Summary
Här beskriver vi ett optimerat direkt omprogrammeringssystem för melanocyter och ett högeffektivt, koncentrerat virusförpackningssystem som säkerställer smidig direkt omprogrammering.
Abstract
Förlusten av melanocyternas funktion leder till vitiligo, vilket allvarligt påverkar de drabbade individernas fysiska och psykiska hälsa. För närvarande, Det finns ingen effektiv långsiktig behandling för vitiligo. Därför är det absolut nödvändigt att utveckla en bekväm och effektiv behandling för vitiligo. Regenerativ medicin teknik för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter verkar vara en lovande ny behandling av vitiligo. Detta innebär direkt omprogrammering av patientens hudceller till funktionella melanocyter för att förbättra förlusten av melanocyter hos patienter med vitiligo. Denna metod måste dock först testas på möss. Även om direkt omprogrammering används i stor utsträckning finns det inget tydligt protokoll för direkt omprogrammering till melanocyter. Dessutom är antalet tillgängliga transkriptionsfaktorer överväldigande.
Här presenteras ett koncentrerat lentivirusförpackningssystemprotokoll för att producera transkriptionsfaktorer valda för omprogrammering av hudceller till melanocyter, inklusive Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 och Snai2. Musembryonala fibroblaster (MEF) infekterades med det koncentrerade lentiviruset för alla dessa transkriptionsfaktorer för direkt omprogrammering av MEF till inducerade melanocyter (iMels) in vitro. Dessutom screenades dessa transkriptionsfaktorer och systemet optimerades för direkt omprogrammering till melanocyter. Uttrycket av de karakteristiska markörerna för melanin i iMels vid gen- eller proteinnivån ökade signifikant. Dessa resultat tyder på att direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter kan vara en framgångsrik ny terapeutisk strategi för vitiligo och bekräfta mekanismen för melanocytutveckling, vilket kommer att ligga till grund för ytterligare direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter in vivo.
Introduction
Vitiligo är en hudsjukdom som allvarligt påverkar den fysiska och psykiska hälsan hos de drabbade individerna. Av olika skäl, inklusive metaboliska abnormiteter, oxidativ stress, generering av inflammatoriska mediatorer, cellavlossning och autoimmunt svar, förloras de funktionella melanocyterna och utsöndringen av melanin stoppas, vilket leder till utveckling av vitiligo 1,2. Detta tillstånd förekommer i stor utsträckning och är särskilt problematiskt i ansiktet. Huvudbehandlingen är den systemiska användningen av kortikosteroider och immunmodulatorer. Fototerapi kan användas för systemiska eller lokala sjukdomar, och det finns kirurgiska behandlingar, såsom perforerad hudtransplantation och autolog melanocyttransplantation 3,4,5. Patienter som använder läkemedelsbehandling och fototerapi är dock benägna att återfalla, och dessa behandlingar har dåliga långsiktiga terapeutiska effekter. Kirurgisk behandling är traumatisk och endast måttligt effektiv 2,6. Därför behövs en ny och effektiv terapeutisk strategi för vitiligo.
Omprogrammeringen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) vänder dessa celler från deras terminala tillstånd till ett pluripotent tillstånd, en process som förmedlas av transkriptionsfaktorerna, Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc7. På grund av risken för tumorigenicitet och den långa produktionstiden har denna teknik dock mötts med skepsis när den tillämpas på kliniska inställningar8. Direkt omprogrammering är en teknik som gör att en typ av en terminalcell omvandlas till en annan typ av en terminalcell9. Denna process uppnås genom lämpliga transkriptionsfaktorer. Olika celler har redan omprogrammerats direkt framgångsrikt, inklusive kardiomyocyter10, neuroner11 och cochleära hårceller12. Vissa forskare har till och med omprogrammerat hudvävnad direkt in situ, som kan användas för sårreparation13. Fördelarna med direkt omprogrammering inkluderar minskade väntetider och kostnader, lägre risk för cancer, färre etiska problem och en bättre förståelse för mekanismen bakom bestämning av cellöden9.
