Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.
Abstract
Het verlies van functie van melanocyten leidt tot vitiligo, dat de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Momenteel is er geen effectieve langetermijnbehandeling voor vitiligo. Daarom is het noodzakelijk om een handige en effectieve behandeling voor vitiligo te ontwikkelen. Regeneratieve geneeskunde technologie voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten lijkt een veelbelovende nieuwe behandeling van vitiligo. Dit omvat de directe herprogrammering van de huidcellen van de patiënt in functionele melanocyten om het verlies van melanocyten bij patiënten met vitiligo te helpen verbeteren. Deze methode moet echter eerst op muizen worden getest. Hoewel directe herprogrammering veel wordt gebruikt, is er geen duidelijk protocol voor directe herprogrammering in melanocyten. Bovendien is het aantal beschikbare transcriptiefactoren overweldigend.
Hier wordt een geconcentreerd lentivirus-verpakkingssysteemprotocol gepresenteerd om transcriptiefactoren te produceren die zijn geselecteerd voor het herprogrammeren van huidcellen naar melanocyten, waaronder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 en Snai2. Muis embryonale fibroblasten (MEF's) werden geïnfecteerd met het geconcentreerde lentivirus voor al deze transcriptiefactoren voor de directe herprogrammering van de MEF's in geïnduceerde melanocyten (iMels) in vitro. Bovendien werden deze transcriptiefactoren gescreend en werd het systeem geoptimaliseerd voor directe herprogrammering naar melanocyten. De expressie van de karakteristieke markers van melanine in iMels op gen- of eiwitniveau was significant verhoogd. Deze resultaten suggereren dat directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten een succesvolle nieuwe therapeutische strategie voor vitiligo zou kunnen zijn en het mechanisme van melanocytenontwikkeling zou kunnen bevestigen, wat de basis zal vormen voor verdere directe herprogrammering van fibroblasten in melanocyten in vivo.
Introduction
Vitiligo is een huidziekte die de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Om verschillende redenen, waaronder metabole afwijkingen, oxidatieve stress, generatie van ontstekingsmediatoren, celloslating en auto-immuunrespons, gaan de functionele melanocyten verloren en wordt de afscheiding van melanine gestopt, wat leidt tot de ontwikkeling van vitiligo 1,2. Deze aandoening komt veel voor en is bijzonder problematisch op het gezicht. De belangrijkste behandeling is het systemisch gebruik van corticosteroïden en immunomodulatoren. Fototherapie kan worden gebruikt voor systemische of lokale ziekten en er zijn chirurgische behandelingen, zoals geperforeerde huidtransplantatie en autologe melanocytentransplantatie 3,4,5. Patiënten die medicamenteuze therapie en fototherapie gebruiken, zijn echter vatbaar voor terugval en deze behandelingen hebben slechte therapeutische effecten op de lange termijn. Chirurgische behandeling is traumatisch en slechts matig effectief 2,6. Daarom is een nieuwe en effectieve therapeutische strategie nodig voor vitiligo.
De herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) keert deze cellen om van hun terminale toestand naar een pluripotente toestand, een proces gemedieerd door de transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc7. Vanwege de mogelijkheid van tumorigeniciteit en de lange productietijd is deze technologie echter met scepsis ontvangen wanneer deze wordt toegepast op klinische omgevingen8. Directe herprogrammering is een technologie die het ene type terminalcel laat transformeren in een ander type terminalcel9. Dit proces wordt bereikt door geschikte transcriptiefactoren. Verschillende cellen zijn al direct met succes geherprogrammeerd, waaronder cardiomyocyten10, neuronen11 en cochleaire haarcellen12. Sommige onderzoekers hebben zelfs huidweefsel direct in situ geherprogrammeerd, dat kan worden gebruikt voor wondherstel13. De voordelen van directe herprogrammering zijn onder meer kortere wachttijden en kosten, een lager risico op kanker, minder ethische problemen en een beter begrip van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de bepaling van het lot van cellen9.
