Summary
Her beskriver vi et optimeret direkte omprogrammeringssystem til melanocytter og et højeffektivt, koncentreret virusemballagesystem, der sikrer jævn direkte omprogrammering.
Abstract
Tabet af funktion af melanocytter fører til vitiligo, som alvorligt påvirker de berørte individers fysiske og mentale sundhed. I øjeblikket er der ingen effektiv langsigtet behandling for vitiligo. Derfor er det bydende nødvendigt at udvikle en bekvem og effektiv behandling af vitiligo. Regenerativ medicin teknologi til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter synes at være en lovende ny behandling af vitiligo. Dette indebærer direkte omprogrammering af patientens hudceller til funktionelle melanocytter for at hjælpe med at forbedre tabet af melanocytter hos patienter med vitiligo. Denne metode skal dog først testes på mus. Selvom direkte omprogrammering er meget udbredt, er der ingen klar protokol til direkte omprogrammering til melanocytter. Desuden er antallet af tilgængelige transkriptionsfaktorer overvældende.
Her præsenteres en koncentreret lentivirusemballagesystemprotokol til fremstilling af transkriptionsfaktorer valgt til omprogrammering af hudceller til melanocytter, herunder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 og Snai2. Museembryonale fibroblaster (MEF'er) blev inficeret med det koncentrerede lentivirus for alle disse transkriptionsfaktorer til direkte omprogrammering af MEF'erne til inducerede melanocytter (iMels) in vitro. Desuden blev disse transkriptionsfaktorer screenet, og systemet blev optimeret til direkte omprogrammering til melanocytter. Ekspressionen af de karakteristiske markører for melanin i iMels på gen- eller proteinniveau blev signifikant forøget. Disse resultater tyder på, at direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter kan være en vellykket ny terapeutisk strategi for vitiligo og bekræfte mekanismen for melanocytudvikling, hvilket vil danne grundlag for yderligere direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter in vivo.
Introduction
Vitiligo er en hudsygdom, der alvorligt påvirker de berørte personers fysiske og mentale sundhed. Af forskellige årsager, herunder metaboliske abnormiteter, oxidativ stress, generering af inflammatoriske mediatorer, celleafløsning og autoimmun respons, går de funktionelle melanocytter tabt, og udskillelsen af melanin stoppes, hvilket fører til udvikling af vitiligo 1,2. Denne tilstand forekommer bredt og er særlig problematisk i ansigtet. Den vigtigste behandling er den systemiske anvendelse af kortikosteroider og immunmodulatorer. Fototerapi kan bruges til systemiske eller lokale sygdomme, og der er kirurgiske behandlinger, såsom perforeret hudtransplantation og autolog melanocyttransplantation 3,4,5. Patienter, der bruger lægemiddelterapi og fototerapi, er imidlertid tilbøjelige til tilbagefald, og disse behandlinger har dårlige langsigtede terapeutiske virkninger. Kirurgisk behandling er traumatisk og kun moderat effektiv 2,6. Derfor er der behov for en ny og effektiv terapeutisk strategi for vitiligo.
Omprogrammeringen af inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) vender disse celler fra deres terminale tilstand til en pluripotent tilstand, en proces medieret af transkriptionsfaktorerne, Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc7. På grund af muligheden for tumorigenicitet og den lange produktionstid er denne teknologi imidlertid blevet mødt med skepsis, når den anvendes på kliniske indstillinger8. Direkte omprogrammering er en teknologi, der får en type terminalcelle til at omdanne til en anden type terminalcelle9. Denne proces opnås ved hjælp af egnede transkriptionsfaktorer. Forskellige celler er allerede blevet direkte omprogrammeret med succes, herunder kardiomyocytter10, neuroner11 og cochlear hårceller12. Nogle forskere har endda omprogrammeret hudvæv direkte in situ, som kan bruges til sårreparation13. Fordelene ved direkte omprogrammering omfatter reducerede ventetider og omkostninger, lavere risiko for kræft, færre etiske problemer og en bedre forståelse af den mekanisme, der ligger til grund for bestemmelse af celleskæbne9.
