Summary
Qui descriviamo un sistema di riprogrammazione diretta ottimizzato per i melanociti e un sistema di confezionamento dei virus concentrato ad alta efficienza che garantisce una riprogrammazione diretta senza intoppi.
Abstract
La perdita di funzione dei melanociti porta alla vitiligine, che influisce seriamente sulla salute fisica e mentale degli individui colpiti. Attualmente, non esiste un trattamento efficace a lungo termine per la vitiligine. Pertanto, è imperativo sviluppare un trattamento conveniente ed efficace per la vitiligine. La tecnologia di medicina rigenerativa per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti sembra essere un nuovo promettente trattamento della vitiligine. Ciò comporta la riprogrammazione diretta delle cellule cutanee del paziente in melanociti funzionali per aiutare a migliorare la perdita di melanociti nei pazienti con vitiligine. Tuttavia, questo metodo deve essere prima testato sui topi. Sebbene la riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzata, non esiste un protocollo chiaro per la riprogrammazione diretta in melanociti. Inoltre, il numero di fattori di trascrizione disponibili è schiacciante.
Qui, viene presentato un protocollo di sistema di confezionamento di lentivirus concentrato per produrre fattori di trascrizione selezionati per riprogrammare le cellule della pelle in melanociti, tra cui Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati infettati dal lentivirus concentrato per tutti questi fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta dei MEF in melanociti indotti (iMels) in vitro. Inoltre, questi fattori di trascrizione sono stati sottoposti a screening e il sistema è stato ottimizzato per la riprogrammazione diretta ai melanociti. L'espressione dei marcatori caratteristici della melanina in iMels a livello genico o proteico è stata significativamente aumentata. Questi risultati suggeriscono che la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti potrebbe essere una nuova strategia terapeutica di successo per la vitiligine e confermare il meccanismo di sviluppo dei melanociti, che fornirà la base per un'ulteriore riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti in vivo.
Introduction
La vitiligine è una malattia della pelle che colpisce seriamente la salute fisica e mentale degli individui colpiti. Per vari motivi, tra cui anomalie metaboliche, stress ossidativo, generazione di mediatori infiammatori, distacco cellulare e risposta autoimmune, i melanociti funzionali vengono persi e la secrezione di melanina viene interrotta, portando allo sviluppo della vitiligine 1,2. Questa condizione si verifica ampiamente ed è particolarmente problematica sul viso. Il trattamento principale è l'uso sistemico di corticosteroidi e immunomodulatori. La fototerapia può essere utilizzata per malattie sistemiche o locali e ci sono trattamenti chirurgici, come il trapianto di pelle perforata e il trapianto di melanociti autologhi 3,4,5. Tuttavia, i pazienti che usano la terapia farmacologica e la fototerapia sono inclini a ricadute e questi trattamenti hanno scarsi effetti terapeutici a lungo termine. Il trattamento chirurgico è traumatico e solo moderatamente efficace 2,6. Pertanto, è necessaria una nuova ed efficace strategia terapeutica per la vitiligine.
La riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) inverte queste cellule dal loro stato terminale a uno stato pluripotente, un processo mediato dai fattori di trascrizione, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. Tuttavia, a causa della possibilità di tumorigenicità e del lungo tempo di produzione, questa tecnologia è stata accolta con scetticismo quando applicata a contesti clinici8. La riprogrammazione diretta è una tecnologia che fa sì che un tipo di cella terminale si trasformi in un altro tipo di cella terminale9. Questo processo è ottenuto da fattori di trascrizione adeguati. Varie cellule sono già state riprogrammate direttamente con successo, tra cui cardiomiociti10, neuroni11 e cellule ciliate cocleari12. Alcuni ricercatori hanno persino riprogrammato il tessuto cutaneo direttamente in situ, che può essere utilizzato per la riparazione delle ferite13. I vantaggi della riprogrammazione diretta includono tempi e costi di attesa ridotti, minor rischio di cancro, meno problemi etici e una migliore comprensione del meccanismo alla base della determinazione del destino cellulare9.