Hoewel de directe herprogrammeringsmethode veel wordt gebruikt, is er momenteel geen definitieve methode voor de directe herprogrammering van huidcellen tot melanocyten, vooral vanwege de vele transcriptiefactoren die als14,15 moeten worden beschouwd. De transcriptiefactoren, Mitf, Sox10 en Pax3, zijn gebruikt voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten14. Daarentegen is de combinatie van MITF, PAX3, SOX2 en SOX9 ook gebruikt voor directe herprogrammering van huidcellen in menselijke melanocyten in een andere studie15. In dit protocol werd, ondanks het gebruik van een andere screeningsmethode, hetzelfde resultaat verkregen met de combinatie van Mitf, Sox10 en Pax3 voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten zoals eerder beschreven14. Het ontwikkelen van een systeem om melanocyten te genereren uit andere huidcellen kan een schema bieden voor het transformeren van andere huidcellen van vitiligopatiënten in melanocyten. Daarom is het cruciaal om een eenvoudige en efficiënte methode te construeren voor deze directe herprogrammering om melanocyten met succes te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit werk werd goedgekeurd door het Laboratory Animal Management and Use Committee aan de Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). De experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Er waren geen experimenten met mensen, dus dit werk had geen goedkeuring nodig van de ethische commissie voor menselijk onderzoek. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over reagentia.
1. Bouw van een geconcentreerd lentivirusverpakkingssysteem voor transcriptiefactoren
- Productie van het geconcentreerde virus (figuur 1A, B)
- Plaat 1.5 × 106 HEK-293T cellen in een schaal van 60 mm en kweek deze cellen met normaal medium (zie tabel 1) bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
OPMERKING: Als het virus in batches moet worden verpakt, kan een celkweekschaal van 100 mm worden gebruikt (zie tabel 2 voor meer informatie). - Zorg er na 24 uur voor dat de HEK-293T-cellen op de dag van transductie 80-90% confluence hebben bereikt en vervang het medium door 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM per 1 cm2). Laat de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 2 uur.
OPMERKING: Het vervangende medium moet serumvrij zijn, zodat de cellen kunnen worden "uitgehongerd" voor een betere plasmidetransfectie. - Bereid het mengsel van plasmiden (mengsel A) met 3 μg van de doelplasmiden van Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 of Snai2; 1 μg van de verpakking plasmide PMD2. G, en 2 μg van de verpakking plasmide PSPAX2. Vul het volume van mengsel A tot 150 μL aan met serumvrije DMEM. Bereid het mengsel van het transfectieregens (mengsel B) door toevoeging van 12 μL van het transfectieregens (het volume is tweemaal de totale massa van alle plasmiden) en vul het volume van mengsel B aan tot 150 μL met serumvrije DMEM.
OPMERKING: Bij het bereiden van de mixen is het belangrijk om langzaam vloeistof toe te voegen om luchtbellen te voorkomen. - Meng mix A en meng B nadat je ze 5 minuten op kamertemperatuur hebt laten staan. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten om het transfectiecomplex te vormen.
- Haal de HEK-293T-cellen uit de incubator, vervang het medium door DMEM + 2% FBS, voeg het mengsel uit stap 1.1.4 druppelsgewijs toe en meng de vloeistof voorzichtig.
- Vervang na 8 uur het medium met 3,5 ml normaal medium. Nadat u het medium hebt vervangen, verzamelt u het virussupernatant om de 24 uur en 48 uur.
- Meng de virussupernatanten die op twee verschillende tijdstippen zijn verzameld. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Haal het supernatant door filters van 0,45 μm en verzamel het in een steriele conische buis van 50 ml.
OPMERKING: Het virus dat om 24 uur wordt verzameld, kan worden bewaard bij 4 °C en worden gemengd met het virus dat om 48 uur wordt verzameld. - Concentreer het virussupernatant door te centrifugeren bij 6000 × g bij 4 °C 's nachts (~ 16 uur). Zorg ervoor dat de viruskorrel zichtbaar is aan de onderkant van de conische buis na het centrifugeren.