Selv om den direkte omprogrammeringsmetode anvendes i vid udstrækning, er der i øjeblikket ingen bestemt metode til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter, især på grund af de mange transkriptionsfaktorer, der skal betragtes som14,15. Transkriptionsfaktorerne, Mitf, Sox10 og Pax3, er blevet brugt til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter14. I modsætning hertil er kombinationen af MITF, PAX3, SOX2 og SOX9 også blevet brugt til direkte omprogrammering af hudceller til humane melanocytter i en anden undersøgelse15. I denne protokol blev det samme resultat opnået med kombinationen af Mitf, Sox10 og Pax3 til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter som beskrevet tidligere14. Udvikling af et system til at generere melanocytter fra andre hudceller kan give en ordning for omdannelse af andre hudceller af vitiligo-patienter til melanocytter. Derfor er det afgørende at konstruere en enkel og effektiv metode til denne direkte omprogrammering for at generere melanocytter med succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette arbejde blev godkendt af Laboratory Animal Management and Use Committee ved Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). Forsøgene blev udført i nøje overensstemmelse med de standarder, der er fastlagt af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Der var ingen eksperimenter, der involverede mennesker, så dette arbejde behøvede ikke godkendelse fra den humane forskningsetiske komité. Se materialetabellen for detaljer om reagenser.
1. Konstruktion af et koncentreret lentivirusemballagesystem til transkriptionsfaktorer
- Produktion af det koncentrerede virus (figur 1A, B)
- Plade 1,5 × 106 HEK-293T celler i en 60 mm skål og kultur disse celler med normalt medium (se tabel 1) ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2.
BEMÆRK: Hvis virussen skal pakkes i partier, kan der anvendes en 100 mm cellekulturskål (for detaljer, se tabel 2). - Efter 24 timer skal du sikre dig, at HEK-293T-cellerne har nået 80-90% sammenløb på transduktionsdagen, og udskift mediet med 3,5 ml DMEM (150 μL DMEM pr. 1 cm2). Lad cellerne stå ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5% CO2 i 2 timer.
BEMÆRK: Erstatningsmediet skal være serumfrit, så cellerne kan "sultes" for bedre plasmidtransfektion. - Forbered blandingen af plasmider (blanding A) indeholdende 3 μg af målplasmiderne af Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 eller Snai2; 1 μg af emballageplasmidet PMD2. G og 2 μg af emballageplasmidet PSPAX2. Volumenet af blanding A til 150 μL fyldes op med serumfri DMEM. Blandingen af transfektionsreagenset (blanding B) forberedes ved tilsætning af 12 μL transfektionsreagens (volumenet er dobbelt så stort som alle plasmidernes totalmasse), og volumenet af blanding B til 150 μL med serumfri DMEM.
BEMÆRK: Når du forbereder blandingerne, er det vigtigt at tilføje væske langsomt for at undgå luftbobler. - Kombiner blanding A og bland B efter at have ladet dem stå i 5 minutter ved stuetemperatur. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 20-30 minutter for at danne transfektionskomplekset.
- Tag HEK-293T-cellerne ud af inkubatoren, udskift mediet med DMEM + 2% FBS, tilsæt blandingen fra trin 1.1.4 dråbevis, og bland væsken forsigtigt.
- Efter 8 timer skal du ændre mediet med 3,5 ml normalt medium. Efter ændring af mediet skal du samle virussupernatanten hver 24. time og 48 timer.
- Bland virus supernatants indsamlet på to forskellige tidspunkter. Centrifuger ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C. Før supernatanten gennem 0,45 μm filtre og saml den i et 50 ml sterilt konisk rør.
BEMÆRK: Virus indsamlet ved 24 timer kan opbevares ved 4 °C og blandes med virus indsamlet ved 48 timer. - Koncentrer virussupernatanten ved centrifugering ved 6000 × g ved 4 °C natten over (~16 timer). Sørg for, at viruspillen er synlig i bunden af det koniske rør efter centrifugering.
- Hæld supernatanten langsomt ud. Opløs viruspillen i et volumen af normalt medium, der er 1/100af volumenet af virussupernatanten. Brug en P1000 mikropipette til at pipettere forsigtigt op og ned, indtil der opnås en homogen blanding. Opdel den koncentrerede virus i mikrocentrifugerør efter behov. Opbevares ved −80 °C.
BEMÆRK: Virussen er koncentreret 100x med denne metode. Den koncentrerede virus (100x) kan opbevares i >1 år ved -80 °C. Undgå gentagen frysning og optøning af virussen.
- Plade 1,5 × 106 HEK-293T celler i en 60 mm skål og kultur disse celler med normalt medium (se tabel 1) ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2.