Sebbene il metodo della riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzato, attualmente non esiste un metodo definito per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti, soprattutto a causa dei numerosi fattori di trascrizione da considerare14,15. I fattori di trascrizione, Mitf, Sox10 e Pax3, sono stati utilizzati per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti14. Al contrario, la combinazione di MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 è stata utilizzata anche per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti umani in un altro studio15. In questo protocollo, nonostante l'uso di un diverso metodo di screening, lo stesso risultato è stato ottenuto con la combinazione di Mitf, Sox10 e Pax3 per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti come descritto in precedenza14. Lo sviluppo di un sistema per generare melanociti da altre cellule della pelle può fornire uno schema per trasformare altre cellule della pelle dei pazienti con vitiligine in melanociti. Quindi, è fondamentale costruire un metodo semplice ed efficiente per questa riprogrammazione diretta per generare melanociti con successo.
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Protocol
Questo lavoro è stato approvato dal Comitato per la gestione e l'uso degli animali da laboratorio presso l'Università di Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Gli esperimenti sono stati eseguiti in stretta conformità con gli standard stabiliti dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Non c'erano esperimenti che coinvolgevano esseri umani, quindi questo lavoro non aveva bisogno dell'approvazione del comitato etico della ricerca umana. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti.
1. Costruzione di un sistema di confezionamento concentrato di lentivirus per fattori di trascrizione
- Produzione del virus concentrato (Figura 1A, B)
- Piastra 1,5 × 106 celle HEK-293T in un piatto da 60 mm e colturare queste cellule con mezzo normale (vedi Tabella 1) a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.
NOTA: se il virus deve essere confezionato in lotti, è possibile utilizzare una parabola di coltura cellulare da 100 mm (per i dettagli, vedere la Tabella 2). - Dopo 24 ore, assicurarsi che le cellule HEK-293T abbiano raggiunto l'80-90% di confluenza il giorno della trasduzione e sostituire il mezzo con 3,5 mL di DMEM (150 μL di DMEM per 1 cm2). Lasciare le celle a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 per 2 ore.
NOTA: Il mezzo sostitutivo deve essere privo di siero, in modo che le cellule possano essere "affamate" per una migliore trasfezione del plasmide. - Preparare la miscela di plasmidi (miscela A) contenente 3 μg dei plasmidi bersaglio di Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 o Snai2; 1 μg del plasmide di imballaggio PMD2. G, e 2 μg del plasmide di imballaggio PSPAX2. Aumentare il volume della miscela A a 150 μL con DMEM senza siero. Preparare la miscela del reagente di trasfezione (miscela B) aggiungendo 12 μL del reagente di trasfezione (il volume è il doppio della massa totale di tutti i plasmidi) e portare il volume della miscela B a 150 μL con DMEM privo di siero.
NOTA: Quando si preparano le miscele, è importante aggiungere il liquido lentamente per evitare bolle d'aria. - Unire mescolare A e mescolare B dopo averli lasciati riposare per 5 minuti a temperatura ambiente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 minuti per formare il complesso di trasfezione.
- Estrarre le celle HEK-293T dall'incubatore, sostituire il mezzo con DMEM + 2% FBS, aggiungere la miscela dal passaggio 1.1.4 a goccia e mescolare delicatamente il liquido.
- Dopo 8 ore, cambiare il mezzo con 3,5 ml di mezzo normale. Dopo aver cambiato il mezzo, raccogliere il surnatante del virus ogni 24 ore e 48 ore.
- Mescolare i supernatanti virali raccolti in due diversi punti temporali. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Passare il surnatante attraverso filtri da 0,45 μm e raccoglierlo in un tubo conico sterile da 50 ml.
