Summary
Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.
Abstract
La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica rutinaria comúnmente utilizada en neurociencia para investigar los mecanismos centrales subyacentes a la regulación del metabolismo energético y otros procesos neurobiológicos. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de histología cerebral pueden variar entre los laboratorios. Para cada experimento de tinción, es necesario optimizar los procedimientos clave en función de las diferencias en especies, tejidos, proteínas objetivo y las condiciones de trabajo de los reactivos. Este documento demuestra un flujo de trabajo confiable en detalle, que incluye perfusión intraaórtica, seccionamiento cerebral, inmunotinción flotante, montaje de tejidos e imágenes, que pueden ser seguidos fácilmente por investigadores en este campo.
También se discute cómo modificar estos procedimientos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Para ilustrar la fiabilidad y eficiencia de este protocolo, las redes perineuronales se tiñeron con aglutinina Wisteria florbunda marcada con biotina (WFA) y arginina vasopresina (AVP) con un anticuerpo anti-AVP en el cerebro del ratón. Finalmente, se han abordado los detalles críticos para todo el procedimiento, y las ventajas de este protocolo en comparación con las de otros protocolos. En conjunto, este artículo presenta un protocolo optimizado para la inmunotinción flotante del tejido cerebral del ratón. Seguir este protocolo hace que este proceso sea más fácil para los científicos junior y senior para mejorar la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los estudios de inmunotinción.
Introduction
La prevalencia de obesidad y comorbilidades asociadas ha alcanzado niveles epidémicos, causando una tremenda carga socioeconómica1,2. Se han desarrollado diversos modelos de ratón para comprender mejor los procesos biológicos responsables de la obesidad3,4. Debido a que los mecanismos centrales son importantes para la regulación de la homeostasis energética en estos modelos animales, los estudios neuroanatómicos de cerebros de ratón se han convertido en una técnica necesaria en este campo. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de las técnicas de histología cerebral varían considerablemente entre los laboratorios e incluso los investigadores dentro del mismo laboratorio por diversas razones (por ejemplo, anticuerpos, tejidos, tratamientos, especies, objetivos de investigación). Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo general para los estudios histológicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Mientras tanto, los principiantes pueden aprender, dominar y ajustar rápidamente este protocolo para satisfacer sus necesidades individuales.
La tinción inmunohistoquímica es un método establecido que se ha utilizado ampliamente para visualizar tipos específicos de células, ARNm y proteínas en una variedad de tejidos (por ejemplo, tejido cerebral y periférico)5,6. Más específicamente, un antígeno de interés puede ser marcado por un anticuerpo primario específico y un anticuerpo secundario correspondiente vinculado a una enzima (por ejemplo, inmunohistoquímica cromogénica) o un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína)6. Como ejemplo de la utilidad de estas técnicas, β-endorfina [un péptido codificado por pro-opiomelanocortina (POMC)] y c-fos (un marcador de actividad neuronal) se tiñeron en el núcleo arqueado. Se demostró que la deleción de triptófano hidroxilasa 2 (una enzima integral a la síntesis de serotonina) en el núcleo dorsal del rafe disminuye la expresión de c-fos en las neuronas POMC en el núcleo arqueado7. Además, se mapeó la distribución del ARNm del receptor de vitamina D en el cerebro del ratón mediante hibridación in situ (RNAscope)8. Este artículo presenta un método confiable y eficiente con un flujo de trabajo paso a paso para la inmunotinción flotante, con el objetivo de mejorar la calidad y la reproducibilidad de los estudios histológicos del cerebro del ratón.
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Protocol
En el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos (8-16 semanas de edad). El cuidado de todos los animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Baylor College of Medicine.
1. Perfusión
NOTA: Los pasos 1.1 a 1.6 se realizan en una campana extractora de humos.
- Anestesia
- Vierta 5 ml de isoflurano (consulte la Tabla de materiales) sobre una toalla de papel colocada en la parte inferior de un desecador. Introduzca el ratón en la barrera agujereada dentro del desecador y espere hasta que los signos de respiración hayan desaparecido.