Även om den direkta omprogrammeringsmetoden används i stor utsträckning finns det för närvarande ingen bestämd metod för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter, särskilt på grund av de många transkriptionsfaktorer som ska betraktas som14,15. Transkriptionsfaktorerna, Mitf, Sox10 och Pax3, har använts för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter14. Däremot har kombinationen av MITF, PAX3, SOX2 och SOX9 också använts för direkt omprogrammering av hudceller till humana melanocyter i en annan studie15. I detta protokoll, trots användningen av en annan screeningmetod, erhölls samma resultat med kombinationen av Mitf, Sox10 och Pax3 för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter som beskrivits tidigare14. Att utveckla ett system för att generera melanocyter från andra hudceller kan ge ett system för att omvandla andra hudceller av vitiligopatienter till melanocyter. Därför är det viktigt att konstruera en enkel och effektiv metod för denna direkta omprogrammering för att generera melanocyter framgångsrikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta arbete godkändes av Laboratory Animal Management and Use Committee vid Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). Experimenten utfördes i strikt överensstämmelse med de standarder som fastställts av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Det fanns inga experiment med människor, så detta arbete behövde inte godkännande från den mänskliga forskningsetiska kommittén. Se materialförteckningen för mer information om reagenser.
1. Konstruktion av ett koncentrerat lentivirusförpackningssystem för transkriptionsfaktorer
- Produktion av det koncentrerade viruset (figur 1A, B)
- Platta 1,5 × 106 HEK-293T-celler till en 60 mm skål och odla dessa celler med normalt medium (se tabell 1) vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 %CO2.
OBS: Om viruset behöver förpackas i satser kan en 100 mm cellodlingsskål användas (för detaljer, se tabell 2). - Efter 24 timmar, se till att HEK-293T-cellerna har nått 80-90% sammanflöde på transduktionsdagen och ersätt mediet med 3,5 ml DMEM (150 μl DMEM per 1 cm2). Lämna cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 %CO2 i 2 timmar.
OBS: Ersättningsmediet måste vara serumfritt, så att cellerna kan "svältas" för bättre plasmidtransfektion. - Bered blandningen av plasmider (blandning A) som innehåller 3 μg av målplasmiderna av Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 eller Snai2. 1 μg av förpackningsplasmiden PMD2. G och 2 μg av förpackningsplasmiden PSPAX2. Fyll på blandningen A till 150 μl med serumfri DMEM. Bered blandningen av transfektionsreagenset (blanda B) genom att tillsätta 12 μl av transfektionsreagenset (volymen är dubbelt så stor som den totala massan av alla plasmider) och fyll på blandningen B till 150 μL med serumfri DMEM.
OBS: När du förbereder blandningarna är det viktigt att tillsätta vätska långsamt för att undvika luftbubblor. - Kombinera blandning A och blanda B efter att ha låtit dem stå i 5 minuter vid rumstemperatur. Inkubera blandningen vid rumstemperatur i 20-30 min för att bilda transfektionskomplexet.
- Ta HEK-293T-cellerna ur inkubatorn, byt ut mediet med DMEM + 2% FBS, tillsätt blandningen från steg 1.1.4 droppvis och blanda vätskan försiktigt.
- Efter 8 timmar, byt medium med 3,5 ml normalt medium. Efter byte av medium, samla virus supernatanten var 24: e timme och 48 h.
- Blanda virussupernatanterna som samlats in vid två olika tidpunkter. Centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid 4 °C. För supernatanten genom 0,45 μm filter och samla den i ett 50 ml sterilt koniskt rör.
OBS: Viruset som samlats in vid 24 timmar kan förvaras vid 4 °C och blandas med viruset som samlats in vid 48 timmar. - Koncentrera virussupernatanten genom centrifugering vid 6000 × g vid 4 °C över natten (~16 timmar). Se till att viruspelleten är synlig i botten av det koniska röret efter centrifugering.
- Häll ut supernatanten långsamt. Lös upp viruspelleten i en volym normalt medium som är 1/100av virussupernatantens volym. Använd en P1000-mikropipett och pipettera försiktigt upp och ner tills en homogen blandning erhålls. Dela det koncentrerade viruset i mikrocentrifugrör efter behov. Förvaras vid −80 °C.
OBS: Viruset är koncentrerat 100x med denna metod. Det koncentrerade viruset (100x) kan lagras i >1 år vid −80 °C. Undvik upprepad frysning och upptining av viruset.
- Platta 1,5 × 106 HEK-293T-celler till en 60 mm skål och odla dessa celler med normalt medium (se tabell 1) vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 %CO2.