NOTA: Il virus raccolto a 24 ore può essere conservato a 4 °C e miscelato con il virus raccolto a 48 ore. - Concentrare il surnatante virale centrifugando a 6000 × g a 4 °C durante la notte (~16 h). Assicurarsi che il pellet di virus sia visibile nella parte inferiore del tubo conico dopo la centrifugazione.
- Versare lentamente il surnatante. Sciogliere il pellet virale in un volume di mezzo normale che è 1/100 ° del volume del surnatante del virus. Utilizzando una micropipetta P1000, pipettare su e giù delicatamente fino ad ottenere una miscela omogenea. Dividere il virus concentrato in tubi di microcentrifuga, se necessario. Conservare a -80 °C.
NOTA: il virus è concentrato 100 volte con questo metodo. Il virus concentrato (100x) può essere conservato per >1 anno a -80 °C. Evitare il congelamento ripetuto e lo scongelamento del virus.
- Piastra 1,5 × 106 celle HEK-293T in un piatto da 60 mm e colturare queste cellule con mezzo normale (vedi Tabella 1) a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.
- Rilevamento del titolo virale concentrato (Figura 1C)
- La piastra 1 × 105 celle HEK-293T in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Ricorda di aggiungerne uno bene come controllo negativo. Coltivare queste cellule con mezzo normale a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2.
- Aggiungere 0,1 μL o 0,2 μL di virus fluorescente concentrato (100x) a ciascun pozzetto dopo 24 ore e aggiungere 4 ng/μL del reagente cationico polimerico trasfezione a ciascun pozzetto. Circa 8-12 ore dopo l'infezione, sostituire il mezzo con un mezzo normale.
NOTA: per garantire l'accuratezza e l'efficienza del rilevamento della fluorescenza, il tasso di infezione deve essere del 10-30%. L'aggiunta di 0,1 μL o 0,2 μL del virus fluorescente concentrato può mantenere l'efficienza dell'infezione entro questo intervallo. Il titolo del virus concentrato può raggiungere almeno 1 × 108 unità trasduttori (TU)/mL. - Circa 48 ore dopo l'infezione, lavare il piatto con 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere le cellule morte.
- Tripsinizzare queste cellule utilizzando 250 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C e poi rimuovere il surnatante.
- Risospesso il pellet cellulare in 1 mL di PBS, aggiungere la sospensione a un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL e rilevare l'efficienza di infezione della fluorescenza del virus (proteina fluorescente verde, GFP+) utilizzando la citometria a flusso.
- Calcolare il titolo del virus concentrato utilizzando la seguente formula: 105 (volume cellulare) × tasso di infezione (GFP +%) / volume di virus aggiunto (0,1 μL o 0,2 μL).
2. Riprogrammazione diretta dei fibroblasti ai melanociti (Figura 2A)
- Rivestire un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione di gelatina allo 0,1% a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Assicurarsi che il pozzo sia completamente coperto con la soluzione di gelatina allo 0,1%. Aspirare la soluzione di gelatina allo 0,1% dopo il rivestimento.
NOTA: Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% (100 ml) come segue: 0,1 g di gelatina in polvere vengono sciolti in 100 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro autoclavata e quindi conservati a 4 °C per non più di 2 mesi. - La piastra 5 × 104 MEF in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita con gelatina allo 0,1% (come nel passaggio 2.1) e coltiva queste cellule con mezzo normale a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 durante la notte.
- Dopo 24 ore, confermare che i MEF hanno raggiunto il 40-50% di confluenza. Sostituire il mezzo con il mezzo normale.
- Il giorno 0, estrarre il virus concentrato dal congelatore e sciogliere il virus sul ghiaccio. Calcolare il volume del virus da aggiungere utilizzando eq. (1). Aggiungere il virus concentrato per i sei fattori di trascrizione, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2 (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto in base al volume calcolato, quindi aggiungere 4 μg/mL dell'agente di trasfezione polimerica cationica.
