Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मेलानोसाइट्स में माउस फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62911
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Jiangsu University, 2Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University

Summary

यहां, हम मेलानोसाइट्स के लिए एक अनुकूलित प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग सिस्टम और एक उच्च दक्षता, केंद्रित वायरस पैकेजिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं जो चिकनी प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग सुनिश्चित करता है।

Abstract

मेलानोसाइट्स के कार्य का नुकसान विटिलिगो की ओर जाता है, जो प्रभावित व्यक्तियों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को गंभीररूप से प्रभावित करता है। वर्तमान में, विटिलिगो के लिए कोई प्रभावी दीर्घकालिक उपचार नहीं है। इसलिए, विटिलिगो के लिए एक सुविधाजनक और प्रभावी उपचार विकसित करना आवश्यक है। मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए पुनर्योजी चिकित्सा प्रौद्योगिकी विटिलिगो का एक आशाजनक उपन्यास उपचार प्रतीत होता है। इसमें विटिलिगो के रोगियों में मेलानोसाइट्स के नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए कार्यात्मक मेलानोसाइट्स में रोगी की त्वचा कोशिकाओं का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग शामिल है। हालांकि, इस विधि को पहले चूहों पर परीक्षण करने की आवश्यकता है। यद्यपि प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, मेलानोसाइट्स में प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए कोई स्पष्ट प्रोटोकॉल नहीं है। इसके अलावा, उपलब्ध प्रतिलेखन कारकों की संख्या भारी है।

यहां, एक केंद्रित लेंटीवायरस पैकेजिंग सिस्टम प्रोटोकॉल को सोलेनोसाइट्स के लिए त्वचा कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के लिए चुने गए प्रतिलेखन कारकों का उत्पादन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें सोक्स 10, मिटीएफ, पैक्स 3, सोक्स 2, सोक्स 9 और एसएनएआई 2 शामिल हैं। माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) इन विट्रो में प्रेरित मेलानोसाइट्स (आईमेल्स) में एमईएफ के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए इन सभी प्रतिलेखन कारकों के लिए केंद्रित लेंटिवायरस से संक्रमित थे। इसके अलावा, इन प्रतिलेखन कारकों की जांच की गई थी, और सिस्टम को मेलानोसाइट्स के लिए प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए अनुकूलित किया गया था। जीन या प्रोटीन स्तर पर आईमेल्स में मेलेनिन के विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग विटिलिगो के लिए एक सफल नई चिकित्सीय रणनीति हो सकती है और मेलानोसाइट विकास के तंत्र की पुष्टि कर सकती है, जो विवो में मेलानोसाइट्स में फाइब्रोब्लास्ट्स के आगे प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए आधार प्रदान करेगी।

Introduction

विटिलिगो एक त्वचा रोग है जो प्रभावित व्यक्तियों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। चयापचय संबंधी असामान्यताओं, ऑक्सीडेटिव तनाव, भड़काऊ मध्यस्थों की पीढ़ी, सेल टुकड़ी और ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया सहित विभिन्न कारणों से, कार्यात्मक मेलानोसाइट्स खो जाते हैं, और मेलेनिन का स्राव बंद हो जाता है, जिससे विटिलिगो 1,2 का विकास होता है। यह स्थिति व्यापक रूप से होती है और चेहरे पर विशेष रूप से समस्याग्रस्त होती है। मुख्य उपचार कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स और इम्यूनोमोड्यूलेटर का प्रणालीगत उपयोग है। फोटोथेरेपी का उपयोग प्रणालीगत या स्थानीय बीमारियों के लिए किया जा सकता है, और सर्जिकल उपचार हैं, जैसे छिद्रित त्वचा प्रत्यारोपण और ऑटोलॉगस मेलानोसाइट प्रत्यारोपण 3,4,5। हालांकि, ड्रग थेरेपी और फोटोथेरेपी का उपयोग करने वाले रोगियों को पुनरुत्थान का खतरा होता है, और इन उपचारों में खराब दीर्घकालिक चिकित्सीय प्रभाव होते हैं। सर्जिकल उपचार दर्दनाक है और केवल मामूली प्रभावी 2,6 है। इसलिए, विटिलिगो के लिए एक नई और प्रभावी चिकित्सीय रणनीति की आवश्यकता है।

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का रीप्रोग्रामिंग इन कोशिकाओं को उनके टर्मिनल राज्य से प्लुरिपोटेंट अवस्था में उलट देता है, प्रतिलेखन कारकों, अक्टूबर 4, सोक्स 2, केएलएफ 4 और सी-माइक7 द्वारा मध्यस्थता की जाने वाली प्रक्रिया। हालांकि, ट्यूमरजेनेसिटी की संभावना और लंबे उत्पादन समय के कारण, नैदानिक सेटिंग्स8 पर लागू होने पर इस तकनीक को संदेह के साथ मुलाकात की गई है। डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग एक ऐसी तकनीक है जो एक प्रकार के टर्मिनल सेल को दूसरे प्रकार के टर्मिनल सेल9 में बदल देती है। यह प्रक्रिया उपयुक्त प्रतिलेखन कारकों द्वारा प्राप्त की जाती है। विभिन्न कोशिकाओं को पहले से ही सफलतापूर्वक पुन: प्रोग्राम किया गया है, जिसमें कार्डियोमायोसाइट्स10, न्यूरॉन्स11 और कॉक्लियर हेयर सेल12 शामिल हैं। कुछ शोधकर्ताओं ने त्वचा के ऊतकों को सीधे सीटू में पुन: प्रोग्राम किया है, जिसका उपयोग घाव की मरम्मत के लिए किया जा सकताहै 13. प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के फायदों में कम प्रतीक्षा समय और लागत, कैंसर का कम जोखिम, कम नैतिक समस्याएं और सेल भाग्य निर्धारण अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ शामिलहै 9.