- Giet het supernatant langzaam uit. Los de viruskorrel op in een volume normaal medium dat 1/100des is van het volume van het virussupernatant. Gebruik een P1000-micropipette en pipet voorzichtig op en neer totdat een homogeen mengsel is verkregen. Verdeel het geconcentreerde virus indien nodig in microcentrifugebuizen. Bewaren bij −80 °C.
OPMERKING: Het virus is 100x geconcentreerd met deze methode. Het geconcentreerde virus (100x) kan >1 jaar bewaard worden bij −80 °C. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van het virus.
- Plaat 1.5 × 106 HEK-293T cellen in een schaal van 60 mm en kweek deze cellen met normaal medium (zie tabel 1) bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Detectie van geconcentreerde virustiter (figuur 1C)
- Plaat 1 × 105 HEK-293T cellen in één put van een 6-well plaat. Vergeet niet om er een goed toe te voegen als een negatieve controle. Kweek deze cellen met normaal medium bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Voeg na 24 uur 0,1 μL of 0,2 μL fluorescerend geconcentreerd virus (100x) toe aan elk putje en voeg 4 ng/μL van het kationische polymere transfectiereagens toe aan elk putje. Ongeveer 8-12 uur na infectie, vervang het medium door normaal medium.
OPMERKING: Om de nauwkeurigheid en efficiëntie van de fluorescentiedetectie te garanderen, moet de infectiegraad 10-30% zijn. Het toevoegen van 0,1 μL of 0,2 μL van het fluorescerende geconcentreerde virus kan de infectie-efficiëntie binnen dit bereik handhaven. De geconcentreerde virustiter kan ten minste 1 × 108 transducerende eenheden (TU)/ml bereiken. - Was de schaal ongeveer 48 uur na infectie met 1 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om dode cellen te verwijderen.
- Trypsinize deze cellen met behulp van 250 μL van 0,05% trypsine-EDTA per put in een 6-well plaat gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder vervolgens het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS, voeg de suspensie toe aan een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem en detecteer de infectie-efficiëntie van de virusecentie (groen fluorescerend eiwit, GFP +) met behulp van flowcytometrie.
- Bereken de geconcentreerde virustiter met behulp van de volgende formule: 105 (celvolume) × infectiegraad (GFP+%)/toegevoegd virusvolume (0,1 μL of 0,2 μL).
2. Directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten (figuur 2A)
- Bekleed een putje van een 6-well cell culture plaat met 1 ml 0,1% gelatine-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. Zorg ervoor dat de put volledig bedekt is met de 0,1% gelatine-oplossing. Aspirateer de 0,1% gelatine-oplossing na coating.
OPMERKING: Bereid 0,1% gelatine-oplossing (100 ml) als volgt: 0,1 g gelatinepoeder wordt opgelost in 100 ml ultrapuur water in een glazen fles met autoclaaf en vervolgens niet langer dan 2 maanden bij 4 °C bewaard. - Plaat 5 × 104 MEFs in één put van een 6-well plaat bedekt met 0,1% gelatine (zoals in stap 2.1), en kweek deze cellen met normaal medium bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 's nachts.
- Bevestig na 24 uur dat de MEF's een samenvloeiing van 40-50% hebben bereikt. Vervang het medium door normaal medium.
- Haal op dag 0 het geconcentreerde virus uit de vriezer en smelt het virus op ijs. Bereken het volume van het toe te voegen virus met behulp van eq. (1). Voeg het geconcentreerde virus voor de zes transcriptiefactoren, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 en Snai2 (zie Materiaaltabel) toe aan elke put volgens het berekende volume en voeg vervolgens 4 μg / ml van het kationische polymere transfectiemiddel toe.
Celnummer (5 × 104) × 30 (veelheid van infectie, MOI)/virustiter (1) - Verwijder op dag 1, 8-12 uur na infectie, het medium dat het virus bevat en vervang het door vers normaal medium terwijl u 0,5 μg / ml puromycine toevoegt om stabiele geïnfecteerde cellijnen te screenen.