- Påvisning af koncentreret virustitre (figur 1C)
- Plade 1 × 105 HEK-293T celler i en brønd af en 6-brønd plade. Husk at tilføje en brønd som en negativ kontrol. Disse celler med normalt medium ved 37 °C dyrkes i en befugtet inkubator med 5 % CO2.
- Der tilsættes 0,1 μL eller 0,2 μL fluorescerende koncentreret virus (100x) til hver brønd efter 24 timer, og der tilsættes 4 ng/μL af det kationiske polymertransfektionsreagens til hvert hul. Ca. 8-12 timer efter infektion skal du udskifte mediet med normalt medium.
BEMÆRK: For at sikre nøjagtigheden og effektiviteten af fluorescensdetektionen skal infektionshastigheden være 10-30%. Tilsætning af 0,1 μL eller 0,2 μL af den fluorescerende koncentrerede virus kan opretholde infektionseffektiviteten inden for dette interval. Den koncentrerede virustitre kan nå mindst 1 × 108 transducerende enheder (TU)/ml. - Ca. 48 timer efter infektion vaskes skålen med 1 ml steril fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne døde celler.
- Trypsiniser disse celler ved hjælp af 250 μL 0,05% trypsin-EDTA pr. Brønd i en 6-brøndplade i 1 minut ved stuetemperatur. Centrifuger ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes derefter.
- Resuspender cellepillen i 1 ml PBS, tilsæt suspensionen til et 5 ml polystyren rundbundet rør, og detemonstrer infektionseffektiviteten af virusfluorescensen (grønt fluorescerende protein, GFP +) ved hjælp af flowcytometri.
- Den koncentrerede virustitre beregnes ved hjælp af følgende formel: 105 (cellevolumen) × infektionshastighed (GFP+%)/tilsat virusvolumen (0,1 μL eller 0,2 μL).
2. Direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter (figur 2A)
- Overtræk en brønd af en 6-brønd cellekulturplade med 1 ml 0,1% gelatineopløsning ved stuetemperatur i 15-30 min. Sørg for, at brønden er helt dækket med 0,1% gelatineopløsningen. Opsuge 0,1% gelatineopløsningen efter belægning.
BEMÆRK: Der fremstilles 0,1 % gelatineopløsning (100 ml) som følger: 0,1 g gelatinepulver opløses i 100 ml ultrarent vand i en autoklaveret glasflaske og opbevares derefter ved 4 °C i højst 2 måneder. - Plade 5 × 104 MEF'er i en brønd af en 6-brøndplade belagt med 0,1% gelatine (som i trin 2.1), og kultur disse celler med normalt medium ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2 natten over.
- Efter 24 timer skal du bekræfte, at MEF'erne har nået 40-50% sammenløb. Udskift mediet med det normale medium.
- På dag 0 skal du tage den koncentrerede virus ud af fryseren og smelte virussen på is. Volumenet af den virus, der skal tilsættes, beregnes ved hjælp af eq. (1). Tilsæt den koncentrerede virus for de seks transkriptionsfaktorer, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 og Snai2 (se Materialetabel) til hver brønd i henhold til det beregnede volumen, og tilsæt derefter 4 μg / ml af det kationiske polymertransfektionsmiddel.
Cellenummer (5 × 104) × 30 (multiplikation af infektion, MOI)/virustitre (1) - På dag 1, 8-12 timer efter infektion, skal du fjerne mediet indeholdende virussen og erstatte det med frisk normalt medium, mens der tilsættes 0,5 μg / ml puromycin for at screene stabile inficerede cellelinjer.
- På dag 2, 48 timer efter infektion, skal du udskifte supernatantmediet gradvist med omprogrammeringsmediet. Skift først 1/4af det samlede mediumvolumen, og tilsæt 3 μM CHIR99021.
- Fra dag 3 til dag 7, afhængigt af cellernes tilstand, skal du ændre mediet ved gradvist at erstatte med en højere andel af omprogrammeringsmedium (se tabel 1) og skifte til komplet omprogrammeringsmedium inden for 5 dage.