NOTA: Sin respiración, el ratón todavía tiene latidos cardíacos durante un corto período de tiempo, y se perfundirá antes de la desaparición de los latidos del corazón. - Antes de continuar, confirme que no hay reflejo de un pellizco en el dedo del pie.
- Fije el ratón a una tabla de espuma pasando un alfiler a través de cada pie. Asegúrese de que la tabla de espuma se coloque en una bandeja para recoger el derrame de líquido.
- Vierta 5 ml de isoflurano (consulte la Tabla de materiales) sobre una toalla de papel colocada en la parte inferior de un desecador. Introduzca el ratón en la barrera agujereada dentro del desecador y espere hasta que los signos de respiración hayan desaparecido.
- Exponiendo el corazón
- Haga una incisión superficial longitudinal a lo largo de la línea media sobre el tórax y el abdomen, luego mueva la piel a un lado para exponer la pared muscular del tórax y el abdomen. A continuación, haga una incisión en la capa muscular para exponer el hígado y el intestino. Finalmente, corte la caja torácica con tijeras para abrir el tórax y exponer el corazón y los pulmones. Use pinzas hemostáticas para tirar de la caja torácica a un lado para ensanchar el área de trabajo.
- Recolección de sangre terminal (opcional)
- Inserte una jeringa de 1 ml (consulte la Tabla de materiales) cuidadosamente en la aurícula derecha del corazón hasta que la punta esté completamente incrustada. Mantenga la jeringa firme y extraiga sangre lentamente hasta que se alcance el volumen deseado.
NOTA: Tenga cuidado de no penetrar más allá de la aurícula derecha; La recolección de 300-400 μL de sangre es alcanzable por ratón adulto. Se pueden usar aditivos como un acelerador de coágulos o anticoagulante, dependiendo del propósito de la recolección de sangre.
- Inserte una jeringa de 1 ml (consulte la Tabla de materiales) cuidadosamente en la aurícula derecha del corazón hasta que la punta esté completamente incrustada. Mantenga la jeringa firme y extraiga sangre lentamente hasta que se alcance el volumen deseado.
- Colocación de la cánula de perfusión
- Para los principiantes, corte un pequeño orificio (<1 mm) en el ventrículo izquierdo del corazón con tijeras e inserte una cánula roma (aguja de 18 G para ratones jóvenes y aguja de 21 G para ratones envejecidos) a través del ventrículo izquierdo en la aorta ascendente. Alternativamente, para los experimentadores experimentados, penetre el ventrículo cardíaco izquierdo con una cánula roma directamente e insértela en la aorta ascendente con cuidado.
- Coloque pasadores alrededor de la conjunción de la cánula y el tubo acoplado en la tabla de espuma para evitar el movimiento durante la perfusión. Alternativamente, use pinzas hemostáticas para fijar la cánula en su lugar. Proceda a cortar la aurícula derecha para permitir la salida de sangre de la circulación.
NOTA: La cánula de perfusión y el tubo acoplado están conectados a la bomba de perfusión.
- Perfusión con solución salina
- Encienda el interruptor de presión salina y perfunda al ratón transcárdicamente con 40-60 ml de solución salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observe de cerca la salida de la aurícula derecha y el color del hígado.
NOTA: Se utiliza una bomba de perfusión automatizada (consulte la Tabla de materiales) para enjuagar la sangre en 1-2 minutos. Como el rango de presión de la bomba es de 1-300 mmHg, la velocidad se puede ajustar en consecuencia. Si la solución salina tiene fugas de la nariz y / o el pulmón está inflado, disminuya la presión y ajuste la cánula. Una vez que el flujo de salida ya no contiene sangre, el cerebro está lo suficientemente enrojecido con solución salina. Mientras tanto, el hígado está desprovisto de sangre y se vuelve de color gris parduzco.
- Encienda el interruptor de presión salina y perfunda al ratón transcárdicamente con 40-60 ml de solución salina (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Observe de cerca la salida de la aurícula derecha y el color del hígado.