- Vervang op dag 2, 48 uur na infectie, het supernatantmedium geleidelijk door het herprogrammeringsmedium. Verander eerst 1/4e van het totale mediumvolume en voeg 3 μM CHIR99021 toe.
- Verander van dag 3 tot dag 7, afhankelijk van de toestand van de cellen, het medium geleidelijk door het te vervangen door een hoger aandeel herprogrammeringsmedium (zie tabel 1) en schakel binnen 5 dagen over op een volledig herprogrammeringsmedium.
OPMERKING: Tijdens deze periode moeten puromycine en CHIR99021 elke dag worden gebruikt. Veel dode cellen verschijnen op de eerste en tweede dag van het veranderen van het herprogrammeringsmedium. Dit is normaal omdat de cellen zich geleidelijk aanpassen aan de transformatie. Daarom moet het medium geleidelijk worden veranderd om de gezonde proliferatie van de cellen te garanderen. - Om de cellen te passeren, voegt u 500 μL van 0,05% trypsine-EDTA toe om de cellen gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te verteren. Wanneer ~ 60% van de cellen zijn opgedreven, stop dan de spijsvertering door normaal medium 2x het volume van het spijsverteringsenzym toe te voegen. Verzamel de celsuspensie in een steriele conische buis van 15 ml, centrifugeer op 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant, resuspenseer de celpellet met het herprogrammeringsmedium en plaats de cellen in een steriele schaal van 60 mm met een dichtheid van 3 × 104/cm2. Kweek deze cellen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator .
OPMERKING: Van dag 8 tot dag 21 worden deze cellen elke 3-5 dagen gesubcultureerd en gekweekt in steriele gerechten van 60 mm om uit te breiden. Ze kunnen worden gekweekt om ten minste passage 5 te bereiken.
3. Optimalisatie voor directe herprogrammering en identificatie
- Screening op de geoptimaliseerde transcriptiefactoren
- Herhaal stap 2.1-2.7, waarbij u telkens een van de zes transcriptiefactoren vermindert. Infecteer de MEF's met het virus met combinaties van vijf transcriptiefactoren.
- Zeven dagen na infectie, extraheer het RNA van deze cellen16 en analyseer de expressieniveaus van hun melanocytische genen met behulp van reverse-transcriptie PCR (RT-PCR)17 om te screenen op de transcriptiefactoren met de grootste impact op de conversie naar melanocyten door ze één voor één te verwijderen (figuur 3A).
- Gebruik de top drie transcriptiefactoren die van invloed zijn op de conversie naar melanocyten om de MEF's te infecteren. Herhaal stap 2.1-2.7.
OPMERKING: Zeven dagen na infectie moeten de melanocytische genen detecteerbaar zijn in deze getransformeerde cellen (figuur 3B). Primerinformatie voor iMels-karakterisering is opgenomen in tabel 3.
- Identificatie van geïnduceerde melanocyten (iMels)
- Gebruik immunofluorescentiekleuring18 om te controleren of de iMels melanocytische eiwitten tot expressie brengen, waaronder TYRP-1 en DCT (figuur 4A).
- Melanine-specifieke 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) kleuring (Figuur 4B)
- Bereid 4% paraformaldehyde (10 ml) als volgt: los 0,4 g paraformaldehydepoeder op in 10 ml PBS. Zet de oplossing gedurende 2 uur in een oven op 56 °C om het oplossen te bevorderen.
OPMERKING: De oplossing kan niet langer dan een maand bij 4 °C worden bewaard. - Kweek de iMels in een schaal van 30 mm en was de schaal twee keer met voorverwarmd PBS. Voeg 1 ml 4% paraformaldehyde toe om de cellen gedurende 20 minuten te fixeren en was het gerecht 3 keer met PBS.
- Bereid vlak voor gebruik 0,1% DOPA-vlekoplossing (10 ml) door 0,01 g L-DOPA-poeder op te lossen in 10 ml PBS. Plaats de oplossing gedurende 30 minuten in een waterbad bij 37 °C; schud het meerdere keren om ontbinding te bevorderen.