BEMÆRK: I denne periode skal puromycin og CHIR99021 anvendes hver dag. Mange døde celler vises på den første og anden dag med at ændre omprogrammeringsmediet. Dette er normalt, da cellerne gradvist tilpasser sig transformationen. Derfor skal mediet ændres gradvist for at sikre en sund spredning af cellerne. - For at passere cellerne tilsættes 500 μL 0,05% trypsin-EDTA for at fordøje cellerne i 3 minutter ved stuetemperatur. Når ~ 60% af cellerne er flydt op, skal du stoppe fordøjelsen ved at tilføje normalt medium 2x volumenet af fordøjelsesenzymet. Cellesuspensionen opsamles i et 15 ml sterilt konisk rør, centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C, supernatanten fjernes, cellepillen genaktiveres med omprogrammeringsmediet, og cellerne anbringes i en 60 mm steril skål med en massefylde på 3 × 104/cm2. Disse celler dyrkes ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -inkubator.
BEMÆRK: Fra dag 8 til dag 21 subkultureres disse celler hver 3-5 dag og dyrkes i 60 mm sterile retter for at udvide sig. De kan dyrkes for at nå mindst passage 5.
3. Optimering til direkte omprogrammering og identifikation
- Screening for de optimerede transkriptionsfaktorer
- Gentag trin 2.1-2.7, og reducer en af de seks transkriptionsfaktorer hver gang. Inficere MEF'erne med virussen med kombinationer af fem transkriptionsfaktorer.
- Syv dage efter infektion ekstraheres RNA'et for disse celler16 og analyserer ekspressionsniveauerne for deres melanocytiske gener ved hjælp af omvendt transkription PCR (RT-PCR)17 for at screene for transkriptionsfaktorerne med den største indvirkning på omdannelse til melanocytter ved at fjerne dem en efter en (figur 3A).
- Brug de tre øverste transkriptionsfaktorer, der påvirker konverteringen til melanocytter, til at inficere MEF'erne. Gentag trin 2.1-2.7.
BEMÆRK: Syv dage efter infektion skal de melanocytiske gener kunne påvises i disse transformerede celler (figur 3B). Primeroplysninger til iMels-karakterisering er inkluderet i tabel 3.
- Identifikation af inducerede melanocytter (iMels)
- Brug immunfluorescensfarvning18 til at kontrollere, at iMels udtrykker melanocytiske proteiner, herunder TYRP-1 og DCT (figur 4A).
- Melaninspecifik farvning af 3,4-dihydroxyphenylalanin (DOPA) (figur 4B)
- 4% paraformaldehyd (10 ml) fremstilles som følger: 0,4 g paraformaldehydpulver opløses i 10 ml PBS. Opløsningen anbringes i en ovn ved 56 °C i 2 timer for at fremme opløsningen.
BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares ved 4 °C i højst en måned. - Kultur iMels i en 30 mm skål og vask fadet to gange med forvarmet PBS. Tilsæt 1 ml 4% paraformaldehyd for at fiksere cellerne i 20 minutter, og vask fadet 3 gange med PBS.
- 0,1% DOPA-pletopløsning (10 ml) fremstilles lige før brug ved at opløse 0,01 g L-DOPA-pulver i 10 ml PBS. Opløsningen anbringes i et vandbad ved 37 °C i 30 minutter. ryst det flere gange for at fremme opløsning.
- Tilsæt 1 ml frisklavet 0,1% DOPA-farvningsopløsning. Inkuberes i en ovn ved 37 °C i 2-5 timer. Hvis der ikke er brunsorte partikler, fortsættes med at inkubere ved 37 °C i yderligere 2 timer, men ikke i >5 timer. Kontroller prøverne hvert 30. minut.
- Vask fadet 3 gange med PBS i 1 min hver gang. Fars kernen med 1 ml hæmatoxylinfarvningsopløsning i 2 minutter.
- Til langtidsopbevaring dehydreres prøverne med 95% ethanol i 3 minutter og derefter 100% ethanol i 5 minutter. Forsegl skålen med xylen og neutral balsam.
- 4% paraformaldehyd (10 ml) fremstilles som følger: 0,4 g paraformaldehydpulver opløses i 10 ml PBS. Opløsningen anbringes i en ovn ved 56 °C i 2 timer for at fremme opløsningen.
- Melanin-specifik Masson-Fontana-farvning (figur 4B)
- Plade iMels i en 30 mm skål og fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd i 20 minutter; vask fadet 3 gange med PBS.
- Tilsæt 1 ml opløsning A (ammoniaksølvopløsning) fra Masson-Fontana-farvningssættet (se Materialetabel), læg fadet i en mørk kasse, og sæt den mørke kasse i en ovn ved 56 °C i 15-40 min.