यद्यपि प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, वर्तमान में मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए कोई निश्चित विधि नहीं है, खासकर कई प्रतिलेखन कारकों के कारण14,15 माना जाता है। प्रतिलेखन कारक, मिटीएफ, सोक्स 10 और पैक्स 3, का उपयोग मेलानोसाइट्स14 में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए किया गया है। इसके विपरीत, एमआईटीएफ, पैक्स 3, एसओएक्स 2 और एसओएक्स 9 के संयोजन का उपयोग एक अन्य अध्ययन15 में मानव मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए भी किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एक अलग स्क्रीनिंग विधि के उपयोग के बावजूद, एक ही परिणाम मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष पुन: प्रोग्रामिंग के लिए mitf, Sox10, और पैक्स 3 के संयोजन के साथ प्राप्त किया गया था जैसा कि पहले14 वर्णित है। अन्य त्वचा कोशिकाओं से मेलानोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रणाली विकसित करना विटिलिगो रोगियों की अन्य त्वचा कोशिकाओं को मेलानोसाइट्स में बदलने के लिए एक योजना प्रदान कर सकता है। इसलिए, मेलेनोसाइट्स को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए इस प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग के लिए एक सरल और कुशल विधि का निर्माण करना महत्वपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस काम को जियांग्सू विश्वविद्यालय (यूजेएस-आईएसीयूसी-एपी --20190305010) में प्रयोगशाला पशु प्रबंधन और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगों को एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रिडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल (एएएएलएसी इंटरनेशनल) द्वारा स्थापित मानकों के अनुसार सख्ती से किया गया था। मनुष्यों से जुड़े कोई प्रयोग नहीं थे, इसलिए इस काम को मानव अनुसंधान नैतिकता समिति से अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी। अभिकर्मकों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. प्रतिलेखन कारकों के लिए एक केंद्रित लेंटिवायरस पैकेजिंग प्रणाली का निर्माण

  1. केंद्रित वायरस का उत्पादन (चित्रा 1 ए, बी)
    1. प्लेट 1.5 × 106 एचईके -293 टी कोशिकाओं को 60 मिमी पकवान में और 5% सीओ 2 के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य माध्यम ( तालिका 1 देखें) के साथ इन कोशिकाओंको संस्कृति करें।
      नोट: यदि वायरस को बैचों में पैक करने की आवश्यकता है, तो 100 मिमी सेल संस्कृति पकवान का उपयोग किया जा सकता है (विवरण के लिए, तालिका 2 देखें)।
    2. 24 घंटे के बाद, सुनिश्चित करें कि एचईके -293 टी कोशिकाएं पारगमन के दिन 80-90% संगम तक पहुंच गई हैं, और डीएमईएम के 3.5 एमएल (डीएमईएम के 150 μL प्रति 1 सेमी2) के साथ माध्यम को प्रतिस्थापित करें। 2 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को छोड़ दें।
      नोट: प्रतिस्थापन माध्यम सीरम मुक्त होना चाहिए, ताकि कोशिकाओं को बेहतर प्लास्मिड अभिकर्मक के लिए "भूखा" किया जा सके।
    3. प्लास्मिड (मिश्रण ए) का मिश्रण तैयार करें जिसमें एमआईटीएफ, सोक्स 10, पैक्स 3, सोक्स 2, सोक्स 9, या स्नाई 2 के लक्ष्य प्लास्मिड के 3 μg होते हैं; पैकेजिंग प्लास्मिड पीएमडी 2 का 1 μg। जी, और पैकेजिंग प्लास्मिड PSPAX2 के 2 μg। सीरम मुक्त डीएमईएम के साथ 150 μL करने के लिए मिश्रण A की मात्रा बनाओ। अभिकर्मक अभिकर्मक के 12 μL जोड़कर अभिकर्मक अभिकर्मक (मिश्रण बी) का मिश्रण तैयार करें (मात्रा सभी प्लास्मिड के कुल द्रव्यमान से दोगुनी है), और सीरम मुक्त डीएमईएम के साथ मिश्रण बी की मात्रा को 150 μL तक बनाएं।
      नोट: घोला जा सकता है तैयार करते समय, हवा के बुलबुले से बचने के लिए धीरे-धीरे तरल जोड़ना महत्वपूर्ण है।
    4. मिश्रण ए को मिलाएं और उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक खड़े होने की अनुमति देने के बाद बी मिलाएं। अभिकर्मक परिसर बनाने के लिए 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
    5. इनक्यूबेटर से एचईके -293 टी कोशिकाओं को लें, डीएमईएम + 2% एफबीएस के साथ माध्यम को प्रतिस्थापित करें, चरण 1.1.4 ड्रॉपवाइज से मिश्रण जोड़ें, और तरल को धीरे से मिलाएं।
    6. 8 घंटे के बाद, सामान्य माध्यम के 3.5 मिलीलीटर के साथ माध्यम बदलें। माध्यम बदलने के बाद, हर 24 घंटे और 48 घंटे में वायरस सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें।
    7. दो अलग-अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए वायरस सतह पर तैरनेवालों को मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 0.45 μm फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पास और एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में इसे इकट्ठा।
      नोट: 24 घंटे में एकत्र वायरस 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और 48 घंटे में एकत्र वायरस के साथ मिश्रित किया जा सकता है।
    8. रात भर (~ 16 घंटे) 4 डिग्री सेल्सियस पर 6000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा वायरस सतह पर तैरनेवाला ध्यान केंद्रित करें। सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद शंक्वाकार ट्यूब के तल पर वायरस गोली दिखाई दे रही है।
    9. सतह पर तैरनेवाला धीरे-धीरे बाहर डालो। वायरस गोली को सामान्य माध्यम की मात्रा में भंग करें जो वायरस सतह पर तैरनेवाला की मात्रा का 1/100वां है। एक पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, एक सजातीय मिश्रण प्राप्त होने तक धीरे-धीरे पिपेट ऊपर और नीचे। आवश्यकतानुसार केंद्रित वायरस को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: वायरस इस विधि के साथ 100x केंद्रित है। केंद्रित वायरस (100x) को -80 डिग्री सेल्सियस पर >1 वर्ष के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। वायरस के बार-बार जमने और पिघलने से बचें।
  2. केंद्रित वायरस टिटर का पता लगाना (चित्रा 1 सी)
    1. प्लेट 1 × 105 एचईके -293 टी कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक अच्छी तरह से जोड़ना याद रखें। 5% सीओ2 के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य माध्यम के साथ इन कोशिकाओं की संस्कृति।
    2. 24 घंटे के बाद प्रत्येक कुएं में फ्लोरोसेंट केंद्रित वायरस (100x) के 0.1 μL या 0.2 μL जोड़ें, और प्रत्येक कुएं में धनायनिक बहुलक अभिकर्मक अभिकर्मक के 4 एनजी / संक्रमण के लगभग 8-12 घंटे बाद, माध्यम को सामान्य माध्यम से बदलें।
      नोट: प्रतिदीप्ति का पता लगाने की सटीकता और दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, संक्रमण दर 10-30% होनी चाहिए। फ्लोरोसेंट केंद्रित वायरस के 0.1 μL या 0.2 μL जोड़ने से इस सीमा के भीतर संक्रमण दक्षता बनाए रखी जा सकती है। केंद्रित वायरस टिटर कम से कम 1 × 108 ट्रांसड्यूसिंग यूनिट (टीयू) / एमएल तक पहुंच सकता है।
    3. संक्रमण के लगभग 48 घंटे बाद, मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ पकवान धो लें।
    4. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 250 μL का उपयोग करके इन कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    5. पीबीएस के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, निलंबन को 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में जोड़ें, और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके वायरस प्रतिदीप्ति (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जीएफपी +) की संक्रमण दक्षता का पता लगाएं।
    6. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके केंद्रित वायरस टिटर की गणना करें: 105 (सेल वॉल्यूम) × संक्रमण दर (जीएफपी +%)/जोड़ा वायरस वॉल्यूम (0.1 μL या 0.2 μL)।

2. मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग (चित्रा 2 ए)

  1. 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.1% जिलेटिन समाधान के 1 एमएल के साथ 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट का एक अच्छी तरह से कोट करें। सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से पूरी तरह से 0.1% जिलेटिन समाधान के साथ कवर किया गया है। कोटिंग के बाद 0.1% जिलेटिन समाधान की आकांक्षा करें।
    नोट: 0.1% जिलेटिन समाधान (100 एमएल) निम्नानुसार तैयार करें: 0.1 ग्राम जिलेटिन पाउडर को एक आटोक्लेव ग्लास बोतल में 100 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में भंग कर दिया जाता है और फिर 2 महीने से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  2. प्लेट 5 × 104 एमईएफ 0.1% जिलेटिन (चरण 2.1 के रूप में) के साथ लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में, और इन कोशिकाओं को 5% सीओ2 रातोंरात के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य माध्यम के साथ संस्कृति करें।
  3. 24 घंटे के बाद, पुष्टि करें कि एमईएफ 40-50% संगम तक पहुंच गए हैं। माध्यम को सामान्य माध्यम से बदलें।
  4. दिन 0 पर, फ्रीजर से केंद्रित वायरस निकालें और बर्फ पर वायरस पिघलाएं। समीकरण (1) का उपयोग करके जोड़े जाने वाले वायरस के आयतन की गणना कीजिए। गणना की गई मात्रा के अनुसार प्रत्येक अच्छी तरह से छह प्रतिलेखन कारकों, एमआईटीएफ, पैक्स 3, सोक्स 10, सोक्स 9, सोक्स 2 और एसएनएआई 2 ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए केंद्रित वायरस जोड़ें, और फिर धनायनिक बहुलक अभिकर्मक एजेंट के 4 μg /
    सेल नंबर (5 × 104) × 30 (संक्रमण की बहुलता, एमओआई)/वायरस टिटर (1)
  5. संक्रमण के बाद दिन 1, 8-12 घंटे, वायरस युक्त माध्यम को हटा दें और स्थिर संक्रमित सेल लाइनों को स्क्रीन करने के लिए 0.5 μg / एमएल प्यूरोमाइसिन जोड़ते हुए इसे ताजा सामान्य माध्यम से बदल दें।
  6. दिन 2 पर, संक्रमण के 48 घंटे बाद, सतह पर तैरनेवाला माध्यम को धीरे-धीरे रिप्रोग्रामिंग माध्यम से बदलें। सबसे पहले, कुल मध्यम मात्रा का 1/4वां बदलें, और 3 μM CHIR99021 जोड़ें।
  7. दिन 3 से दिन 7 तक, कोशिकाओं की स्थिति के आधार पर, धीरे-धीरे रिप्रोग्रामिंग माध्यम के उच्च अनुपात के साथ प्रतिस्थापित करके माध्यम को बदलें ( तालिका 1 देखें), और 5 दिनों के भीतर पूर्ण रीप्रोग्रामिंग माध्यम पर स्विच करें।
    नोट: इस अवधि के दौरान, प्यूरोमाइसिन और सीएचआईआर 99021 का उपयोग हर दिन किया जाना चाहिए। रीप्रोग्रामिंग माध्यम को बदलने के पहले और दूसरे दिन कई मृत कोशिकाएं दिखाई देंगी। यह सामान्य है क्योंकि कोशिकाएं धीरे-धीरे परिवर्तन के अनुकूल होती हैं। इसलिए, कोशिकाओं के स्वस्थ प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए माध्यम को धीरे-धीरे बदलने की आवश्यकता है।
  8. कोशिकाओं को पारित करने के लिए, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को पचाने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 500 μL जोड़ें। जब ~ 60% कोशिकाएं तैर जाती हैं, तो पाचन एंजाइम की मात्रा को सामान्य माध्यम 2x जोड़कर पाचन को रोकें। एक 15 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, रीप्रोग्रामिंग माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और 3 × 104 / सेमी2 के घनत्व पर 60 मिमी बाँझ पकवान में कोशिकाओं को प्लेट करें। एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इन कोशिकाओं की संस्कृति।
    नोट: दिन 8 से दिन 21 तक, इन कोशिकाओं को हर 3-5 दिनों में उप-सुसंस्कृत किया जाता है और विस्तार करने के लिए 60 मिमी बाँझ व्यंजनों में सुसंस्कृत किया जाता है। उन्हें कम से कम मार्ग 5 तक पहुंचने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है।