- Perfusión con formalina
- Apague el interruptor de presión salina y encienda el interruptor de presión de formalina para perfundir el ratón con 40 ml de formalina tamponada neutra al 10% (10% NBF: 25 ° C, pH 6.8-7.2, consulte la Tabla de materiales). Observe las extremidades del animal en busca de evidencia de temblores.
NOTA: El movimiento de la cola también se puede observar después de la infusión de 10% NBF. PRECAUCIÓN: Como nbF es peligroso, se sugiere que los investigadores usen equipo de protección personal (por ejemplo, respirador apropiado, protector facial) durante todo el procedimiento.
- Apague el interruptor de presión salina y encienda el interruptor de presión de formalina para perfundir el ratón con 40 ml de formalina tamponada neutra al 10% (10% NBF: 25 ° C, pH 6.8-7.2, consulte la Tabla de materiales). Observe las extremidades del animal en busca de evidencia de temblores.
- Aislamiento cerebral9
- Use tijeras para quitar la cabeza. Haga una incisión en la línea media a lo largo del tegumento para exponer el cráneo. Recorte la piel y la unión muscular con tijeras.
- Haga un corte en la cresta orbital y luego coloque el extremo afilado de las tijeras del iris en el foramen magnum. Avance las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo, manteniendo la presión hacia arriba para evitar daños en el cerebro. Retire los huesos parietales/frontales y las meninges con cuidado. Finalmente, retire el cerebro del cráneo abierto suavemente.
- Post-fijación
- Coloque el cerebro en un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15% para la fijación durante la noche a 4 ° C.
NOTA: Para preparar 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15%, combine 5 ml de NBF al 10% y 5 ml de sacarosa al 30% (p/v, disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS), consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que el volumen del búfer fijador sea al menos 10 veces mayor que la propia muestra. Inicialmente, el cerebro flotará en el amortiguador y se hundirá hasta el fondo después de la fijación nocturna.
- Coloque el cerebro en un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de NBF al 5% y sacarosa al 15% para la fijación durante la noche a 4 ° C.
- Deshidratación
- Transfiera la muestra de cerebro a un tubo de 15 ml lleno de 10 ml de sacarosa al 30% para la deshidratación a 4 ° C hasta que se hunda.
2. Crioseccionación (secciones coronales)
- Preparación
- Coloque hielo seco encima de la placa de ajuste de altura de un microtomo deslizante y espere hasta que la escarcha blanca sea visible. Extienda cuidadosamente 5 ml de sacarosa al 30% en la parte superior de la placa para formar una capa de una base sólida después de que la solución de sacarosa esté completamente congelada. Coloque todas las muestras de cerebro (hasta 5 muestras de cerebro en un lote) horizontalmente en una línea en la parte superior de la sacarosa, y luego agregue 0.5 ml de sacarosa al 30% a la parte inferior de cada cerebro.
NOTA: El cerebro se adherirá inmediatamente a la base de sacarosa congelada y se congelará gradualmente de abajo hacia arriba. Coloque sacarosa adicional alrededor de la porción montada del cerebro para formar una base más resistente para cortar.
- Coloque hielo seco encima de la placa de ajuste de altura de un microtomo deslizante y espere hasta que la escarcha blanca sea visible. Extienda cuidadosamente 5 ml de sacarosa al 30% en la parte superior de la placa para formar una capa de una base sólida después de que la solución de sacarosa esté completamente congelada. Coloque todas las muestras de cerebro (hasta 5 muestras de cerebro en un lote) horizontalmente en una línea en la parte superior de la sacarosa, y luego agregue 0.5 ml de sacarosa al 30% a la parte inferior de cada cerebro.
- Seccionamiento
- Después de 5-10 minutos de congelación, cuando el cerebro se haya vuelto duro y blanco, recorte el cerebro hasta que se alcance la capa / región deseada.