- Voeg 1 ml vers bereide 0,1% DOPA-kleuringsoplossing toe. Incubeer in een oven op 37 °C gedurende 2-5 uur. Als er geen bruinzwarte deeltjes zijn, blijf dan nog 2 uur incuberen bij 37 °C, maar niet >5 uur. Controleer de monsters elke 30 minuten.
- Was het gerecht 3 keer met PBS gedurende 1 minuut per keer. Kleur de kern met 1 ml hematoxyline kleuringsoplossing gedurende 2 min.
- Voor langdurige opslag, droog de monsters uit met 95% ethanol gedurende 3 minuten en vervolgens 100% ethanol gedurende 5 minuten. Sluit het gerecht af met xyleen en neutrale balsem.
- Bereid 4% paraformaldehyde (10 ml) als volgt: los 0,4 g paraformaldehydepoeder op in 10 ml PBS. Zet de oplossing gedurende 2 uur in een oven op 56 °C om het oplossen te bevorderen.
- Melanine-specifieke Masson-Fontana kleuring (Figuur 4B)
- Plaat iMels in een schaal van 30 mm en fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten; was het gerecht 3 keer met PBS.
- Voeg 1 ml oplossing A (ammoniakzilveroplossing) toe uit de Masson-Fontana-kleuringskit (zie Materiaaltafel), plaats de schaal in een donkere doos en plaats de donkere doos in een oven op 56 °C gedurende 15-40 min.
OPMERKING: Als bruinzwarte deeltjes na 15 minuten in de oven niet zichtbaar zijn, breng de monsters dan terug naar de oven van 56 °C om verder te broeden, maar niet gedurende >40 min. Er kan wat water aan de donkere doos worden toegevoegd om opdroging te voorkomen. - Aspirateer oplossing A en was de schaal 5-6 keer met gedestilleerd water, telkens 1-2 min.
- Voeg 1 ml oplossing B (hypo-oplossing) uit de Masson-Fontana-kleuringskit toe en laat de schaal 3-5 minuten op kamertemperatuur staan.
- Aspirateer oplossing B en was de schaal 3 keer met kraanwater, telkens 1 min.
- Voeg 1 ml oplossing C (neutrale rode kleurstof) toe uit de Masson-Fontana kleuringskit en laat de schaal 3-5 minuten op kamertemperatuur staan.
- Aspirateer oplossing C en was de schaal 3 keer met gedestilleerd water, telkens 1 min.
- Voeg 1 ml 100% ethanol toe voor snelle uitdroging en zuig de ethanol na 3 minuten aan.
OPMERKING: Gekleurde monsters kunnen na afdichting met xyleen en neutrale balsem lange tijd worden bewaard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel bevat de protocollen van een geconcentreerd lentivirusverpakkingssysteem om lentivirus van transcriptiefactoren te produceren voor directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten en protocollen voor screening op transcriptiefactoren en directe herprogrammering van melanocyten uit MEFs.
Het succes van geconcentreerde lentivirusproductie werd geëvalueerd door de fluorescentie-intensiteit van GFP (figuur 1A) of door flowcytometrie (figuur 1B) te observeren na het infecteren van HEK-293T-cellen gedurende 48 uur met ongeconcentreerd lentivirus (1x) en geconcentreerd lentivirus (100x). De titer van het geconcentreerde virus was 108 TU/ml of meer, wat relatief hoog is (figuur 1C).
Directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten wordt bereikt door de infectie met transcriptiefactor lentivirus en transformatie met het geoptimaliseerde herprogrammeringsmedium. Het schema voor het genereren van iMels uit MEF's is weergegeven in figuur 2A. Celmorfologie verandert geleidelijk tijdens directe herprogrammering. Celsynapsen worden langwerpig en celkernen vergroten. Deze cellen verouderen echter geleidelijk na ~ Dag 20 (~ 5 passages) (figuur 2B).