3. प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग और पहचान के लिए अनुकूलन

  1. अनुकूलित प्रतिलेखन कारकों के लिए स्क्रीनिंग
    1. चरण 2.1-2.7 दोहराएं, हर बार छह प्रतिलेखन कारकों में से एक को कम करें। पांच प्रतिलेखन कारकों के संयोजन के साथ वायरस के साथ एमईएफ को संक्रमित करें।
    2. संक्रमण के सात दिन बाद, इन कोशिकाओं16 के आरएनए को निकालें, और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) 17 का उपयोग करके उनके मेलानोसाइटिक जीन की अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण करें प्रतिलेखन कारकों के लिए स्क्रीन करने के लिए मेलानोसाइट्स में रूपांतरण पर सबसे बड़ा प्रभाव उन्हें एक-एक करके (चित्रा 3 ए)।
    3. एमईएफ को संक्रमित करने के लिए मेलानोसाइट्स में रूपांतरण को प्रभावित करने वाले शीर्ष तीन प्रतिलेखन कारकों का उपयोग करें। चरण 2.1-2.7 दोहराएँ।
      नोट: संक्रमण के सात दिन बाद, मेलेनोसाइटिक जीन इन परिवर्तित कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) में पता लगाने योग्य होना चाहिए। आईमेल्स लक्षण वर्णन के लिए प्राइमर जानकारी तालिका 3 में शामिल है।
  2. प्रेरित मेलानोसाइट्स (आईमेल्स) की पहचान
    1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला18 का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए करें कि आईमेल्स मेलानोसाइटिक प्रोटीन व्यक्त करते हैं, जिसमें टीआईआरपी -1 और डीसीटी (चित्रा 4 ए) शामिल हैं।
    2. मेलेनिन-विशिष्ट 3,4-डायहाइड्रॉक्सीफेनिलएलनिन (डीओपीए) धुंधला (चित्रा 4 बी)
      1. निम्नानुसार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (10 एमएल) तैयार करें: 10 एमएल पीबीएस में 0.4 ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड पाउडर भंग करें। विघटन को बढ़ावा देने के लिए 2 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में समाधान रखें।
        नोट: समाधान एक महीने से अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
      2. 30 मिमी पकवान में आईमेल्स को संस्कृति दें और पकवान को दो बार पूर्व-गर्म पीबीएस के साथ धो लें। 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 1 एमएल जोड़ें, और पीबीएस के साथ डिश को 3 बार धो लें।
      3. पीबीएस के 10 मिलीलीटर में एल-डोपा पाउडर के 0.01 ग्राम को भंग करके उपयोग करने से ठीक पहले 0.1% डीओपीए दाग समाधान (10 एमएल) तैयार करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में समाधान रखें; विघटन को बढ़ावा देने के लिए इसे कई बार हिलाएं।
      4. ताजा तैयार 0.1% डोपा धुंधला समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 2-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सेते हैं। यदि कोई भूरा-काला कण नहीं है, तो एक और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते रहें लेकिन >5 घंटे के लिए नहीं। हर 30 मिनट में नमूनों की जाँच करें।
      5. हर बार 1 मिनट के लिए पीबीएस के साथ पकवान को 3 बार धोएं। 2 मिनट के लिए हेमटॉक्सिलिन धुंधला समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ नाभिक दाग।
      6. दीर्घकालिक भंडारण के लिए, 3 मिनट के लिए 95% इथेनॉल और फिर 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल का उपयोग करके नमूनों को निर्जलित करें। जाइलीन और तटस्थ बाल्सम के साथ पकवान को सील करें।
    3. मेलेनिन-विशिष्ट मैसन-फोंटाना धुंधला (चित्रा 4 बी)
      1. एक 30 मिमी पकवान में प्लेट आईमेल्स और 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें; पकवान को पीबीएस के साथ 3 बार धो लें।
      2. मैसन-फोंटाना धुंधला किट से समाधान ए (अमोनिया चांदी समाधान) का 1 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), पकवान को एक अंधेरे बॉक्स में रखें, और अंधेरे बॉक्स को 15-40 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
        नोट: यदि भूरे-काले कण ओवन में 15 मिनट के बाद दिखाई नहीं देते हैं, तो नमूनों को इनक्यूबेटिंग जारी रखने के लिए 56 डिग्री सेल्सियस ओवन पर वापस करें लेकिन >40 मिनट के लिए नहीं। सूखने से रोकने के लिए अंधेरे बॉक्स में कुछ पानी जोड़ा जा सकता है।
      3. एस्पिरेट समाधान ए और पकवान को आसुत जल से 5-6 बार धोएं, हर बार 1-2 मिनट।
      4. मैसन-फोंटाना धुंधला किट से 1 एमएल समाधान बी (हाइपो समाधान) जोड़ें, और 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पकवान छोड़ दें।
      5. एस्पिरेट समाधान बी और हर बार 3 बार, 1 मिनट नल के पानी के साथ पकवान धो लें।
      6. मैसन-फोंटाना धुंधला किट से समाधान सी (तटस्थ लाल डाई) के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पकवान छोड़ दें।
      7. एस्पिरेट समाधान सी और आसुत जल के साथ पकवान को 3 बार धोएं, हर बार 1 मिनट।
      8. तेजी से निर्जलीकरण के लिए 100% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें, और 3 मिनट के बाद इथेनॉल की आकांक्षा करें।
        नोट: दाग नमूने जाइलीन और तटस्थ बाल्सम के साथ सील करने के बाद एक लंबे समय के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस लेख में मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए प्रतिलेखन कारकों के लेंटिवायरस का उत्पादन करने के लिए एक केंद्रित लेंटिवायरस पैकेजिंग सिस्टम के प्रोटोकॉल और प्रतिलेखन कारकों के लिए स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल और एमईएफ से मेलानोसाइट्स के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग शामिल हैं।

