fixering vid 4 °C var tillräckligt för post-fixering av mushjärnor. Förutom 10% NBF som används i detta protokoll som fixativ buffert, har 4% (w/v) av nyberedd paraformaldehyd (PFA) i PBS också använts i stor utsträckning för vävnadsfixering11.

När det gäller kryosektion måste tjockleken på sektioner bestämmas beroende på de specifika behoven. Till exempel kräver RNAscope-studier en tjocklek av 14 μm istället för 25 μm, som vanligtvis används vid fritt flytande färgning. Samtidigt kräver RNAscope-studier att alla procedurer utförs i RNAase-fria lösningar för att bevara integriteten hos mål mRNAs. Vissa forskare använder också en sektiontjocklek på 30-40 μm för en mängd olika färgningsförfaranden. Konventionell kryosektion (dvs. optimal skärtemperatur (O.C.T.) sammansatta prover) möjliggör mycket tunnare (t.ex. 10 μm) hjärnsektioner som kan vara avgörande för intracellulära strukturer eller andra tillämpningar. Cryosectioning-strategin som presenteras här involverar inte nödvändigtvis O.C.T. sammansatt inbäddning av hjärnprover och möjliggör 14-40 μm sektioner. Det kan inte finnas någon signifikant skillnad för 3,3-diaminobenzidin (DAB) färgning med 25 eller 40 μm tjocka hjärnsektioner. Tunnare sektioner erbjuder dock fluorescensbilder av bättre kvalitet.

Fördelen med den strategi som presenteras här är att flera hjärnprover (upp till 5 hjärnor) kan skäras på en gång. Begränsningen av denna metod är dock att hjärnprover måste skäras inom 1 vecka efter uttorkning eftersom nedsänkning i 30% sackaros för länge är mer benägna att orsaka proteinnedbrytning och andra problem. För att undvika detta potentiella problem kan dessa hjärnsektioner överföras till kryoprotektiva bufferten och lagras vid -20 °C. För fritt flytande färgning bör inkubationstiden och koncentrationen av både primära och sekundära antikroppar optimeras i pilotstudier. I allmänhet är inkubation över natten vid 4 °C eller rumstemperatur med mild skakning lämplig för de flesta primära antikroppar, om inte annat instrueras av tillverkarna. För sekundära antikroppar fungerar inkubation vid rumstemperatur i 1-3 h bra i de flesta situationer. Dessa detaljer måste dock optimeras för olika omständigheter. Till exempel, för c-fos färgning, inkuberar vi vanligtvis hjärnsektionerna med en koncentration av 1:1,000 över natten vid 4 °C för immunofluorescensfärgning. Men med samma antikropp för c-fos DAB färgning föredrar vi att inkubera hjärnsektioner med en koncentration av 1:5,000 för 48 h vid 4 °C.

En cocktail av primära antikroppar och sekundära antikroppar kan användas för dubbelfärgning för att påskynda proceduren. Mer specifikt blandas två olika primära antikroppar från olika arter (t.ex. en är från kanin, den andra är från marsvin, kyckling eller mus) före inkubation, liksom motsvarande sekundära antikroppar. Valet av sekundär antikropp är beroende av den primära antikroppen. Om den primära antikroppen kommer från kanin måste den sekundära antikroppen vara antikanin, till exempel åsne antikanin eller getanti-kanin. Valet av blockerande serum beror på den sekundära antikroppen, till exempel kommer normalt åsneserum att användas om den sekundära antikroppen kommer från åsna. Antigen hämtning föreslås om immunostaining fortfarande inte fungerar även om alla riktlinjer har följts strikt.

Montering och täckmantel av hjärnsektioner måste utföras på ett mycket känsligt sätt. Hela processen kräver inga rynkor, veck eller luftbubblor. Det kommer att ta flera försök för att bestämma den optimala exponeringstiden för avbildning. Vi rekommenderar samma exponeringstid för samma antikropp i olika sektioner, vilket är viktigt för att jämföra signalintensiteterna mellan olika djur eller grupper. Det är rimligt att exponeringstiden kanske inte är densamma för olika antikroppar, inte ens i samma avsnitt. Exponeringstiden för DAPI kan till exempel vara kortare än c-fos-signalen i de flesta fall.

Några procedurer som presenteras i protokollet är användbara för att förbättra både tillförlitlighet och effektivitet under hela processen. 1) Att använda en automatiserad perfusionspump för perfusion kan avsevärt förkorta perfusionstiden och avsevärt förbättra vävnadskvaliteten. 2) Denna kryosektionsstrategi gör det möjligt att skära flera hjärnprover samtidigt, vilket är mycket effektivare än konventionell praxis. Denna metod är också lätt för nya forskare att lära sig och behärska. 3) För fritt flytande färgning, eftersom hjärnprover är färgade i suspension, kan antikroppar tränga in i sektionerna från båda sidor. Vi optimerade inkubationsstrategin genom att placera alla sektioner från ett prov / serie i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör för primära och sekundära antikroppar, vilket sparar antikroppar, särskilt när vi behöver färga hjärnprover i bulk. En annan fördel med det fritt flytande tillvägagångssättet är att det kan modifieras och tillämpas på andra histokemiska färgningsmetoder (t.ex. kromogen IHC, hematoxylin och eosin, cresylviolett) förutom immunofluorescensfärgning12.

En begränsning av fritt flytande färgning är dock att mycket tunna sektioner kan vara svåra att hantera. En färgningsmetod på bilden kan övervägas om endast ett fåtal sektioner behöver samlas in och färgas omedelbart, vilket ofta är fallet vid klinisk patologi. Vi testade också färgningsmetoden på bilden med hjälp av hjärnsektioner som genererats från detta protokoll, och det fungerade bra. För att göra detta, montera hjärnsektionerna på diabilder, vänta på att sektionerna torkar och följ ett traditionellt fruset avsnitt på bilden färgningsprotokoll. 4) Montering av fritt flytande sektioner på bilderna kan vara tråkigt för vissa forskare, särskilt för nybörjare. Vi använder en fin pensel för att försiktigt koaxera sektioner på diabilden vid luftbuffertgränssnittet och sedan använda en överföringspipett för att försiktigt ta bort bufferten för att sänka luftbuffertgränssnittet när monteringen fortskrider från toppen till botten av bilden. Även om det är tidskrävande är denna strategi vänlig mot nybörjare. Erfarna experimentörer kan montera alla hjärnsektioner på bilderna i PBS på en gång och bara ta bort bufferten för att få ut bilden efter att den sista sektionen har monterats. 5) Slutligen använder vi en skanner för avbildning, vilket är effektivare än fluorescensmikroskopi, särskilt när det finns ett stort antal bilder för avbildning. Skannern gör det möjligt att skanna upp till 12 bilder i en batch med en 20x förstoring. Alternativt kan standardfluorescensmikroskopi användas under vissa omständigheter, till exempel när ett specifikt kluster av nervceller i hjärnan måste visas upp med en högre förstoring (t.ex. 40x eller till och med 60x)^13,14.

Sammanfattningsvis presenterar detta dokument en etablerad metodik för histologiska studier av mushjärnor som har visat sig vara reproducerbara, tillförlitliga och effektiva. Protokollet kommer att bidra till att generera optimala och konsekventa histologiska resultat bland olika forskare och laboratorier och fungera som en referens för nybörjare att lära sig denna teknik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software