BEMÆRK: Hvis brunsorte partikler ikke er synlige efter 15 minutter i ovnen, skal du returnere prøverne til ovnen på 56 °C for at fortsætte med at inkubere, men ikke i >40 minutter. Noget vand kan tilsættes til den mørke kasse for at forhindre udtørring. - Aspirer opløsning A og vask fadet 5-6 gange med destilleret vand, 1-2 min hver gang.
- Tilsæt 1 ml opløsning B (hypoopløsning) fra Masson-Fontana-farvningssættet, og lad skålen stå ved stuetemperatur i 3-5 min.
- Aspirer opløsning B og vask fadet med ledningsvand 3 gange, 1 min hver gang.
- Tilsæt 1 ml opløsning C (neutralt rødt farvestof) fra Masson-Fontana-farvningssættet, og lad fadet stå ved stuetemperatur i 3-5 min.
- Aspirer opløsning C og vask fadet 3 gange med destilleret vand, 1 min hver gang.
- Tilsæt 1 ml 100% ethanol til hurtig dehydrering, og opsuger ethanolen efter 3 min.
BEMÆRK: Farvede prøver kan opbevares i lang tid efter forsegling med xylen og neutral balsam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikel indeholder protokollerne for et koncentreret lentivirusemballagesystem til fremstilling af lentivirus af transkriptionsfaktorer til direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter og protokoller til screening for transkriptionsfaktorer og direkte omprogrammering af melanocytter fra MEF'er.
Succesen med koncentreret lentivirusproduktion blev evalueret ved at observere fluorescensintensiteten af GFP (figur 1A) eller ved flowcytometri (figur 1B) efter infektion af HEK-293T-celler i 48 timer med ukoncentreret lentivirus (1x) og koncentreret lentivirus (100x). Titeren af det koncentrerede virus var 108 TU/ml eller mere, hvilket er relativt højt (figur 1C).
Direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter opnås gennem infektion med transkriptionsfaktor lentivirus og transformation med det optimerede omprogrammeringsmedium. Ordningen for generering af iMels fra MEF'er er vist i figur 2A. Cellemorfologi ændres gradvist under direkte omprogrammering. Cellesynapser bliver aflange, og cellekerner forstørres. Imidlertid ældes disse celler gradvist efter ~ dag 20 (~ 5 passager) (figur 2B).
En transkriptionsfaktor blev fjernet ad gangen fra det oprindelige sæt af seks transkriptionsfaktorer (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 og Snai2) for at bestemme transkriptionsfaktoren med størst indflydelse på omprogrammering. Fjernelse af Mitf, Pax3 eller Sox10 resulterede i dæmpning af ekspressionen af melanocytiske gener Tyr, Tyrp1 og Mlana (figur 3A), hvilket indikerer, at disse tre transkriptionsfaktorer havde den største indvirkning på fibroblastkonvertering til melanocytter. Ekspressionen af melanocytiske gener induceret ved direkte omprogrammering med tre transkriptionsfaktorer var højere end for alle seks transkriptionsfaktorer (figur 3B).
Endelig blev egenskaberne ved iMels opnået ved anvendelse af dette optimerede system med direkte omprogrammering identificeret. Ekspressionen af melanocytiske markører (TYR, TYYP1) blev påvist ved anvendelse af immunofluorescerende farvning (figur 4A). Melaninspecifikke farvningsmetoder, herunder DOPA- og Masson-Fontana-farvning, viste også positive resultater (figur 4B).