Numero di cellule (5 × 104) × 30 (molteplicità di infezione, MOI)/titolo virale (1) - Il giorno 1, 8-12 ore dopo l'infezione, rimuovere il mezzo contenente il virus e sostituirlo con un mezzo normale fresco aggiungendo 0,5 μg / mL di puromicina per lo screening di linee cellulari infette stabili.
- Il giorno 2, 48 ore dopo l'infezione, sostituire gradualmente il mezzo surnatante con il mezzo di riprogrammazione. Innanzitutto, modificare 1/4 del volume medio totale e aggiungere 3 μM CHIR99021.
- Dal giorno 3 al giorno 7, a seconda delle condizioni delle cellule, cambiare gradualmente il mezzo sostituendolo con una percentuale maggiore di mezzo di riprogrammazione (vedi Tabella 1) e passare gradualmente al mezzo di riprogrammazione completo entro 5 giorni.
NOTA: Durante questo periodo, puromicina e CHIR99021 devono essere utilizzati tutti i giorni. Molte cellule morte appariranno il primo e il secondo giorno di cambio del mezzo di riprogrammazione. Questo è normale in quanto le cellule si adattano gradualmente alla trasformazione. Pertanto, il mezzo deve essere cambiato gradualmente per garantire la sana proliferazione delle cellule. - Per far passare le cellule, aggiungere 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per digerire le cellule per 3 minuti a temperatura ambiente. Quando ~ 60% delle cellule hanno galleggiato, interrompere la digestione aggiungendo mezzo normale 2 volte il volume dell'enzima digestivo. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 mL, centrifugare a 200 × g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, risospese il pellet cellulare con il mezzo di riprogrammazione e placcare le cellule in una parabola sterile da 60 mm ad una densità di 3 × 104/cm2. Coltiva queste cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .
NOTA: Dal giorno 8 al giorno 21, queste cellule vengono sottocolturate ogni 3-5 giorni e coltivate in piatti sterili da 60 mm per espandersi. Possono essere coltivati per raggiungere almeno il passaggio 5.
3. Ottimizzazione per la riprogrammazione diretta e l'identificazione
- Screening per i fattori di trascrizione ottimizzati
- Ripetere i passaggi 2.1-2.7, riducendo ogni volta uno dei sei fattori di trascrizione. Infettare i MEF con il virus con combinazioni di cinque fattori di trascrizione.
- Sette giorni dopo l'infezione, estrarre l'RNA di queste cellule16 e analizzare i livelli di espressione dei loro geni melanocitici utilizzando la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR)17 per lo screening dei fattori di trascrizione con il maggiore impatto sulla conversione in melanociti rimuovendoli uno per uno (Figura 3A).
- Utilizzare i primi tre fattori di trascrizione che influenzano la conversione in melanociti per infettare i MEF. Ripetere i passaggi 2.1-2.7.
NOTA: Sette giorni dopo l'infezione, i geni melanocitici devono essere rilevabili in queste cellule trasformate (Figura 3B). Le informazioni di base per la caratterizzazione di iMels sono incluse nella Tabella 3.
- Identificazione dei melanociti indotti (iMels)
- Utilizzare la colorazione a immunofluorescenza18 per verificare che gli iMels esprimano proteine melanocitiche, tra cui TYRP-1 e DCT (Figura 4A).
- Colorazione della 3,4-diidrossifenilalanina (DOPA) specifica della melanina (Figura 4B)
- Preparare il 4% di paraformaldeide (10 ml) come segue: sciogliere 0,4 g di polvere di paraformaldeide in 10 ml di PBS. Mettere la soluzione in forno a 56 °C per 2 ore per favorire la dissoluzione.
NOTA: La soluzione può essere conservata a 4 °C per non più di un mese. - Coltivare gli iMels in un piatto da 30 mm e lavare il piatto due volte con PBS preriscaldato. Aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% per fissare le cellule per 20 minuti e lavare il piatto 3 volte con PBS.