Eén transcriptiefactor werd tegelijkertijd verwijderd uit de oorspronkelijke set van zes transcriptiefactoren (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 en Snai2) om de transcriptiefactor te bepalen met de grootste impact op herprogrammering. Verwijdering van Mitf, Pax3 of Sox10 resulteerde in het uitschakelen van de expressie van melanocytische genen Tyr, Tyrp1 en Mlana (figuur 3A), wat aangeeft dat deze drie transcriptiefactoren de grootste impact hadden op de conversie van fibroblasten naar melanocyten. De expressie van melanocytische genen geïnduceerd door directe herprogrammering met drie transcriptiefactoren was hoger dan die van alle zes transcriptiefactoren (figuur 3B).
Ten slotte werden de kenmerken van de iMels geïdentificeerd die werden verkregen door gebruik te maken van dit geoptimaliseerde systeem van directe herprogrammering. De expressie van melanocytische markers (TYR, TYYP1) werd gedetecteerd met behulp van immunofluorescente kleuring (figuur 4A). Melanine-specifieke kleuringsmethoden, waaronder DOPA en Masson-Fontana kleuring, lieten ook positieve resultaten zien (figuur 4B).
Figuur 1: Productie van geconcentreerd virus en schatting van titer. (A) Fluorescentie-intensiteit van GFP na infectie van HEK-293T-cellen met ongeconcentreerd lentivirus (1x) en geconcentreerd lentivirus (100x) (B) Vergelijking van de infectiepercentages van ongeconcentreerd lentivirus (1x) en geconcentreerd lentivirus (100x) zoals gedetecteerd door flowcytometrie. (C) Titerschatting van geconcentreerd lentivirus. Schaalstaven = 250 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; TU = transducerende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Generatie iMels uit MEFs. (A) Schematisch diagram van iMels-generatie. (B) Veranderingen in celmorfologie tijdens de conversie van MEFs naar iMels in directe herprogrammering op dag 0, dag 3, dag 10 en dag 20+. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: iMels = geïnduceerde melanocyten; MEFs = embryonale fibroblasten van muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Screening op geoptimaliseerde transcriptiefactoren. (A) qRT-PCR van Tyr, Tyrp1 en Mlana mRNA niveaus in cellen getransduceerd met vijf transcriptiefactoren (een van de oorspronkelijke zes transcriptiefactoren is verwijderd). MEF + EV en MEF + 6F worden respectievelijk gebruikt als negatieve controle en positieve controle. De mRNA-expressie is genormaliseerd naar Gapdh-expressie . (B) qRT-PCR van Tyr,Tyrp1 en Mlana mRNA niveaus in cellen getransduceerd met de oorspronkelijke zes transcriptiefactoren en met drie transcriptiefactoren. MEF, MEF + EV en MMC worden gebruikt als respectievelijk een blanco, negatieve controle en positieve controle. De mRNA-niveaus zijn genormaliseerd tot Gapdh-niveaus . Alle waarden zijn gemiddeld ± SD van drie onafhankelijke experimenten. De primerreeksen zijn weergegeven in tabel 3. Afkortingen: qRT-PCR = kwantitatieve reverse-transcriptie PCR; MEF = embryonale fibroblasten van muizen; MEF+EV = embryonale fibroblasten van muizen + lege vector; MMC = muismelanocyt; 6F = zes transcriptiefactoren bestaande uit Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 en Snai2; 3F: drie transcriptiefactoren bestaande uit Mitf, Pax3 en Sox10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Functionele identificatie van iMels. (A) Immunostaining van melanocytische markers (TYR, TYYP1) in iMels. Schaalbalk = 50 μm. Zie de tabel met materialen voor de verdunning van antilichamen die in deze studie worden gebruikt. (B) Masson-Fontana kleuring en DOPA kleuring. MEF en de Melan-a cellijn worden respectievelijk gebruikt als negatieve controle en positieve controle. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: iMels = geïnduceerde melanocyten; DOPA = 3,4-dihydroxyfenylalanine; MEF = muis embryonale fibroblast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Onderdelen | Dosis (concentratie, volume) | Eindconcentratie | |
| Normaal medium (100 ml) | DMEM/HOGE GLUCOSE | 89 ml | |
| Warmte-geïnactiveerde FBS | 10 ml | ||
| Antibiotica (Pen / Strep) | 10000 U/ml, 1 ml | 100 U/ml | |
| Herprogrammeringsmedium (100 ml) | RPMI-1640 | 88 ml | |
| Warmte-geïnactiveerde FBS | 10 ml | ||
| Recombinant Humaan SCF | 200 μg/ml, 50 μl | 100 ng/ml | |
| Recombinant Humaan bFGF | 4 μg/ml, 250 μl | 10 ng/ml | |
| Recombinante humane insuline | 10 mg/ml, 50 μL | 5 μg/ml | |
| EDN3 menselijk | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Cholera Toxine | 0,3 mg/ml, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetaat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hydrocortison | 100 μg/ml, 500 μl | 0,5 μg/ml | |
| Adenine | 40 mg/ml, 60 μL | 24 μg/ml |
Tabel 1: Componenten van normale en herprogrammerende media.