NOTA: Ajuste la cantidad de hielo seco en la placa para controlar la temperatura. La temperatura es demasiado baja cuando aparecen cristales de hielo en la superficie del cerebro. La temperatura es demasiado alta cuando el cerebro se vuelve blando y ya no es blanco. - Cambie del modo Trim al modo Feed y sección de tejido cerebral a 25 μm de espesor. Prepare una placa de 48 pocillos llena de 1x PBS y marque cinco pocillos para un cerebro de ratón. Use un pincel para recoger cada sección de un mouse y colóquela en un pozo. Recoge la sección posterior del mismo ratón y colócala en el 2º pozo.
- Repita 2.2.2 hasta que se alcance el 5º pozo, colocando las secciones 6-10 en el 1º-5º pozo y así sucesivamente. Repita el mismo procedimiento para el resto de los cerebros simultáneamente. Repita hasta que todas las secciones de un ratón se recojan en los 5 pocillos en orden anatómico.
NOTA: Después de este procedimiento, las secciones cerebrales de cada ratón se alicitan en 5 series, que se pueden utilizar para hasta 5 estudios histológicos diferentes.
- Después de 5-10 minutos de congelación, cuando el cerebro se haya vuelto duro y blanco, recorte el cerebro hasta que se alcance la capa / región deseada.
- Almacenamiento
- Use un pincel para transferir las secciones de cada pozo a un microtubo de 1,5 ml lleno de tampón crioprotector (20% de glicerol, 30% de etilenglicol y 50% de PBS), y almacene las muestras a -20 °C.
NOTA: Estas secciones almacenadas en tubos pequeños (1,5 ml) pueden ahorrar espacio físico en el congelador, y la integridad de las secciones se puede conservar durante varios meses.
- Use un pincel para transferir las secciones de cada pozo a un microtubo de 1,5 ml lleno de tampón crioprotector (20% de glicerol, 30% de etilenglicol y 50% de PBS), y almacene las muestras a -20 °C.
3. Tinción WFA flotante e inmunotinción anti-AVP
- Coloque un colador celular en un pozo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos llena de PBS, y use un pincel para transferir una serie de secciones cerebrales al colador celular. Enjuague las secciones en PBS transfiriendo el colador celular a otro pozo lleno de PBS. Enjuague durante 6 x 10 min en un agitador para secciones almacenadas en tampón crioprotector y 3 x 10 min para secciones recién cortadas.
NOTA: Todos los procedimientos de lavado se realizan en una placa de cultivo celular de 6 pocillos con un colador celular dentro de cada pozo (ver la Tabla de Materiales). Cada colador contiene las secciones cerebrales de interés de cada ratón. Para ahorrar reactivos, todos los procedimientos de incubación descritos a continuación se realizan en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Entre los procedimientos de lavado e incubación, use un pincel para transferir las secciones cerebrales entre cada colador celular y cada tubo. Para el lavado con PBS, 12 ml es adecuado para cada pozo. - Preparar 1 ml de solución WFA (1:1.000) marcada con biotina en tampón PBT (2,5 ml de Tritón X-100 disuelto en 1.000 ml de PBS) en tubo de 1,5 ml. Transfiera secciones cerebrales del colador celular al tubo e incube a temperatura ambiente en una plataforma basculante ~ 50 rpm durante la noche.
- Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 minutos como se describe en 3.1.
- Preparar 1 ml de solución de estreptavidina-Dylight 488 (1:500) en PBT en un tubo de 1,5 ml. Transfiera secciones cerebrales al tubo e incube a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma basculante a ~ 50 rpm.
NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz de este paso adelante. - Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min. Incubar las secciones cerebrales en tampón de bloqueo (3% de suero normal de burro diluido en PBT) durante 2 h a temperatura ambiente.
NOTA: La elección del suero bloqueador está determinada por la especie a partir de la cual se genera el anticuerpo secundario. por ejemplo, si el anticuerpo secundario es de cabra, se debe usar suero de cabra normal. - Incubar las secciones cerebrales en anticuerpos primarios (conejo anti-AVP, 1:500) a temperatura ambiente en una plataforma basculante a ~50 rpm durante la noche.