- Preparare la soluzione colorante allo 0,1% di DOPA (10 ml) appena prima dell'uso sciogliendo 0,01 g di polvere di L-DOPA in 10 ml di PBS. Porre la soluzione a bagnomaria a 37 °C per 30 min; scuoterlo più volte per favorire la dissoluzione.
- Aggiungere 1 mL di soluzione colorante allo 0,1% DOPA preparata al momento. Incubare in forno a 37 °C per 2-5 ore. Se non ci sono particelle bruno-nere, continuare a incubare a 37 °C per altre 2 ore ma non per >5 ore. Controllare i campioni ogni 30 minuti.
- Lavare il piatto 3 volte con PBS per 1 minuto ogni volta. Macchiare il nucleo con 1 mL di soluzione colorante ematossilina per 2 min.
- Per la conservazione a lungo termine, disidratare i campioni utilizzando etanolo al 95% per 3 minuti e quindi etanolo al 100% per 5 minuti. Sigillare il piatto con xilene e balsamo neutro.
- Preparare il 4% di paraformaldeide (10 ml) come segue: sciogliere 0,4 g di polvere di paraformaldeide in 10 ml di PBS. Mettere la soluzione in forno a 56 °C per 2 ore per favorire la dissoluzione.
- Colorazione Masson-Fontana specifica per la melanina (Figura 4B)
- Piastra iMels in un piatto da 30 mm e fissare le celle con il 4% di paraformaldeide per 20 min; lavare il piatto 3 volte con PBS.
- Aggiungere 1 mL di soluzione A (soluzione di argento ammoniacale) dal kit di colorazione Masson-Fontana (vedi Tabella dei materiali), posizionare il piatto in una scatola scura e posizionare la scatola scura in forno a 56 °C per 15-40 minuti.
NOTA: Se le particelle marrone-nere non sono visibili dopo 15 minuti nel forno, riportare i campioni al forno a 56 °C per continuare l'incubazione, ma non per >40 min. Un po 'd'acqua può essere aggiunta alla scatola scura per evitare che si secchi. - Aspirare la soluzione A e lavare il piatto 5-6 volte con acqua distillata, 1-2 minuti ogni volta.
- Aggiungere 1 mL di soluzione B (soluzione ipo) dal kit di colorazione Masson-Fontana e lasciare il piatto a temperatura ambiente per 3-5 minuti.
- Aspirare la soluzione B e lavare il piatto con acqua di rubinetto 3 volte, 1 min ogni volta.
- Aggiungere 1 mL di soluzione C (colorante rosso neutro) dal kit di colorazione Masson-Fontana e lasciare il piatto a temperatura ambiente per 3-5 minuti.
- Aspirare la soluzione C e lavare il piatto 3 volte con acqua distillata, 1 min ogni volta.
- Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% per una rapida disidratazione e aspirare l'etanolo dopo 3 minuti.
NOTA: I campioni macchiati possono essere conservati a lungo dopo la sigillatura con xilene e balsamo neutro.
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Representative Results
Questo articolo include i protocolli di un sistema di confezionamento concentrato di lentivirus per produrre lentivirus di fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta di fibroblasti a melanociti e protocolli per lo screening per i fattori di trascrizione e la riprogrammazione diretta dei melanociti dai MEF.
Il successo della produzione concentrata di lentivirus è stato valutato osservando l'intensità di fluorescenza della GFP (Figura 1A) o mediante citometria a flusso (Figura 1B) dopo aver infettato le cellule HEK-293T per 48 ore con lentivirus non concentrato (1x) e lentivirus concentrato (100x). Il titolo del virus concentrato era di 108 TU/mL o più, che è relativamente alto (Figura 1C).
La riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti si ottiene attraverso l'infezione con fattore di trascrizione lentivirus e la trasformazione con il mezzo di riprogrammazione ottimizzato. Lo schema per la generazione di iMel da MEF è mostrato nella Figura 2A. La morfologia cellulare cambia gradualmente durante la riprogrammazione diretta. Le sinapsi cellulari diventano allungate e i nuclei cellulari si ingrandiscono. Tuttavia, queste cellule invecchiano gradualmente dopo ~ Giorno 20 (~ 5 passaggi) (Figura 2B).
Un fattore di trascrizione è stato rimosso alla volta dal set originale di sei fattori di trascrizione (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2) per determinare il fattore di trascrizione con il maggiore impatto sulla riprogrammazione. La rimozione di Mitf, Pax3 o Sox10 ha portato al silenziamento dell'espressione dei geni melanocitici Tyr, Tyrp1 e Mlana (Figura 3A), indicando che questi tre fattori di trascrizione hanno avuto il maggiore impatto sulla conversione dei fibroblasti in melanociti. L'espressione di geni melanocitici indotta dalla riprogrammazione diretta con tre fattori di trascrizione è stata superiore a quella di tutti e sei i fattori di trascrizione (Figura 3B).
Infine, sono state identificate le caratteristiche degli iMel ottenuti utilizzando questo sistema ottimizzato di riprogrammazione diretta. L'espressione di marcatori melanocitici (TYR, TYYP1) è stata rilevata utilizzando la colorazione immunofluorescente (Figura 4A). Anche i metodi di colorazione specifici della melanina, tra cui la colorazione DOPA e Masson-Fontana, hanno mostrato risultati positivi (Figura 4B).
Figura 1: Produzione di virus concentrato e stima del titolo. (A) Intensità di fluorescenza della GFP dopo aver infettato cellule HEK-293T con lentivirus non concentrato (1x) e lentivirus concentrato (100x) (B) Confronto dei tassi di infezione di lentivirus non concentrato (1x) e lentivirus concentrato (100x) rilevati mediante citometria a flusso. (C) Stima del titolo del lentivirus concentrato. Barre di scala = 250 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; TU = unità trasduttrici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Generazione di iMel da MEF. (A) Diagramma schematico della generazione di iMels. (B) Cambiamenti nella morfologia cellulare durante la conversione da MEF a iMels nella riprogrammazione diretta il giorno 0, il giorno 3, il giorno 10 e il giorno 20+. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: iMels = melanociti indotti; MEFs = fibroblasti embrionali di topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Screening per fattori di trascrizione ottimizzati. (A) qRT-PCR dei livelli di mRNA Tyr, Tyrp1 e Mlana in cellule trasdotte con cinque fattori di trascrizione (uno dei sei fattori di trascrizione originali è stato rimosso). MEF + EV e MEF + 6F sono utilizzati rispettivamente come controllo negativo e controllo positivo. L'espressione dell'mRNA è normalizzata all'espressione di Gapdh. (B) qRT-PCR dei livelli di mRNA Tyr, Tyrp1 e Mlana nelle cellule trasdotte con i sei fattori di trascrizione originali e con tre fattori di trascrizione. MEF, MEF + EV e MMC vengono utilizzati rispettivamente come controllo vuoto, negativo e positivo. I livelli di mRNA sono normalizzati ai livelli di Gapdh. Tutti i valori sono medi ± SD di tre esperimenti indipendenti. Le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 3. Abbreviazioni: qRT-PCR = quantitative reverse-transcription PCR; MEF = fibroblasti embrionali di topo; MEF+EV = fibroblasti embrionali di topo + vettore vuoto; MMC = melanocita di topo; 6F = sei fattori di trascrizione che comprendono Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2; 3F: tre fattori di trascrizione che comprendono Mitf, Pax3 e Sox10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identificazione funzionale di iMels. (A) Immunocolorazione di marcatori melanocitici (TYR, TYYP1) in iMels. Barra della scala = 50 μm. Vedere la Tabella dei materiali per la diluizione degli anticorpi utilizzati in questo studio. (B) Colorazione Masson-Fontana e colorazione DOPA. MeF e la linea cellulare Melan-a sono utilizzati rispettivamente come controllo negativo e controllo positivo. Barra della scala = 50 μm. Abbreviazioni: iMels = melanociti indotti; DOPA = 3,4-diidrossifenilalanina; MEF = fibroblasto embrionale di topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componenti | Dose (concentrazione, volume) | Concentrazione finale | |
| Normale Medio (100 mL) | DMEM/ALTO GLUCOSIO | 89 ml | |
| FBS inattivato dal calore | 10 ml | ||
| Antibiotici (penna / streptococco) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| Mezzo di riprogrammazione (100 ml) | RPMI-1640 · | 88 ml | |
| FBS inattivato dal calore | 10 ml | ||
| SCF umano ricombinante | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/ml | |
| bFGF umano ricombinante | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/ml | |
| Insulina umana ricombinante | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| EDN3 umano | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Tossina del colera | 0,3 mg/mL, 0,56 μL | 20 ppm | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetato (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Idrocortisone | 100 μg/mL, 500 μL | 0,5 μg/mL | |
| Adenina | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
Tabella 1: Componenti di supporti normali e di riprogrammazione.