- Påvisande av koncentrerad virustiter (figur 1C)
- Platta 1 × 105 HEK-293T-celler i en brunn på en 6-brunnsplatta. Kom ihåg att lägga till en väl som en negativ kontroll. Odla dessa celler med normalt medium vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 %CO2.
- Tillsätt 0,1 μl eller 0,2 μl fluorescerande koncentrerat virus (100x) till varje brunn efter 24 timmar och tillsätt 4 ng/μl av det katjoniska polymera transfektionsreagenset till varje brunn. Cirka 8-12 h efter infektion, byt ut mediet med normalt medium.
OBS: För att säkerställa noggrannheten och effektiviteten hos fluorescensdetekteringen måste infektionshastigheten vara 10-30%. Tillsats av 0,1 μl eller 0,2 μl av det fluorescerande koncentrerade viruset kan bibehålla infektionseffektiviteten inom detta intervall. Den koncentrerade virustitern kan nå minst 1 × 108 givarenheter (TU)/ml. - Cirka 48 timmar efter infektion, tvätta skålen med 1 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna döda celler.
- Trypsinisera dessa celler med 250 μL 0,05% trypsin-EDTA per brunn i en 6-brunnsplatta i 1 min vid rumstemperatur. Centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid 4 °C och avlägsna sedan supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml PBS, tillsätt suspensionen till ett 5 ml polystyren runt bottenrör och detektera infektionseffektiviteten hos virusfluorescensen (grönt fluorescerande protein, GFP+) med hjälp av flödescytometri.
- Beräkna den koncentrerade virustitern med följande formel: 105 (cellvolym) × infektionshastighet (GFP+%)/adderad virusvolym (0,1 μl eller 0,2 μl).
2. Direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter (figur 2A)
- Täck en brunn på en 6-brunns cellodlingsplatta med 1 ml 0,1% gelatinlösning vid rumstemperatur i 15-30 minuter. Se till att brunnen är helt täckt med 0,1% gelatinlösning. Aspirera 0,1% gelatinlösning efter beläggning.
OBS: Förbered 0,1% gelatinlösning (100 ml) enligt följande: 0,1 g gelatinpulver löses i 100 ml ultrarent vatten i en autoklaverad glasflaska och förvaras sedan vid 4 °C i högst 2 månader. - Platta 5 × 104 MEFs till en brunn på en 6-brunnsplatta belagd med 0,1% gelatin (som i steg 2.1) och odla dessa celler med normalt medium vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 över natten.
- Efter 24 timmar, bekräfta att MEF: erna har nått 40-50% sammanflöde. Byt ut mediet mot normalt medium.
- På dag 0, ta ut det koncentrerade viruset från frysen och smält viruset på is. Beräkna volymen av det virus som ska tillsättas med hjälp av eq. Lägg till det koncentrerade viruset för de sex transkriptionsfaktorerna, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 och Snai2 (se materialtabell) till varje brunn enligt den beräknade volymen och tillsätt sedan 4 μg / ml av det katjoniska polymera transfektionsmedlet.
Cellnummer (5 × 104) × 30 (infektionsmängd, MOI)/virustiter (1) - På dag 1, 8-12 h efter infektion, ta bort mediet som innehåller viruset och ersätt det med färskt normalt medium medan du tillsätter 0,5 μg / ml puromycin för att screena stabila infekterade cellinjer.
- På dag 2, 48 h efter infektion, byt ut supernatantmediet gradvis med omprogrammeringsmediet. Ändra först 1/4av den totala medelvolymen och tillsätt 3 μM CHIR99021.
- Från dag 3 till dag 7, beroende på cellernas tillstånd, ändra mediet genom att ersätta med en högre andel omprogrammeringsmedium (se tabell 1) gradvis och växla till fullständigt omprogrammeringsmedium inom 5 dagar.
OBS: Under denna period måste puromycin och CHIR99021 användas varje dag. Många döda celler kommer att visas den första och andra dagen för att ändra omprogrammeringsmediet. Detta är normalt eftersom cellerna gradvis anpassar sig till omvandlingen. Därför måste mediet ändras gradvis för att säkerställa en hälsosam spridning av cellerna. - För att passera cellerna, tillsätt 500 μL 0,05% trypsin-EDTA för att smälta cellerna i 3 minuter vid rumstemperatur. När ~ 60% av cellerna har flytit upp, stoppa matsmältningen genom att tillsätta normalt medium 2x volymen av matsmältningsenzymet. Samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml sterilt koniskt rör, centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid 4 °C, avlägsna supernatanten, återsuspendera cellpelleten med omprogrammeringsmediet och platta cellerna i en 60 mm steril skål med en densitet av 3 × 104/cm2. Odla dessa celler vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-inkubator .