NOTA: Prepare anticuerpos primarios y secundarios en el tampón de bloqueo. La concentración, la duración de la incubación y la temperatura de incubación deben optimizarse en estudios piloto. - Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min. Incubar las secciones cerebrales en anticuerpos secundarios (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma basculante a ~50 rpm. Enjuague las secciones cerebrales con PBS durante 3 x 10 min.
4. Montaje
- Llene dos placas de Petri (un diámetro de 150 mm) con 100 ml de 1x PBS cada una. Transfiera todas las secciones cerebrales de un colador al primer plato y alinee las secciones cerebrales en orden neuroanatómico de caudal a rostral.
NOTA: Para evitar mezclar secciones de diferentes animales, monte una serie de secciones cerebrales de un animal a la vez. - Después de que todas las secciones del cerebro estén alineadas en el primer plato, sumerja una diapositiva en el segundo plato con un extremo ligeramente inclinado con un soporte (ver Figura 1 y Figura 2). Use un pincel fino para colocar suavemente una sección cerebral justo debajo de la interfaz de búfer de aire en la diapositiva inclinada. Repita el mismo procedimiento con otra sección del cerebro y móntelo al lado de la primera sección.
- Use una pipeta de transferencia para quitar lenta y suavemente el búfer para bajar su nivel hasta que ambas secciones del cerebro estén completamente por encima de la interfaz del búfer de aire.
NOTA: Tenga cuidado de minimizar la perturbación de la superficie del amortiguador, o las secciones del cerebro pueden flotar. Cuando esté seca, esta fila de secciones cerebrales se adherirá firmemente a la diapositiva. Si es necesario, ajuste suavemente las secciones de la diapositiva para asegurarse de que no haya arrugas o pliegues en el tejido cuando las secciones aún estén húmedas. - Repita este proceso hasta que se alcance la parte inferior de la diapositiva. Continúe repitiendo hasta que todas las secciones estén montadas en la(s) diapositiva(s).
5. Coverslipping
- Después de que todas las secciones se hayan secado (1-24 h a temperatura ambiente), coloque 80-100 μL de medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI (consulte la Tabla de materiales) en la diapositiva y aplique suavemente una cubierta de vidrio para cubrir las muestras.
NOTA: Aplique la cubierta de vidrio con cuidado y lentamente para evitar burbujas. - Coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos de microscopio (consulte la Tabla de materiales) y guárdelos a 4 °C.
NOTA: Tome imágenes de todas las secciones dentro de 1-3 días para evitar el desvanecimiento de la fluorescencia y el desarrollo de la autofluorescencia.
6. Imágenes
- Encienda el escáner y el ordenador (consulte la Tabla de materiales). Coloque las diapositivas en el soporte de la diapositiva con el dispositivo de carga e inserte el soporte en el escáner.
NOTA: El escáner permite escanear múltiples canales (por ejemplo, canales 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), verde y rojo) simultáneamente. El escáner escanea diapositivas solo con un aumento de 20x, y se puede usar un microscopio fluorescente tradicional (consulte la Tabla de materiales) cuando se necesita un aumento más alto (por ejemplo, 40x). - Abra el software del escáner (consulte la Tabla de materiales). Elija la ubicación de almacenamiento y el perfil de escaneo adecuados.
- Inicie el análisis de vista previa haciendo clic en el botón Iniciar análisis de vista previa . Después de la exploración preliminar, abra el asistente de detección de tejidos y rodee las regiones de interés para la obtención de imágenes.
- Haga clic en el botón Iniciar escaneo después de elegir las regiones para la obtención de imágenes. Espere a que la máquina termine de escanear. Compruebe el archivo de resultados y exporte las imágenes.
NOTA: Si el perfil no es adecuado para la diapositiva, ajuste reenfocando y cambiando el tiempo de exposición o la intensidad de la luz para adaptar el perfil a los tejidos. Consulte las instrucciones del escáner para obtener más detalles técnicos (Tabla de materiales).