| Piatto della cultura | Densità di semina (cellule/piatto) | Medio (mL) | Sistema plasmidico | Reagente di trasfezione (μL) | ||
| Plasmide bersaglio (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 millimetri | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 millimetri | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 millimetri | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabella 2: Dettagli del sistema di confezionamento del lentivirus.
| Primer RT-PCR | |
| Bersaglio | Set di primer |
| Gapdh · | Attaccante: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Inverso: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Attaccante: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Inverso: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 · | Attaccante: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Inverso: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Attaccante: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Inverso: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabella 3: Informazioni introduttive.
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Discussion
La qualità del virus è cruciale per il successo della riprogrammazione diretta ai melanociti in questo protocollo. Il metodo di confezionamento e concentrazione dei virus in questo protocollo è semplice e facile da ripetere e non si basa su nessun altro reagente concentrato ausiliario. Questo protocollo può essere seguito con successo nella maggior parte dei laboratori. Per garantire la qualità del virus concentrato, i seguenti punti richiedono un'attenzione speciale. Uno è lo stato della cella di HEK-293T. Sebbene le cellule HEK-293T siano cellule immortalizzate, le cellule utilizzate per produrre il virus concentrato devono essere cellule sane entro 10 passaggi (il titolo diminuisce con passaggi più alti).
Un altro punto critico è la proporzione del reagente di trasfezione (in questo caso, lipofectamine) utilizzato. Poiché le cellule vengono danneggiate dopo aver aggiunto il reagente di trasfezione, il rapporto tra il reagente e i plasmidi deve essere controllato ripetutamente per garantire le condizioni ottimali delle cellule e la qualità del virus. Il rapporto 2:1 tra reagente di trasfezione e plasmidi è più adatto per le cellule HEK-293T per il confezionamento del virus in questo sistema. Inoltre, tutti i passaggi richiedono una manipolazione delicata durante tutto il processo. Poiché le particelle virali possono essere assorbite dopo il rivestimento, che influisce sul titolo del virus, non è consigliabile rivestire il piatto con alcuna matrice quando si confeziona il virus. A causa della possibilità di distacco di HEK-293T, il surnatante deve essere sostituito con attenzione, specialmente quando viene aggiunto un mezzo fresco dopo aver raccolto il surnatante virale dopo 24 ore. Alcune altre considerazioni includono la densità cellulare, la durata del tempo di trasfezione e il contenuto di siero nel mezzo. Queste sono questioni importanti che influenzano l'efficienza della trasfezione. Le condizioni presentate in questo protocollo sono le più adatte, sulla base dei risultati ottenuti dopo molti esperimenti ripetuti.