OBS: Från dag 8 till dag 21 subkultureras dessa celler var 3-5: e dag och odlas i 60 mm sterila rätter för att expandera. De kan odlas för att nå minst passage 5.
3. Optimering för direkt omprogrammering och identifiering
- Screening för de optimerade transkriptionsfaktorerna
- Upprepa steg 2.1-2.7, vilket minskar en av de sex transkriptionsfaktorerna varje gång. Infektera MEF med viruset med kombinationer av fem transkriptionsfaktorer.
- Sju dagar efter infektion, extrahera RNA för dessa celler16 och analysera uttrycksnivåerna för deras melanocytiska gener med hjälp av PCR (RT-PCR)17 för att screena för de transkriptionsfaktorer som har störst inverkan på omvandlingen till melanocyter genom att ta bort dem en efter en (Figur 3A).
- Använd de tre bästa transkriptionsfaktorerna som påverkar omvandlingen till melanocyter för att infektera MEF: erna. Upprepa steg 2.1–2.7.
OBS: Sju dagar efter infektion bör de melanocytiska generna vara detekterbara i dessa transformerade celler (figur 3B). Primerinformation för iMels-karakterisering ingår i tabell 3.
- Identifiering av inducerade melanocyter (iMels)
- Använd immunofluorescensfärgning18 för att verifiera att iMels uttrycker melanocytiska proteiner, inklusive TYRP-1 och DCT (figur 4A).
- Melaninspecifik färgning av 3,4-dihydroxifenylalanin (DOPA) (figur 4B)
- Förbered 4% paraformaldehyd (10 ml) enligt följande: lös upp 0,4 g paraformaldehydpulver i 10 ml PBS. Placera lösningen i en ugn vid 56 °C i 2 timmar för att främja upplösning.
OBS: Lösningen kan förvaras vid 4 °C i högst en månad. - Odla iMels i en 30 mm skål och tvätta skålen två gånger med förvärmd PBS. Tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd för att fixera cellerna i 20 minuter och tvätta skålen 3 gånger med PBS.
- Förbered 0,1% DOPA-fläcklösning (10 ml) strax före användning genom att lösa upp 0,01 g L-DOPA-pulver i 10 ml PBS. Placera lösningen i ett vattenbad vid 37 °C i 30 minuter. skaka det flera gånger för att främja upplösning.
- Tillsätt 1 ml nyberedd 0,1% DOPA-färgningslösning. Inkubera i ugn vid 37 °C i 2-5 timmar. Om det inte finns några brunsvarta partiklar, fortsätt att inkubera vid 37 °C i ytterligare 2 timmar men inte i >5 timmar. Kontrollera proverna var 30: e minut.
- Diska 3 gånger med PBS i 1 min varje gång. Färga kärnan med 1 ml hematoxylinfärgningslösning i 2 min.
- För långvarig lagring, dehydrera proverna med 95% etanol i 3 min och sedan 100% etanol i 5 min. Försegla skålen med xylen och neutral balsam.
- Förbered 4% paraformaldehyd (10 ml) enligt följande: lös upp 0,4 g paraformaldehydpulver i 10 ml PBS. Placera lösningen i en ugn vid 56 °C i 2 timmar för att främja upplösning.
- Melaninspecifik Masson-Fontana-färgning (figur 4B)
- Platta iMels i en 30 mm skål och fixa cellerna med 4% paraformaldehyd i 20 min; tvätta skålen 3 gånger med PBS.
- Tillsätt 1 ml lösning A (ammoniaksilverlösning) från Masson-Fontana färgsats (se materialtabell), placera skålen i en mörk låda och placera den mörka lådan i en ugn vid 56 °C i 15-40 min.
OBS: Om brunsvarta partiklar inte är synliga efter 15 minuter i ugnen, sätt tillbaka proverna i ugnen på 56 °C för att fortsätta inkubera men inte i >40 min. Lite vatten kan tillsättas i den mörka lådan för att förhindra uttorkning. - Aspirera lösning A och tvätta skålen 5-6 gånger med destillerat vatten, 1-2 min varje gång.