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Representative Results
El diagrama de flujo de este protocolo se ilustra brevemente en la Figura 1. El procedimiento de crioseccionamiento de este laboratorio se demuestra en la Figura 2A, en la que se seccionaron 5 muestras de cerebro simultáneamente. El montaje de las secciones cerebrales se muestra en la Figura 2B, y una diapositiva completamente montada con secciones cerebrales se ilustra en la Figura 2C. En la Figura 3, imágenes representativas de inmunohistoquímica de fluorescencia de una sección cerebral de ratón con tinción conjunta de WFA y AVP a menor y mayor aumento en Bregma -0,82 mm. Se observaron señales AVP en el núcleo paraventricular y el núcleo supraóptico. Se observaron señales WFA en el área perifornical del hipotálamo anterior y el núcleo reticular.
Figura 1: Diagrama de flujo de inmunohistoquímica de fluorescencia con cerebros de ratón. Después de la anestesia completa, un ratón se perfunde con solución salina y luego 10% NBF. El cerebro se extrae cuidadosamente y se corta en secciones después de la fijación y la deshidratación. Las secciones se incubaron con WFA seguido de Streptavidin-Dylight 488 después de tres lavados con PBS. Las secciones cerebrales se bloquearon y luego se incubaron con un anticuerpo anti-AVP primario. Luego, las secciones se lavaron 3 veces con PBS seguido de incubación con el anticuerpo secundario, Alexa Flour 594 burro anti-conejo IgG (H + L). Las secciones cerebrales se montaron en diapositivas y los coverslips se colocaron en las diapositivas con medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI antes de la toma de imágenes. Abreviaturas: NBF = formalina tamponada neutra; WFA = Wisteria florbunda aglutinina; PBS = solución salina tamponada con fosfato; AVP = arginina vasopresina; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fotos que ilustran la crioseccionación práctica y el montaje en el laboratorio. (A) Construir una base en la parte superior de la placa con sacarosa al 30% para mantener todas las muestras horizontalmente, cortar los tejidos en secciones (25 μm / sección) y recoger las secciones en una placa de cultivo celular de 48 pocillos llena de solución salina tamponada con fosfato. (B) Sumergir un tobogán en el plato con un extremo ligeramente inclinado con un soporte. Coloque cada fila de secciones debajo de la interfaz de búfer de aire y baje el búfer para sacar las secciones del búfer hasta la parte inferior de la diapositiva. La línea blanca indica la interfaz de búfer y aire. (C) Una diapositiva completamente montada con secciones cerebrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un ejemplo de tinción de doble inmunofluorescencia. (A-D) Imágenes microscópicas que muestran la distribución de WFA (rojo, A), AVP (verde, B), DAPI (azul, C) y fusionado (D) en secciones coronales del cerebro del ratón en Bregma -0.82 mm. Barras de escala = 200 μm. (E-H) Imágenes microscópicas de mayor aumento de las cajas blancas en A-D, respectivamente. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: 3V = tercer ventrículo; PeFAH = área perifornical del hipotálamo anterior; PVH = núcleo paraventricular; RT = núcleo reticular; SON = núcleo supraóptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona un método establecido para estudios neuroanatómicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento de tejido, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Sin embargo, se deben optimizar algunos detalles clave esenciales para obtener resultados consistentes y confiables.
La calidad de la perfusión es fundamental para una tinción exitosa. Los resultados de las tinciones podrían verse afectados si la sangre permanece en el cerebro, dado que las células sanguíneas (por ejemplo, los glóbulos rojos) pueden generar una tinción artificial "positiva"10. Inferimos la presencia de un hígado de color gris parduzco para indicar una alta calidad de perfusión, lo que generalmente resulta en cerebros libres de sangre. La bomba de perfusión automatizada utilizada en este protocolo ayuda a perfundir un animal con éxito en un corto período de tiempo. La fijación insuficiente generará secciones cerebrales blandas y frágiles en los procedimientos posteriores, mientras que la fijación excesiva reducirá la sensibilidad de las reacciones de antígenos debido a la mayor reticulación de formaldehído de las proteínas. Se probaron diferentes condiciones, y la fijación nocturna a 4 ° C fue suficiente para la post-fijación de los cerebros de los ratones. Además del 10% de NBF utilizado en el presente protocolo como tampón fijador, el 4% (p/v) de paraformaldehído (PFA) recién preparado en PBS también se ha utilizado ampliamente para la fijación de tejidos11.