केंद्रित लेंटीवायरस उत्पादन की सफलता का मूल्यांकन जीएफपी (चित्रा 1 ए) की प्रतिदीप्ति तीव्रता या प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 1 बी) द्वारा 48 घंटे के लिए एचईके -293 टी कोशिकाओं को संक्रमित करने के बाद किया गया था। केंद्रित वायरस का टिटर 108 टीयू / एमएल या उससे अधिक था, जो अपेक्षाकृत अधिक है (चित्रा 1 सी)।

मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग प्रतिलेखन कारक लेंटिवायरस के संक्रमण और अनुकूलित रीप्रोग्रामिंग माध्यम के साथ परिवर्तन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। एमईएफ से आईमेल्स की पीढ़ी के लिए योजना चित्रा 2 ए में दिखाई गई है। प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के दौरान सेल आकृति विज्ञान धीरे-धीरे बदलता है। सेल सिनैप्स लम्बी हो जाती हैं, और सेल नाभिक बढ़ जाते हैं। हालांकि, इन कोशिकाओं धीरे धीरे उम्र ~ दिन 20 (~ 5 मार्ग) (चित्रा 2 बी) के बाद।

रिप्रोग्रामिंग पर सबसे बड़े प्रभाव के साथ प्रतिलेखन कारक को निर्धारित करने के लिए छह प्रतिलेखन कारकों (एमआईटीएफ, पैक्स 3, सोक्स 10, सोक्स 9, सोक्स 2 और एसएनएआई 2) के मूल सेट से एक समय में एक प्रतिलेखन कारक को हटा दिया गया था। एमआईटीएफ, पैक्स 3, या सोक्स 10 को हटाने के परिणामस्वरूप मेलानोसाइटिक जीन टायर, टायर्प 1 और म्लाना (चित्रा 3 ए) की अभिव्यक्ति की चुप्पी हुई, यह दर्शाता है कि इन तीन प्रतिलेखन कारकों का मेलानोसाइट्स में फाइब्रोब्लास्ट रूपांतरण पर सबसे बड़ा प्रभाव पड़ा। तीन प्रतिलेखन कारकों के साथ प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग द्वारा प्रेरित मेलानोसाइटिक जीन की अभिव्यक्ति सभी छह प्रतिलेखन कारकों (चित्रा 3 बी) की तुलना में अधिक थी।