- Tillsätt 1 ml lösning B (hypolösning) från Masson-Fontana färgningssats och lämna skålen vid rumstemperatur i 3-5 minuter.
- Aspirera lösning B och tvätta skålen med kranvatten 3 gånger, 1 min varje gång.
- Tillsätt 1 ml lösning C (neutralt rött färgämne) från Masson-Fontana-färgningssatsen och lämna skålen vid rumstemperatur i 3-5 minuter.
- Aspirera lösning C och tvätta skålen 3 gånger med destillerat vatten, 1 min varje gång.
- Tillsätt 1 ml 100% etanol för snabb uttorkning och aspirera etanolen efter 3 min.
OBS: Färgade prover kan lagras under lång tid efter tätning med xylen och neutral balsam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna artikel innehåller protokollen för ett koncentrerat lentivirusförpackningssystem för att producera lentivirus av transkriptionsfaktorer för direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter och protokoll för screening för transkriptionsfaktorer och direkt omprogrammering av melanocyter från MEF.
Framgången för koncentrerad lentivirusproduktion utvärderades genom att observera fluorescensintensiteten hos GFP (figur 1A) eller genom flödescytometri (figur 1B) efter infektion av HEK-293T-celler i 48 timmar med okoncentrerat lentivirus (1x) och koncentrerat lentivirus (100x). Det koncentrerade virusets titer var 108 TU/ml eller mer, vilket är relativt högt (figur 1C).
Direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter uppnås genom infektion med transkriptionsfaktor lentivirus och transformation med det optimerade omprogrammeringsmediet. Schemat för generering av iMels från MEF visas i figur 2A. Cellmorfologi förändras gradvis under direkt omprogrammering. Cellsynapser blir långsträckta och cellkärnor förstoras. Dessa celler åldras dock gradvis efter ~ Dag 20 (~ 5 passager) (Figur 2B).
En transkriptionsfaktor togs bort i taget från den ursprungliga uppsättningen av sex transkriptionsfaktorer (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 och Snai2) för att bestämma transkriptionsfaktorn med störst inverkan på omprogrammering. Avlägsnande av Mitf, Pax3 eller Sox10 resulterade i tystnaden av uttrycket av melanocytiska gener Tyr, Tyrp1 och Mlana (figur 3A), vilket indikerar att dessa tre transkriptionsfaktorer hade störst inverkan på fibroblastomvandling till melanocyter. Uttrycket av melanocytiska gener inducerade genom direkt omprogrammering med tre transkriptionsfaktorer var högre än för alla sex transkriptionsfaktorer (figur 3B).
Slutligen identifierades egenskaperna hos de iMels som erhölls genom att använda detta optimerade system för direkt omprogrammering. Uttrycket av melanocytiska markörer (TYR, TYYP1) detekterades med immunofluorescerande färgning (figur 4A). Melaninspecifika färgningsmetoder, inklusive DOPA- och Masson-Fontana-färgning, visade också positiva resultat (figur 4B).