Con respecto a la crioseccionación, el grosor de las secciones debe decidirse en función de las necesidades específicas. Por ejemplo, los estudios de RNAscope requieren un espesor de 14 μm en lugar de 25 μm, comúnmente utilizado en tinciones de flotación libre. Mientras tanto, los estudios de RNAscope requieren que todos los procedimientos se realicen en soluciones libres de RNAsa para preservar la integridad de los ARNm objetivo. Algunos investigadores también utilizan un grosor de sección de 30-40 μm para una variedad de procedimientos de tinción. La crioseccionación convencional (es decir, muestras incrustadas en compuestos a temperatura de corte óptima (O.C.T.)) permite secciones cerebrales mucho más delgadas (por ejemplo, 10 μm) que podrían ser cruciales para estructuras intracelulares u otras aplicaciones. La estrategia de crioseccionado presentada aquí no implica necesariamente la incrustación de compuestos O.C.T. de muestras de cerebro y permite secciones de 14-40 μm. Es posible que no haya diferencias significativas para la tinción de 3,3-diaminobenzidina (DAB) utilizando secciones cerebrales de 25 o 40 μm de espesor. Sin embargo, las secciones más delgadas ofrecen imágenes de fluorescencia de mejor calidad.
El beneficio de la estrategia presentada aquí es que se pueden cortar múltiples muestras de cerebro (hasta 5 cerebros) a la vez. Sin embargo, la limitación de este método es que las muestras de cerebro deben cortarse dentro de 1 semana después de la deshidratación porque la inmersión en sacarosa al 30% durante demasiado tiempo es más probable que cause degradación de proteínas y otros problemas. Para evitar este problema potencial, estas secciones cerebrales pueden transferirse al tampón crioprotector y almacenarse a -20 ° C. Para la tinción flotante, la duración de la incubación y la concentración de anticuerpos primarios y secundarios deben optimizarse en estudios piloto. En general, la incubación durante la noche a 4 ° C o a temperatura ambiente con agitación leve es apropiada para la mayoría de los anticuerpos primarios, si los fabricantes no indican lo contrario. Para los anticuerpos secundarios, la incubación a temperatura ambiente durante 1-3 h funciona bien en la mayoría de las situaciones. Sin embargo, estos detalles deben optimizarse para diversas circunstancias. Por ejemplo, para la tinción de c-fos, normalmente incubamos las secciones cerebrales con una concentración de 1:1.000 durante la noche a 4 °C para la tinción de inmunofluorescencia. Sin embargo, utilizando el mismo anticuerpo para la tinción de DAB c-fos, preferimos incubar secciones cerebrales con una concentración de 1:5.000 durante 48 h a 4 °C.
Se puede usar un cóctel de anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios para la doble tinción para acelerar el procedimiento. Más específicamente, dos anticuerpos primarios diferentes de diferentes especies (por ejemplo, uno es de conejo, el otro es de conejillo de indias, pollo o ratón) se mezclan antes de la incubación, al igual que los anticuerpos secundarios correspondientes. La elección del anticuerpo secundario depende del anticuerpo primario. Si el anticuerpo primario es de conejo, el anticuerpo secundario debe ser anti-conejo, por ejemplo, burro anti-conejo o cabra anti-conejo. La selección del suero bloqueador depende del anticuerpo secundario, por ejemplo, se utilizará suero de burro normal si el anticuerpo secundario es de burro. Se sugiere la recuperación de antígenos si la inmunotinción aún no funciona, incluso si se han seguido estrictamente todas las pautas.