अंत में, प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग की इस अनुकूलित प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त आईमेल्स की विशेषताओं की पहचान की गई। मेलानोसाइटिक मार्करों (टीवाईआर, टीवाईपी 1) की अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला (चित्रा 4 ए) का उपयोग करके पता लगाया गया था। डीओपीए और मैसन-फोंटाना धुंधला सहित मेलेनिन-विशिष्ट धुंधला तरीकों ने भी सकारात्मक परिणाम दिखाए (चित्रा 4 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: केंद्रित वायरस का उत्पादन और टिटर का अनुमान (ए) एचईके -293 टी कोशिकाओं को बिना केंद्रित लेंटिवायरस (1 एक्स) और केंद्रित लेंटिवायरस (100 एक्स) (बी) के साथ संक्रमित करने के बाद जीएफपी की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाए गए अनियंत्रित लेंटिवायरस (1 एक्स) और केंद्रित लेंटिवायरस (100 एक्स) की संक्रमण दर की तुलना। (सी) केंद्रित लेंटिवायरस का टिटर अनुमान। स्केल सलाखों = 250 μm. संक्षिप्त नाम: जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; टीयू = ट्रांसड्यूसिंग इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एमईएफ से आईमेल की पीढ़ी। (ए) आईमेल्स पीढ़ी का योजनाबद्ध आरेख। (बी) दिन 0, दिन 3, दिन 10 और दिन 20+ पर प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग में एमईएफ से आईमेल्स में रूपांतरण के दौरान सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: आईमेल्स = प्रेरित मेलानोसाइट्स; एमईएफ = माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: अनुकूलित प्रतिलेखन कारकों के लिए स्क्रीनिंग। (ए) पांच प्रतिलेखन कारकों (मूल छह प्रतिलेखन कारकों में से एक को हटा दिया गया है) के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं में टायर, टायर्प 1 और म्लाना एमआरएनए स्तरों का क्यूआरटी-पीसीआर। एमईएफ + ईवी और एमईएफ + 6 एफ का उपयोग क्रमशः नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। एमआरएनए अभिव्यक्ति को गपध अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। (बी) मूल छह प्रतिलेखन कारकों और तीन प्रतिलेखन कारकों के साथ स्थानांतरित कोशिकाओं में टायर, टायर्प 1 और म्लाना एमआरएनए स्तरों के क्यूआरटी-पीसीआर। एमईएफ, एमईएफ + ईवी, और एमएमसी का उपयोग क्रमशः रिक्त, नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। एमआरएनए स्तर को गैप्ड स्तरों तक सामान्यीकृत किया जाता है। सभी मूल्य तीन स्वतंत्र प्रयोगों ± एसडी का मतलब है। प्राइमर अनुक्रम तालिका 3 में दिखाए गए हैं। संक्षिप्त नाम: क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर; एमईएफ = माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट; एमईएफ + ईवी = माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट + खाली वेक्टर; एमएमसी = माउस मेलानोसाइट; 6 एफ = छह प्रतिलेखन कारक जिसमें एमआईटीएफ, पैक्स 3, सोक्स 10, सोक्स 9, सोक्स 2 और स्नाई 2 शामिल हैं; 3 एफ: तीन प्रतिलेखन कारक जिसमें एमआईटीएफ, पैक्स 3 और सोक्स 10 शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आईमेल्स की कार्यात्मक पहचान। (ए) आईमेल्स में मेलानोसाइटिक मार्करों (टीवाईआर, टीवाईपी 1) का इम्यूनोस्टेनिंग। स्केल बार = 50 μm। इस अध्ययन में उपयोग किए गए एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें। (बी) मैसन-फोंटाना धुंधला और डोपा धुंधला। एमईएफ और मेलन-ए सेल लाइन का उपयोग क्रमशः नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। स्केल बार = 50 μm। संक्षिप्त नाम: आईमेल्स = प्रेरित मेलानोसाइट्स; डीओपीए = 3,4-डाइहाइड्रॉक्सीफेनिलएलनिन; एमईएफ = माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घटक खुराक (एकाग्रता, मात्रा) अंतिम एकाग्रता
सामान्य मध्यम (100 एमएल) डीएमईएम/उच्च ग्लूकोज 89 एमएल
गर्मी निष्क्रिय एफबीएस 10 मिलीलीटर
एंटीबायोटिक्स (पेन / 10000 यू/एमएल, 1 एमएल 100 यू/एमएल
रीप्रोग्रामिंग माध्यम (100 एमएल) आरपीएमआई -1640 88 मिलीलीटर
गर्मी निष्क्रिय एफबीएस 10 मिलीलीटर
पुनः संयोजक मानव एससीएफ 200 μg/mL, 50 μL 100 एनजी/एमएल
पुनः संयोजक मानव बीएफजीएफ 4 μg/mL, 250 μL 10 एनजी/एमएल
पुनः संयोजक मानव इंसुलिन 10 मिलीग्राम /एमएल, 50 μL 5 μg/एमएल
ईडीएन 3 मानव 100 μM, 100 μL 0.1 μM
हैजा विष 0.3 मिलीग्राम / एमएल, 0.56 μL 20 पीएम
फोरबोल 12-मिरिस्टेट 13-एसीटेट (टीपीए) 1 एमएम, 20 μL 200 एनएम
हाइड्रोकार्टिसोन 100 μg/mL, 500 μL 0.5 μg/mL
ऐडिनीन 40 मिलीग्राम /एमएल, 60 μL 24 μg/एमएल

तालिका 1: सामान्य और रीप्रोग्रामिंग मीडिया के घटक।

संस्कृति पकवान बीजारोपण घनत्व (कोशिकाओं / मध्यम (एमएल) प्लास्मिड सिस्टम अभिकर्मक अभिकर्मक (μL)
लक्ष्य प्लास्मिड (μg) पीएमडी 2। जी (μg) PSPAX2 (μg)
35 मिमी 6 ×105 1.5 1.5 0.5 1 6
60 मिमी 1.5 × 106 3.5 3 1 2 12
100 मिमी 4 × 106 8 8 3 6 34

तालिका 2: लेंटीवायरस पैकेजिंग सिस्टम का विवरण।

आरटी-पीसीआर प्राइमर
लक्ष्य प्राइमर सेट
गपढ़। फॉरवर्ड: सीएएसीजीएसीसीसीसीटीसीटीसीटीजीटीएसीटीजीसी
रिवर्स: सीएटीसीटीसीजीसीसीटीजीएसीटीजीटीजीटीजी
टायर फॉरवर्ड: जीजीजीसीसीएएएटीटीएसीएजीएजीएजी
रिवर्स: एटीजीटीजीटीजीसीसीसीएटी
टायरपी 1 फॉरवर्ड: एएजीटीसीएटीजीजीसीसीएजीटीसीएजी
रिवर्स: टीसीएजीटीजीएजीटीटी
मलिना फॉरवर्ड: एजीएसीजीसीटीसीटीटीजीटीसीटीसीटीजीसीटी
रिवर्स: टीसीएएजीटीसीटीजीटीटीसीटीजीटी