Figur 1: Produktion af koncentreret virus og estimering af titer. (A) Fluorescensintensitet af GFP efter infektion af HEK-293T-celler med ukoncentreret lentivirus (1x) og koncentreret lentivirus (100x) (B) Sammenligning af infektionshastighederne for ukoncentreret lentivirus (1x) og koncentreret lentivirus (100x) som påvist ved flowcytometri. (C) Titer-estimering af koncentreret lentivirus. Skalastænger = 250 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; TU = transducerende enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Generering af iMels fra MEF'er. (A) Skematisk diagram over iMels-generering. (B) Ændringer i cellemorfologi under konvertering fra MEF'er til iMels ved direkte omprogrammering på dag 0, dag 3, dag 10 og dag 20+. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: iMels = inducerede melanocytter; MEF'er = mus embryonale fibroblaster. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Screening for optimerede transkriptionsfaktorer. (A) qRT-PCR af Tyr, Tyrp1 og Mlana mRNA-niveauer i celler transduceret med fem transkriptionsfaktorer (en af de oprindelige seks transkriptionsfaktorer er fjernet). MEF + EV og MEF + 6F bruges som henholdsvis negativ kontrol og positiv kontrol. mRNA-udtrykket normaliseres til Gapdh-udtryk . (B) qRT-PCR af Tyr, Tyrp1 og Mlana mRNA-niveauer i celler transduceret med de oprindelige seks transkriptionsfaktorer og med tre transkriptionsfaktorer. MEF, MEF + EV og MMC bruges som henholdsvis en tom, negativ kontrol og positiv kontrol. mRNA-niveauerne normaliseres til Gapdh-niveauer . Alle værdier er middelværdier ± SD af tre uafhængige eksperimenter. Grundsekvenserne er vist i tabel 3. Forkortelser: qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkription PCR; MEF = mus embryonale fibroblaster; MEF + EV = museembrynale fibroblaster + tom vektor; MMC = musemelanocyt; 6F = seks transkriptionsfaktorer bestående af Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 og Snai2; 3F: tre transkriptionsfaktorer bestående af Mitf, Pax3 og Sox10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Funktionel identifikation af iMels. (A) Immunostaining af melanocytiske markører (TYR, TYYP1) i iMels. Skala bar = 50 μm. Se tabellen over materialer til fortynding af antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse. (B) Masson-Fontana farvning og DOPA farvning. MEF og Melan-a-cellelinjen bruges som henholdsvis negativ kontrol og positiv kontrol. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: iMels = inducerede melanocytter; DOPA = 3,4-dihydroxyphenylalanin; MEF = mus embryonal fibroblast. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponenter | Dosis (koncentration, volumen) | Endelig koncentration | |
| Normal medium (100 ml) | DMEM/HØJT GLUKOSEINDHOLD | 89 ml | |
| Varmeinaktiveret FBS | 10 ml | ||
| Antibiotika (Pen / Strep) | 10000 U/ml, 1 ml | 100 U/ML | |
| Omprogrammeringsmedium (100 ml) | Rpmi-1640 | 88 ml | |
| Varmeinaktiveret FBS | 10 ml | ||
| Rekombinant human SCF | 200 μg/ml, 50 μL | 100 ng/ml | |
| Rekombinant Human bFGF | 4 μg/ml, 250 μL | 10 ng/ml | |
| Rekombinant humant insulin | 10 mg/ml, 50 μL | 5 μg/ml | |
| EDN3 menneske | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Koleratoksin | 0,3 mg/ml, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-myristat 13-acetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nm | |
| Hydrocortison | 100 μg/ml, 500 μL | 0,5 μg/ml | |
| Adenin | 40 mg/ml, 60 μL | 24 μg/ml |
Tabel 1: Komponenter af normale og omprogrammerende medier.
| Kulturret | Frøtæthed (celler/skål) | Medium (ml) | Plasmid System | Transfektionsreagens (μL) | ||
| Målplasmid (μg) | Pmd2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabel 2: Oplysninger om lentivirusemballagesystemet.
| RT-PCR primere | |
| Mål | Primer sæt |
| Måbede | Fremad: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Bagside: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Angriber: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Bagside: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Angriber: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Bagside: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Fremad: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Bagside: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabel 3: Oplysninger om grundværdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virusets kvalitet er afgørende for succesen med direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokol. Metoden til emballering og koncentration af vira i denne protokol er enkel og nem at gentage og er ikke afhængig af noget andet hjælpekoncentreret reagens. Denne protokol kan følges med succes i de fleste laboratorier. For at sikre kvaliteten af den koncentrerede virus kræver følgende punkter særlig opmærksomhed. Den ene er cellestatus for HEK-293T. Selvom HEK-293T-celler er udødeliggjorte celler, skal cellerne, der bruges til at fremstille den koncentrerede virus, være sunde celler inden for 10 passager (titeren falder med højere passager).