El montaje y la cubierta de las secciones cerebrales deben realizarse de una manera muy delicada. Todo el proceso no requiere arrugas, pliegues o burbujas de aire. Se necesitarán varios ensayos para determinar el tiempo de exposición óptimo para las imágenes. Recomendamos el mismo tiempo de exposición para el mismo anticuerpo en diferentes secciones, lo cual es esencial para comparar las intensidades de la señal entre diferentes animales o grupos. Es razonable que el tiempo de exposición no sea el mismo para diferentes anticuerpos, incluso en la misma sección. Por ejemplo, el tiempo de exposición para DAPI puede ser más corto que la señal c-fos en la mayoría de los casos.
Algunos procedimientos presentados en el protocolo son útiles para mejorar tanto la confiabilidad como la eficiencia a lo largo de todo el proceso. 1) El uso de una bomba de perfusión automatizada para la perfusión puede acortar considerablemente el tiempo de perfusión y mejorar significativamente la calidad del tejido. 2) Esta estrategia de crioseccionamiento permite cortar múltiples muestras de cerebro simultáneamente, lo que es mucho más eficiente que la práctica convencional. Este método también es fácil de aprender y dominar para los nuevos investigadores. 3) Para la tinción que flota libremente, como las muestras de cerebro se tiñen en suspensión, los anticuerpos pueden penetrar las secciones de ambos lados. Optimizamos la estrategia de incubación colocando todas las secciones de una muestra /serie en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para anticuerpos primarios y secundarios, lo que ahorra anticuerpos, especialmente cuando necesitamos teñir muestras de cerebro a granel. Otro beneficio del enfoque de flotación libre es que puede modificarse y aplicarse a otros métodos de tinción histoquímica (por ejemplo, IHC cromogénica, hematoxilina y eosina, violeta cresil) además de la tinción por inmunofluorescencia12.
Sin embargo, una limitación de la tinción flotante es que las secciones muy delgadas pueden ser difíciles de manejar. Se podría considerar un método de tinción en diapositiva si solo se necesitan recolectar y teñir inmediatamente unas pocas secciones, como suele ser el caso en la patología clínica. También probamos el método de tinción en diapositiva utilizando secciones cerebrales generadas a partir de este protocolo, y funcionó bien. Para hacer esto, monte las secciones cerebrales en diapositivas, espere a que las secciones se sequen y siga un protocolo tradicional de tinción de secciones congeladas en diapositivas. 4) Montar secciones flotantes en las diapositivas puede ser tedioso para ciertos investigadores, especialmente para los principiantes. Usamos un pincel fino para persuadir suavemente las secciones en la diapositiva en la interfaz de búfer de aire y luego usamos una pipeta de transferencia para quitar suavemente el búfer para bajar la interfaz de búfer de aire a medida que el montaje avanza de la parte superior a la inferior de la diapositiva. Aunque lleva mucho tiempo, esta estrategia es amigable para los principiantes. Los experimentadores experimentados pueden montar todas las secciones del cerebro en las diapositivas en PBS a la vez y solo quitar el búfer para sacar la diapositiva después de que se monta la última sección. 5) Finalmente, utilizamos un escáner para imágenes, que es más eficiente que la microscopía de fluorescencia, especialmente cuando hay una gran cantidad de diapositivas para imágenes. El escáner permite escanear hasta 12 diapositivas en un lote con un aumento de 20x. Alternativamente, la microscopía de fluorescencia estándar se puede emplear en ciertas circunstancias, por ejemplo, cuando un grupo específico de neuronas en el cerebro debe mostrarse con un aumento más alto (por ejemplo, 40x o incluso 60x)13,14.
En conclusión, este artículo presenta una metodología establecida para estudios histológicos de cerebros de ratón que ha demostrado ser reproducible, confiable y eficiente. El protocolo ayudará a generar resultados histológicos óptimos y consistentes entre diferentes investigadores y laboratorios y servirá de referencia para que los principiantes aprendan esta técnica.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los investigadores fueron apoyados por subvenciones de los NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 y R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) y American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