Figur 1: Produktion av koncentrerat virus och uppskattning av titer. (A) Fluorescensintensitet av GFP efter infektion av HEK-293T-celler med okoncentrerat lentivirus (1x) och koncentrerat lentivirus (100x) (B) Jämförelse av infektionshastigheterna för okoncentrerat lentivirus (1x) och koncentrerat lentivirus (100x) som detekterats med flödescytometri. (C) Titeruppskattning av koncentrerat lentivirus. Skalstänger = 250 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; TU = givare enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Generering av iMels från MEF. (A) Schematiskt diagram över iMels-generering. (B) Förändringar i cellmorfologi under omvandling från MEF till iMels vid direkt omprogrammering dag 0, dag 3, dag 10 och dag 20+. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: iMels = inducerade melanocyter; MEFs = musembryonala fibroblaster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Screening för optimerade transkriptionsfaktorer. (A) qRT-PCR för Tyr-, Tyrp1 - och Mlana mRNA-nivåer i celler som transducerats med fem transkriptionsfaktorer (en av de ursprungliga sex transkriptionsfaktorerna har tagits bort). MEF + EV och MEF + 6F används som negativ kontroll respektive positiv kontroll. mRNA-uttrycket normaliseras till Gapdh-uttryck . (B) qRT-PCR för Tyr,Tyrp1 och Mlana mRNA-nivåer i celler transducerade med de ursprungliga sex transkriptionsfaktorerna och med tre transkriptionsfaktorer. MEF, MEF + EV och MMC används som en tom, negativ kontroll respektive positiv kontroll. mRNA-nivåerna normaliseras till Gapdh-nivåer . Alla värden är medelvärde ± SD av tre oberoende experiment. Primersekvenserna visas i tabell 3. Förkortningar: qRT-PCR = kvantitativ pcr med omvänd transkription; MEF = embryonala fibroblaster hos möss, MEF+EV = musembryonala fibroblaster + tom vektor; MMC = musmelanocyt; 6F = sex transkriptionsfaktorer bestående av Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 och Snai2; 3F: tre transkriptionsfaktorer som omfattar Mitf, Pax3 och Sox10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Funktionell identifiering av iMels. (A) Immunfärgning av melanocytiska markörer (TYR, TYYP1) i iMels. Skalstreck = 50 μm. Se materialtabellen för utspädning av antikroppar som används i denna studie. (B) Masson-Fontana-färgning och DOPA-färgning. MEF och Melan-a-cellinjen används som negativ kontroll respektive positiv kontroll. Skalstreck = 50 μm. Förkortningar: iMels = inducerade melanocyter; DOPA = 3,4-dihydroxifenylalanin; MEF = musembryonsk fibroblast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponenter | Dos (koncentration, volym) | Slutlig koncentration | |
| Normalt medium (100 ml) | DMEM/HÖG GLUKOS | 89 ml | |
| Värmeinaktiverad FBS | 10 ml | ||
| Antibiotika (Penna / Strep) | 10000 U/ml, 1 ml | 100 U/ml | |
| Omprogrammeringsmedium (100 ml) | RPMI-1640 | 88 ml | |
| Värmeinaktiverad FBS | 10 ml | ||
| Rekombinant human SCF | 200 μg/ml, 50 μl | 100 ng/ml | |
| Rekombinant Human bFGF | 4 μg/ml, 250 μl | 10 ng/ml | |
| Rekombinant humant insulin | 10 mg/ml, 50 μl | 5 μg/ml | |
| EDN3 människa | 100 μM, 100 μl | 0,1 μM | |
| Koleratoxin | 0,3 mg/ml, 0,56 μl | 20 pM | |
| Phorbol 12-myristat 13-acetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hydrokortison | 100 μg/ml, 500 μl | 0,5 μg/ml | |
| Adenin | 40 mg/ml, 60 μl | 24 μg/ml |
Tabell 1: Komponenter i normala medier och omprogrammeringsmedier.
| Kulturrätt | Sådddensitet (celler / skål) | Medium (ml) | Plasmidsystem | Transfektionsreagens (μl) | ||
| Målplasmid (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabell 2: Uppgifter om förpackningssystemet för lentivirus.
| RT-PCR-primrar | |
| Mål | Primer uppsättningar |
| Gapdh | Framåt: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Omvänd: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Framåt: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Omvänd: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Framåt: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Omvänd: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Framåt: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Omvänd: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabell 3: Primerinformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virusets kvalitet är avgörande för framgången med direkt omprogrammering till melanocyter i detta protokoll. Metoden för förpackning och koncentration av virus i detta protokoll är enkel och lätt att upprepa och är inte beroende av något annat extra koncentrerat reagens. Detta protokoll kan följas framgångsrikt i de flesta laboratorier. För att säkerställa kvaliteten på det koncentrerade viruset behöver följande punkter särskild uppmärksamhet. En är cellstatusen för HEK-293T. Även om HEK-293T-celler är odödliga celler, måste cellerna som används för att göra det koncentrerade viruset vara friska celler inom 10 passager (titer minskar med högre passager).