Nel processo di riprogrammazione diretta ai melanociti, è importante considerare lo stato dei MEF cellulari originali e la densità dei MEF utilizzati per la riprogrammazione diretta. Prima di iniziare la riprogrammazione diretta, i MEF devono essere coltivati in piatti di coltura cellulare non rivestiti. Le cellule in fase di proliferazione (confluenza del 40-50%) dovrebbero essere selezionate per la riprogrammazione diretta; l'efficienza dell'infezione diminuisce con l'aumentare della densità cellulare. Le cellule riprogrammate devono essere placcate in piatti di coltura rivestiti di gelatina.
Anche il tempo necessario affinché il virus infetti le cellule è fondamentale; un tempo di infezione troppo lungo comprometterà la sopravvivenza cellulare, mentre un tempo di infezione troppo breve ridurrà l'efficienza. Otto ore sono risultate appropriate affinché il virus concentrato infettasse i MEF in questo protocollo. L'ultimo punto critico è il modo corretto di cambiare il mezzo di riprogrammazione. I MEF devono adattarsi a un nuovo mezzo. Lo stato delle cellule deve essere controllato ogni giorno e il mezzo deve essere modificato attentamente in base allo stato della cella. Cambiare il mezzo di riprogrammazione troppo rapidamente causerà la morte di un gran numero di cellule.
Quando si coltivano e si sottoculturano iMels, la densità di passaggio delle cellule è fondamentale. Gli iMels hanno bisogno di una densità relativamente alta per mantenere la crescita. Le sinapsi cellulari devono essere in contatto tra loro per la normale proliferazione di queste cellule. Se la densità è troppo bassa, le cellule possono smettere di proliferare. Qui, la densità di 3 × 104 / cm2 è risultata essere una densità di passaggio adatta per iMels. Dopo 5 passaggi, gli iMel iniziano a invecchiare (Figura 2B); la melanina è più matura in questo momento e le cellule risultanti possono essere utilizzate per l'immunofluorescenza, la DOPA o la colorazione Masson-Fontana. Passaggi precedenti delle cellule possono essere utilizzati per la RT-PCR perché l'espressione dei geni cambierà in una fase relativamente precoce.
Sebbene la riprogrammazione diretta sia ampiamente studiata, c'è poca ricerca sulla riprogrammazione diretta dei fibroblasti ai melanociti. Diversi studi hanno utilizzato diversi fattori di trascrizione14,15, portando a molta confusione. Questo protocollo spiega come produrre virus concentrati di alta qualità e schermare diversi fattori di trascrizione per selezionare quelli più importanti per la riprogrammazione diretta ai melanociti. Il mezzo è stato integrato con fattori nutrizionali per la riprogrammazione diretta ai melanociti in questo protocollo (Tabella 2). Infine, gli iMel funzionali sono stati identificati con successo. Il sistema di riprogrammazione diretta dei melanociti chiaro e ottimizzato potrebbe fornire nuove strategie di trattamento per le malattie da depigmentazione come la vitiligine.
Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni alla tecnologia presentata in questo articolo. In primo luogo, è difficile stimare l'efficienza di questo protocollo. L'editing del gene CRISPR-Cas9 potrebbe essere combinato con questo protocollo per inserire geni melanocitici, come Tyr o Tyrp-1, nelle cellule iniziali per osservare la percentuale di cellule indotte durante il processo di riprogrammazione. Inoltre, il sistema di introduzione del lentivirus utilizzato in questo protocollo può comportare il rischio di ricombinazione genica e mutazione di inserzione19. In futuro, potrebbero essere utilizzati metodi di introduzione più efficienti e più sicuri, come vettori di espressione proteica ricombinante non virale o vettori di mRNA. L'esperimento in questo protocollo è ancora in fase di vitro . Il passo successivo è quello di riprogrammare i melanociti direttamente in vivo, causando la pigmentazione della pelle non pigmentata e di utilizzare il sistema di riprogrammazione diretta per progettare un trattamento efficace della vitiligine.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo studio è stato parzialmente supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) e della Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
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