| Cultuur gerecht | Zaaidichtheid (cellen/schaal) | Gemiddeld (ml) | Plasmide Systeem | Transfectiereagens (μL) | ||
| Doelplasmide (μg) | Pmd2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabel 2: Details van het lentivirusverpakkingssysteem.
| RT-PCR Primers | |
| Doel | Primer sets |
| Gapdh | Vooruit: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Achterzijde: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Vooruit: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Achterzijde: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Vooruit: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Achterzijde: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Vooruit: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Achterzijde: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabel 3: Primer informatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kwaliteit van het virus is cruciaal voor het succes van directe herprogrammering naar melanocyten in dit protocol. De methode voor het verpakken en concentreren van virussen in dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te herhalen en is niet afhankelijk van een ander hulpgeconcentreerd reagens. Dit protocol kan in de meeste laboratoria met succes worden gevolgd. Om de kwaliteit van het geconcentreerde virus te waarborgen, hebben de volgende punten speciale aandacht nodig. Een daarvan is de celstatus van HEK-293T. Hoewel HEK-293T-cellen onsterfelijke cellen zijn, moeten de cellen die worden gebruikt om het geconcentreerde virus te maken gezonde cellen zijn binnen 10 passages (de titer neemt af met hogere passages).
Een ander kritiek punt is het aandeel van het gebruikte transfectiereagens (in dit geval lipofectamine). Aangezien cellen beschadigd zijn na toevoeging van het transfectiereagens, moet de verhouding tussen het reagens en plasmiden herhaaldelijk worden gecontroleerd om de optimale conditie van de cellen en de kwaliteit van het virus te waarborgen. De 2:1 verhouding transfectiereagens tot plasmiden is het meest geschikt voor HEK-293T cellen voor het verpakken van het virus in dit systeem. Bovendien vereisen alle stappen een zachte behandeling gedurende het hele proces. Omdat virusdeeltjes kunnen worden geabsorbeerd na coating, wat de virustiter beïnvloedt, is het niet raadzaam om het gerecht te bedekken met een matrix bij het verpakken van het virus. Vanwege de mogelijkheid van loslating van HEK-293T, moet het supernatant zorgvuldig worden vervangen, vooral wanneer vers medium wordt toegevoegd na het verzamelen van het virussupernatant na 24 uur. Enkele andere overwegingen zijn de celdichtheid, de lengte van de transfectietijd en het serumgehalte in het medium. Dit zijn belangrijke kwesties die van invloed zijn op de efficiëntie van transfectie. De voorwaarden in dit protocol zijn het meest geschikt, gebaseerd op resultaten verkregen na vele herhaalde experimenten.
In het proces van directe herprogrammering naar melanocyten is het belangrijk om rekening te houden met de toestand van de oorspronkelijke cel-MEFs en de dichtheid van MEFs die worden gebruikt voor directe herprogrammering. Voordat met de directe herprogrammering wordt begonnen, moeten MEF's worden gekweekt in niet-gecoate celkweekschalen. Cellen in de proliferatiefase (40-50% samenvloeiing) moeten worden geselecteerd voor directe herprogrammering; de infectie-efficiëntie neemt af met toenemende celdichtheid. De geherprogrammeerde cellen moeten worden verguld in met gelatine beklede kweekschalen.
De tijd die nodig is voor het virus om cellen te infecteren is ook van cruciaal belang; een te lange infectietijd zal de overleving van de cel schaden, terwijl een te korte infectietijd de efficiëntie zal verminderen. Acht uur bleek geschikt voor het geconcentreerde virus om MEFs in dit protocol te infecteren. Het laatste kritieke punt is de juiste manier om het herprogrammeringsmedium te veranderen. MEF's moeten zich aanpassen aan een nieuw medium. De toestand van de cellen moet elke dag worden gecontroleerd en het medium moet zorgvuldig worden gewijzigd op basis van de celstatus. Het te snel veranderen van het herprogrammeringsmedium zal ervoor zorgen dat een groot aantal cellen afsterft.
Bij het cultiveren en subcultureren van iMels is de passagedichtheid van de cellen van cruciaal belang. iMels hebben een relatief hoge dichtheid nodig om de groei te behouden. Celsynapsen moeten met elkaar in contact komen voor de normale proliferatie van deze cellen. Als de dichtheid te laag is, kunnen de cellen stoppen met prolifereren. Hier bleek de dichtheid van 3 × 104/cm2 een geschikte doorgangsdichtheid voor iMels. Na 5 passages beginnen de iMels te verouderen (figuur 2B); de melanine is op dit moment volwassener en de resulterende cellen kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie, DOPA of Masson-Fontana-kleuring. Eerdere passages van cellen kunnen worden gebruikt voor RT-PCR omdat de expressie van genen in een relatief vroeg stadium zal veranderen.
Hoewel directe herprogrammering op grote schaal wordt bestudeerd, is er weinig onderzoek naar de directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten. Verschillende studies hebben verschillende transcriptiefactoren14,15 gebruikt, wat tot veel verwarring heeft geleid. Dit protocol legt uit hoe geconcentreerde virussen van hoge kwaliteit kunnen worden geproduceerd en verschillende transcriptiefactoren kunnen worden gescreend om de belangrijkste te selecteren voor directe herprogrammering naar melanocyten. Het medium werd in dit protocol aangevuld met voedingsfactoren voor de directe herprogrammering van melanocyten (tabel 2). Ten slotte werden functionele iMels met succes geïdentificeerd. Het heldere en geoptimaliseerde melanocyten directe herprogrammeringssysteem zou nieuwe behandelingsstrategieën kunnen bieden voor depigmentatieziekten zoals vitiligo.
Er zijn echter nog steeds enkele beperkingen aan de technologie die in dit artikel wordt gepresenteerd. Ten eerste is het een uitdaging om de efficiëntie van dit protocol in te schatten. CRISPR-Cas9-genbewerking kan worden gecombineerd met dit protocol om melanocytische genen, zoals Tyr of Tyrp-1, in de eerste cellen te kloppen om het percentage geïnduceerde cellen tijdens het herprogrammeringsproces te observeren. Bovendien kan het lentivirusintroductiesysteem dat in dit protocol wordt gebruikt, het risico van genrecombinatie en insertiemutatie met zich meebrengen19. In de toekomst kunnen efficiëntere en veiligere introductiemethoden worden gebruikt, zoals niet-virale recombinante eiwitexpressievectoren of mRNA-vectoren. Het experiment in dit protocol bevindt zich nog in het in vitro stadium. De volgende stap is om de melanocyten direct in vivo te herprogrammeren, waardoor de niet-gepigmenteerde huid gepigmenteerd raakt en om het directe herprogrammeringssysteem te gebruiken om een effectieve behandeling van vitiligo te ontwerpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) en de Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