En annan kritisk punkt är andelen av transfektionsreagenset (i detta fall lipofektamin) som används. Eftersom celler skadas efter tillsats av transfektionsreagenset måste förhållandet mellan reagenset och plasmiderna kontrolleras upprepade gånger för att säkerställa cellernas optimala tillstånd och virusets kvalitet. Förhållandet 2: 1 mellan transfektionsreagens och plasmider är mest lämpligt för HEK-293T-celler för förpackning av viruset i detta system. Dessutom kräver alla steg skonsam hantering under hela processen. Eftersom viruspartiklar kan absorberas efter beläggning, vilket påverkar virustitern, är det inte tillrådligt att belägga skålen med någon matris vid förpackning av viruset. På grund av möjligheten att lossa HEK-293T måste supernatanten bytas ut noggrant, särskilt när färskt medium tillsätts efter insamling av virussupernatanten efter 24 timmar. Några andra överväganden inkluderar celltäthet, längden på transfektionstiden och seruminnehållet i mediet. Det här är viktiga frågor som påverkar transfektionseffektiviteten. Villkoren som presenteras i detta protokoll är de mest lämpliga, baserat på resultat som erhållits efter många upprepade experiment.
Vid direkt omprogrammering till melanocyter är det viktigt att överväga tillståndet för de ursprungliga cell-MEF: erna och densiteten hos MEF som används för direkt omprogrammering. Innan den direkta omprogrammeringen påbörjas måste MEF odlas i icke-belagda cellodlingsrätter. Celler i proliferationsfasen (40-50% sammanflöde) bör väljas för direkt omprogrammering; infektionseffektiviteten minskar med ökande celltäthet. De omprogrammerade cellerna måste pläteras i gelatinbelagda odlingsrätter.
Den tid som krävs för att viruset ska infektera celler är också avgörande; för lång infektionstid kommer att försämra cellöverlevnaden, medan för kort infektionstid kommer att minska effektiviteten. Åtta timmar visade sig vara lämpligt för det koncentrerade viruset att infektera MEF i detta protokoll. Den sista kritiska punkten är det korrekta sättet att ändra omprogrammeringsmediet. MEF måste anpassa sig till ett nytt medium. Cellernas tillstånd måste kontrolleras varje dag, och mediet måste ändras noggrant beroende på cellstatus. Att ändra omprogrammeringsmediet för snabbt kommer att orsaka att ett stort antal celler dör.
Vid odling och subkulturering av iMels är cellernas passagetäthet kritisk. iMels behöver en relativt hög densitet för att upprätthålla tillväxten. Cellsynapser bör vara i kontakt med varandra för normal proliferation av dessa celler. Om densiteten är för låg kan cellerna sluta sprida sig. Här visade sig densiteten på 3 × 104/cm2 vara en lämplig passagetäthet för iMels. Efter 5 passager börjar iMels åldras (figur 2B); melaninet är mer moget vid denna tidpunkt, och de resulterande cellerna kan användas för immunofluorescens, DOPA eller Masson-Fontana-färgning. Tidigare passager av celler kan användas för RT-PCR eftersom uttrycket av gener kommer att förändras i ett relativt tidigt skede.
Även om direkt omprogrammering studeras i stor utsträckning finns det lite forskning om direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter. Olika studier har använt olika transkriptionsfaktorer 14,15, vilket leder till mycket förvirring. Detta protokoll förklarar hur man producerar koncentrerade virus av hög kvalitet och screenar flera transkriptionsfaktorer för att välja de viktigaste för direkt omprogrammering till melanocyter. Mediet kompletterades med näringsfaktorer för direkt omprogrammering till melanocyter i detta protokoll (tabell 2). Slutligen identifierades funktionella iMels framgångsrikt. Det tydliga och optimerade melanocyt direkta omprogrammeringssystemet kan ge nya behandlingsstrategier för depigmenteringssjukdomar som vitiligo.
Det finns dock fortfarande vissa begränsningar för tekniken som presenteras i den här artikeln. För det första är det utmanande att uppskatta effektiviteten i detta protokoll. CRISPR-Cas9-genredigering kan kombineras med detta protokoll för att slå in melanocytiska gener, såsom Tyr eller Tyrp-1, i de initiala cellerna för att observera andelen inducerade celler under omprogrammeringsprocessen. Dessutom kan lentivirusintroduktionssystemet som används i detta protokoll medföra risk för genrekombination och insättningsmutation19. I framtiden kan effektivare och säkrare introduktionsmetoder användas, såsom icke-virala rekombinanta proteinuttrycksvektorer eller mRNA-vektorer. Experimentet i detta protokoll är fortfarande på in vitro-stadiet . Nästa steg är att omprogrammera melanocyterna direkt in vivo, vilket gör att icke-pigmenterad hud blir pigmenterad och att använda det direkta omprogrammeringssystemet för att utforma en effektiv behandling av vitiligo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) och Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