तालिका 3: प्राइमर जानकारी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में मेलानोसाइट्स को प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग की सफलता के लिए वायरस की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में पैकेजिंग और ध्यान केंद्रित करने वाले वायरस की विधि सरल और दोहराने में आसान है और किसी अन्य सहायक केंद्रित अभिकर्मक पर भरोसा नहीं करती है। अधिकांश प्रयोगशालाओं में इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक पालन किया जा सकता है। केंद्रित वायरस की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, निम्नलिखित बिंदुओं पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। एक एचईके -293 टी की सेल स्थिति है। यद्यपि एचईके -293 टी कोशिकाएं अमर कोशिकाएं हैं, केंद्रित वायरस बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं 10 मार्गों के भीतर स्वस्थ कोशिकाएं होनी चाहिए (टिटर उच्च मार्ग के साथ कम हो जाता है)।

एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु अभिकर्मक अभिकर्मक (इस मामले में, लिपोफेक्टामाइन) का अनुपात है। चूंकि अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ने के बाद कोशिकाएं क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, इसलिए कोशिकाओं की इष्टतम स्थिति और वायरस की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अभिकर्मक से प्लास्मिड के अनुपात की बार-बार जांच की जानी चाहिए। प्लास्मिड के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक का 2: 1 अनुपात इस प्रणाली में वायरस की पैकेजिंग के लिए एचईके -293 टी कोशिकाओं के लिए सबसे उपयुक्त है। इसके अलावा, सभी चरणों को पूरी प्रक्रिया में कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। चूंकि कोटिंग के बाद वायरस कणों को अवशोषित किया जा सकता है, जो वायरस टिटर को प्रभावित करता है, इसलिए वायरस की पैकेजिंग करते समय डिश को किसी भी मैट्रिक्स के साथ कोट करना उचित नहीं है। एचईके -293 टी की टुकड़ी की संभावना के कारण, सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, खासकर जब 24 घंटे के बाद वायरस सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के बाद ताजा माध्यम जोड़ा जाता है। कुछ अन्य विचारों में सेल घनत्व, अभिकर्मक समय की लंबाई और माध्यम में सीरम सामग्री शामिल है। ये महत्वपूर्ण मुद्दे हैं जो अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत शर्तों कई दोहराया प्रयोगों के बाद प्राप्त परिणामों के आधार पर, सबसे उपयुक्त हैं।

मेलानोसाइट्स के लिए प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग की प्रक्रिया में, मूल सेल एमईएफ की स्थिति और प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एमईएफ के घनत्व पर विचार करना महत्वपूर्ण है। प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग शुरू करने से पहले, एमईएफ को गैर-लेपित सेल संस्कृति व्यंजनों में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। प्रसार चरण (40-50% संगम) में कोशिकाओं को प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए चुना जाना चाहिए; सेल घनत्व बढ़ने के साथ संक्रमण दक्षता कम हो जाती है। पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं को जिलेटिन-लेपित संस्कृति व्यंजनों में चढ़ाया जाना चाहिए।

कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए वायरस के लिए आवश्यक समय की लंबाई भी महत्वपूर्ण है; बहुत लंबा संक्रमण समय सेल अस्तित्व को खराब कर देगा, जबकि बहुत कम संक्रमण का समय दक्षता को कम कर देगा। इस प्रोटोकॉल में केंद्रित वायरस को एमईएफ को संक्रमित करने के लिए आठ घंटे उपयुक्त पाए गए। अंतिम महत्वपूर्ण बिंदु रीप्रोग्रामिंग माध्यम को बदलने का सही तरीका है। एमईएफ को एक नए माध्यम के अनुकूल होने की आवश्यकता है। कोशिकाओं की स्थिति को हर दिन जांचा जाना चाहिए, और सेल की स्थिति के अनुसार माध्यम को सावधानीपूर्वक बदला जाना चाहिए। रीप्रोग्रामिंग माध्यम को बहुत जल्दी बदलने से बड़ी संख्या में कोशिकाएं मर जाएंगी।

आईमेल्स की खेती और उपसंस्कृति करते समय, कोशिकाओं का मार्ग घनत्व महत्वपूर्ण है। विकास को बनाए रखने के लिए आईमेल्स को अपेक्षाकृत उच्च घनत्व की आवश्यकता होती है। इन कोशिकाओं के सामान्य प्रसार के लिए सेल सिनैप्स एक दूसरे के संपर्क में होना चाहिए। यदि घनत्व बहुत कम है, तो कोशिकाएं फैलना बंद कर सकती हैं। यहां, 3 × 104/सेमी2 का घनत्व आईमेल्स के लिए एक उपयुक्त मार्ग घनत्व पाया गया था। 5 मार्गों के बाद, आईमेल्स उम्र बढ़ने शुरू करते हैं (चित्रा 2 बी); मेलेनिन इस समय अधिक परिपक्व है, और परिणामी कोशिकाओं का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीओपीए, या मैसन-फोंटाना धुंधला के लिए किया जा सकता है। कोशिकाओं के पहले के अंशों का उपयोग आरटी-पीसीआर के लिए किया जा सकता है क्योंकि जीन की अभिव्यक्ति अपेक्षाकृत प्रारंभिक चरण में बदल जाएगी।