Et andet kritisk punkt er andelen af det anvendte transfektionsreagens (i dette tilfælde lipofectamin). Da celler beskadiges efter tilsætning af transfektionsreagenset, skal forholdet mellem reagens og plasmider kontrolleres gentagne gange for at sikre cellernes optimale tilstand og virusets kvalitet. 2: 1-forholdet mellem transfektionsreagens og plasmider er bedst egnet til HEK-293T-celler til emballering af virussen i dette system. Derudover kræver alle trin skånsom håndtering gennem hele processen. Da viruspartikler kan absorberes efter belægning, hvilket påvirker virustitreren, er det ikke tilrådeligt at belægge skålen med nogen matrix, når viruset pakkes. På grund af muligheden for løsrivelse af HEK-293T skal supernatanten udskiftes omhyggeligt, især når frisk medium tilsættes efter opsamling af virussupernatanten efter 24 timer. Nogle andre overvejelser inkluderer celletæthed, længden af transfektionstiden og serumindholdet i mediet. Dette er vigtige spørgsmål, der påvirker transfektionseffektiviteten. Betingelserne i denne protokol er de mest egnede, baseret på resultater opnået efter mange gentagne forsøg.
I processen med direkte omprogrammering til melanocytter er det vigtigt at overveje tilstanden af de oprindelige celle-MEF'er og densiteten af MEF'er, der anvendes til direkte omprogrammering. Før den direkte omprogrammering påbegyndes, skal MEF'er dyrkes i ikke-coatede cellekulturskåle. Celler i proliferationsfasen (40-50% sammenløb) bør vælges til direkte omprogrammering; infektionseffektiviteten falder med stigende celletæthed. De omprogrammerede celler skal belagt i gelatinebelagte kulturfade.
Den tid, der er nødvendig for, at virussen kan inficere celler, er også kritisk; for lang infektionstid vil forringe celleoverlevelsen, mens for kort infektionstid vil reducere effektiviteten. Otte timer viste sig at være passende for den koncentrerede virus at inficere MEF'er i denne protokol. Det sidste kritiske punkt er den korrekte måde at ændre omprogrammeringsmediet på. MEF'er skal tilpasse sig et nyt medium. Cellernes tilstand skal kontrolleres hver dag, og mediet skal ændres omhyggeligt i henhold til cellestatus. Ændring af omprogrammeringsmediet for hurtigt vil medføre, at et stort antal celler dør.
Ved dyrkning og subkulturering af iMels er cellernes passagetæthed kritisk. iMels har brug for en relativt høj densitet for at opretholde væksten. Cellesynapser bør være i kontakt med hinanden for normal proliferation af disse celler. Hvis densiteten er for lav, kan cellerne stoppe med at sprede sig. Her viste densiteten på 3 × 104/cm2 sig at være en passende passagetæthed for iMels. Efter 5 passager begynder iMels aldring (figur 2B); melanin er mere moden på dette tidspunkt, og de resulterende celler kan bruges til immunfluorescens, DOPA eller Masson-Fontana farvning. Tidligere passager af celler kan bruges til RT-PCR, fordi ekspressionen af gener vil ændre sig på et relativt tidligt stadium.
Selvom direkte omprogrammering er bredt undersøgt, er der lidt forskning om direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter. Forskellige undersøgelser har brugt forskellige transkriptionsfaktorer14,15, hvilket fører til meget forvirring. Denne protokol forklarer, hvordan man producerer koncentrerede vira af høj kvalitet og screener flere transkriptionsfaktorer for at vælge de vigtigste til direkte omprogrammering til melanocytter. Mediet blev suppleret med ernæringsmæssige faktorer til direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokol (tabel 2). Endelig blev funktionelle iMels identificeret med succes. Det klare og optimerede melanocyt direkte omprogrammeringssystem kan give nye behandlingsstrategier for depigmenteringssygdomme som vitiligo.
Der er dog stadig nogle begrænsninger for den teknologi, der præsenteres i denne artikel. For det første er det udfordrende at estimere effektiviteten af denne protokol. CRISPR-Cas9 genredigering kunne kombineres med denne protokol for at banke melanocytiske gener, såsom Tyr eller Tyrp-1, ind i de indledende celler for at observere procentdelen af inducerede celler under omprogrammeringsprocessen. Derudover kan lentivirusindføringssystemet, der anvendes i denne protokol, medføre risiko for genkombination og indsættelsesmutation19. I fremtiden kan der anvendes mere effektive og sikrere introduktionsmetoder, såsom ikke-virale rekombinante proteinekspressionsvektorer eller mRNA-vektorer. Eksperimentet i denne protokol er stadig på in vitro-stadiet . Det næste trin er at omprogrammere melanocytterne direkte in vivo, hvilket får ikke-pigmenteret hud til at blive pigmenteret og at bruge det direkte omprogrammeringssystem til at designe en effektiv behandling af vitiligo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) og Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