यद्यपि प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग का व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है, लेकिन मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग पर बहुत कम शोध है। विभिन्न अध्ययनों ने विभिन्न प्रतिलेखनकारकों 14,15 का उपयोग किया है, जिससे बहुत भ्रम पैदा हुआ है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि मेलानोसाइट्स को प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण लोगों का चयन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले केंद्रित वायरस का उत्पादन कैसे करें और कई प्रतिलेखन कारकों को स्क्रीन करें। माध्यम इस प्रोटोकॉल (तालिका 2) में मेलानोसाइट्स के लिए प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए पोषण संबंधी कारकों के साथ पूरक था। अंत में, कार्यात्मक आईमेल्स को सफलतापूर्वक पहचाना गया। स्पष्ट और अनुकूलित मेलानोसाइट डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग सिस्टम विटिलिगो जैसे डिपिग्मेंटेशन रोगों के लिए नई उपचार रणनीतियां प्रदान कर सकता है।

हालाँकि, इस लेख में प्रस्तुत तकनीक की अभी भी कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल की दक्षता का अनुमान लगाना चुनौतीपूर्ण है। सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीन संपादन को इस प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि मेलानोसाइटिक जीन, जैसे टायर या टायर्प -1 में दस्तक दी जा सके, प्रारंभिक कोशिकाओं में रीप्रोग्रामिंग प्रक्रिया के दौरान प्रेरित कोशिकाओं के प्रतिशत का निरीक्षण किया जा सके। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली लेंटीवायरस परिचय प्रणाली जीन पुनर्संयोजन और सम्मिलन उत्परिवर्तन19 का जोखिम उठा सकती है। भविष्य में, अधिक कुशल और सुरक्षित परिचय विधियों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि गैर-वायरल पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति वैक्टर या एमआरएनए वैक्टर। इस प्रोटोकॉल में प्रयोग अभी भी कृत्रिम परिवेशीय चरण में है। अगला कदम विवो में सीधे मेलानोसाइट्स को फिर से प्रोग्राम करना है, जिससे गैर-पिगमेंटेड त्वचा पिगमेंटेड हो जाती है और विटिलिगो के प्रभावी उपचार को डिजाइन करने के लिए प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग सिस्टम का उपयोग करती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को आंशिक रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070638 और 81770621) और जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (बीके 20180281) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-062 Stored at -20 °C
0.45 μM filter Millipore SLHVR33RB
5 mL polystyrene round bottom tube Falcon 352052
95%/100% ethanol LANBAO 210106 Stored at RT
Adenine Sigma A2786 Stock concentration 40 mg/mL
Final concentration 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a Invitrogen A21137 Dilution of 1:500 to use
Antibiotics(Pen/Strep) Gibco 15140-122 Stored at -20 °C
Anti-TRP1/TYRP1 Antibody Millipore MABC592 Host/Isotype: Mouse IgG2a
Species reactivity: Mouse/Human
Dilution of 1:200 to use
Anti-TRP2/DCT Antibody Abcam ab74073 Host/Isotype: Rabbit IgG
Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Stock concentration 10 mM
Final concentration 3 μM
Cholera toxin Sigma C8052 Stock concentration 0.3 mg/mL
Final concentration 20 pM
Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 111-165-144 Dilution of 1:500 to use
DMEM (High glucose) HyClone SH30243.01 Stored at 4 °C
DMSO  Sigma D2650 Stored at RT
FBS Gibco 10270-106 Stored at -20 °C
Heat-inactivated before use
Gelatin Sigma G9391 Stored at RT
GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) Hanheng Biological Technology Co., Ltd. pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 Stored at -20 °C
Hematoxylin Abcam ab220365 Stored at RT
Human EDN3 American-Peptide 88-5-10A Stock concentration 100 μM
Final concentration 0.1 μM
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 µg/mL
Final concentration 0.5 µg/mL
L-DOPA Sigma D9628 Stored at RT
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Transfection reagent, stored at 4 °C
Masson-Fontana staining kit Solarbio G2032 Stored at 4 °C
Neutral balsam Solarbio G8590 Stored at 4 °C
Paraformaldehyde Sigma P6148 Stored at RT
PBS (-) Gibco C10010500BT Stored at RT
Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) Sigma P8139 Stock concentration 1 mM
Final concentration 200 nM
Polybrene Sigma H9268 cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL
Final concentration 4 ng/µL
Puromycin Gibco A11138-03 Stored at -20 °C
Recombinant human bFGF Invitrogen 13256-029 Stock concentration 4 μg/mL
Final concentration 10 ng/mL
Recombinant human insulin Sigma  I3536 Stock concentration 10 mg/mL
Final concentration 5 µg/mL
Recombinant human SCF R&D 255-SC-010 Stock concentration 200 μg/mL
Final concentration 100 ng/mL
RPMI-1640 Gibco 11875-093 Stored at 4 °C
Xylene Sigma 1330-20-7 Stored at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
  2. Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
  3. Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
  4. Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
  5. Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
  6. Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
  7. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
  8. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  9. Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
  12. Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
  13. Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
  14. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
  15. Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
  16. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
  17. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  18. Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
  19. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).

Tags

विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 174 डायरेक्ट रिप्रोग्रामिंग मेलानोसाइट्स विटिलिगो लेंटिवायरस मेलेनिन प्रतिलेखन कारक
मेलानोसाइट्स में माउस फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y. X., Liu, L. P., Jin, M.,… More

Zhang, Y. X., Liu, L. P., Jin, M., Sun, H., Zhang, H. L., Li, Y. M. Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (174), e62911, doi:10.3791/62911 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter