Summary
여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.
Abstract
멜라닌 세포의 기능 상실은 vitiligo로 이어지며, 이는 영향을받는 개인의 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미칩니다. 현재, vitiligo에 대한 효과적인 장기 치료는 없습니다. 따라서 vitiligo에 대한 편리하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이 필수적입니다. 피부 세포를 멜라닌 세포로 직접 재 프로그래밍하기위한 재생 의학 기술은 vitiligo의 유망한 새로운 치료법 인 것 같습니다. 이것은 환자의 피부 세포를 기능적 멜라닌 세포로 직접 재 프로그래밍하여 vitiligo 환자의 멜라닌 세포 손실을 개선하는 데 도움을줍니다. 그러나이 방법은 먼저 마우스에서 테스트해야합니다. 직접 재 프로그래밍이 널리 사용되지만, 멜라닌 세포로의 직접 재 프로그래밍을위한 명확한 프로토콜은 없습니다. 더욱이, 이용가능한 전사 인자의 수는 압도적이다.
여기서, 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템 프로토콜은 Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 및 Snai2를 포함하는 멜라닌 세포에 피부 세포를 재프로그래밍하기 위해 선택된 전사 인자를 생산하기 위해 제시된다. 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 시험관내에서 유도된 멜라노사이트(iMels)로의 MEFs의 직접적인 리프로그래밍을 위한 이들 모든 전사 인자에 대해 농축된 렌티바이러스로 감염시켰다. 또한, 이들 전사 인자를 스크리닝하고, 시스템은 멜라닌 세포에 대한 직접 재프로그래밍을 위해 최적화되었다. 유전자 또는 단백질 수준에서 iMels에서 멜라닌의 특징적인 마커의 발현이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 섬유아세포를 멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍이 vitiligo에 대한 성공적인 새로운 치료 전략이 될 수 있고 멜라노사이트 발달 메커니즘을 확인할 수 있음을 시사하며, 이는 섬유아세포를 생체내에서 멜라노사이트로의 추가적인 직접적인 재프로그래밍을 위한 기초를 제공할 것이다.
Introduction
Vitiligo는 영향을받는 개인의 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미치는 피부 질환입니다. 대사 이상, 산화 스트레스, 염증 매개체의 생성, 세포 분리 및자가 면역 반응을 포함한 다양한 이유로 기능적 멜라닌 세포가 손실되고 멜라닌 분비가 중단되어 vitiligo 1,2의 발달로 이어집니다. 이 상태는 널리 발생하며 특히 얼굴에 문제가됩니다. 주요 치료는 코르티코 스테로이드 및 면역 조절제의 전신 사용입니다. 광선 요법은 전신 또는 국소 질환에 사용될 수 있으며, 천공 된 피부 이식 및 자가 멜라닌 세포 이식 3,4,5와 같은 외과 적 치료가 있습니다. 그러나 약물 요법과 광선 요법을 사용하는 환자는 재발하기 쉽고 이러한 치료법은 장기적인 치료 효과가 떨어집니다. 외과 적 치료는 외상성이며 적당히 효과적입니다 2,6. 따라서 vitiligo를 위해서는 새롭고 효과적인 치료 전략이 필요합니다.
유도된 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 리프로그래밍은 이들 세포를 그들의 말단 상태에서 다능성 상태로 역전시키고, 전사 인자인 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc7에 의해 매개되는 과정이다. 그러나, 종양원성의 가능성 및 긴 생산 시간으로 인해, 이 기술은 임상 설정(8)에 적용될 때 회의론에 부딪혔다. 직접 리프로그래밍은 한 종류의 단말 셀을 다른 유형의 단말 셀(9)로 변환시키는 기술이다. 이러한 과정은 적합한 전사 인자에 의해 달성된다. 심근세포(10), 뉴런(11) 및 달팽이관 모발 세포(12)를 포함하는 다양한 세포들이 이미 성공적으로 직접 재프로그램되었다. 일부 연구자들은 심지어 상처 복구에 사용할 수있는 현장에서 직접 피부 조직을 재 프로그래밍했습니다13. 직접 재 프로그래밍의 장점은 대기 시간과 비용 감소, 암 위험 감소, 윤리적 문제 감소, 세포 운명 결정의 기초가되는 메커니즘에 대한 더 나은 이해를 포함합니다9.
직접적인 리프로그래밍 방법이 널리 사용되고 있지만, 현재 피부 세포를 멜라닌 세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 확실한 방법은 없으며, 특히14,15개의 전사 인자가 고려되어야 하기 때문이다. 전사 인자인 Mitf, Sox10 및 Pax3는 피부 세포를 멜라노사이트(14)로 직접 재프로그래밍하는데 사용되어 왔다. 대조적으로, MITF, PAX3, SOX2 및 SOX9의 조합은 또한 다른 연구15에서 인간 멜라닌 세포로의 피부 세포의 직접 재 프로그래밍에 사용되었다. 이 프로토콜에서, 상이한 스크리닝 방법의 사용에도 불구하고, 앞서 기술된 바와 같이 멜라닌 세포로의 피부 세포의 직접적인 재프로그래밍을 위한 Mitf, Sox10 및 Pax3의 조합으로 동일한 결과가 얻어졌다. 다른 피부 세포로부터 멜라닌 세포를 생성하는 시스템을 개발하는 것은 vitiligo 환자의 다른 피부 세포를 멜라닌 세포로 변형시키는 계획을 제공 할 수 있습니다. 따라서 멜라닌 세포를 성공적으로 생성하기 위해이 직접 재 프로그래밍을위한 간단하고 효율적인 방법을 구성하는 것이 중요합니다.
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Protocol
이 작업은 강소 대학 (UJS-IACUC-AP--20190305010)의 실험실 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 실험은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC International)에 의해 설립 된 표준을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 인간과 관련된 실험은 없었기 때문에이 작업은 인간 연구 윤리위원회의 승인이 필요하지 않았습니다. 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 전사인자를 위한 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템 구축
- 농축된 바이러스의 생산(도 1A, B)
- 플레이트 1.5 × 106 HEK-293T 세포를 60 mm 디쉬에 넣고 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습 배양기에서 37°C에서 정상 배지(표 1 참조)로 배양하였다.
참고: 바이러스를 일괄적으로 포장해야 하는 경우 100mm 세포 배양 접시를 사용할 수 있습니다(자세한 내용은 표 2 참조). - 24시간 후, HEK-293T 세포가 형질도입 당일에 80-90% 합류에 도달했는지 확인하고, 배지를 3.5 mL의 DMEM (1cm2 당 150 μL의 DMEM)으로 교체하였다. 세포를 37°C에서 2시간 동안 5%CO2 가 있는 가습된 인큐베이터에 방치한다.
참고: 대체 배지는 혈청이 없어야 더 나은 플라스미드 형질감염을 위해 세포가 "굶주리는" 상태가 될 수 있습니다. - Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9, 또는 Snai2의 표적 플라스미드 3 μg을 함유하는 플라스미드 (믹스 A)의 혼합물을 제조하고; 1 μg의 패키징 플라스미드 PMD2. G, 및 2 μg의 패키징 플라스미드 PSPAX2. 혼합물 A의 부피를 무혈청 DMEM으로 150 μL로 구성한다. 트랜스펙션 시약 12 μL(부피는 모든 플라스미드의 총 질량의 두 배임)를 첨가하여 트랜스펙션 시약(믹스 B)의 믹스를 준비하고, 무혈청 DMEM으로 믹스 B의 부피를 150 μL로 구성한다.
참고 : 믹스를 준비 할 때 기포를 피하기 위해 천천히 액체를 첨가하는 것이 중요합니다. - 믹스 A와 믹스 B를 섞어서 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션하여 형질감염 복합체를 형성하였다.
- HEK-293T 세포를 인큐베이터에서 꺼내어 배지를 DMEM + 2% FBS로 교체하고 1.1.4 단계의 혼합물을 적가하고 부드럽게 혼합한다.
- 8시간 후, 배지를 3.5 mL의 정상 배지로 변경한다. 배지를 변경한 후, 24 h 및 48 h마다 바이러스 상청액을 수집한다.
- 두 개의 서로 다른 시점에서 수집된 바이러스 상청액을 혼합한다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 0.45 μm 필터를 통과시키고 50 mL 멸균 원뿔형 튜브에 수집한다.
참고: 24 h에서 수집 된 바이러스는 4 °C에서 저장하고 48 h에서 수집 된 바이러스와 혼합 할 수 있습니다. - 바이러스 상청액을 4°C에서 6000 × g 에서 하룻밤(∼16 h)으로 원심분리하여 농축하였다. 원심분리 후 원뿔형 튜브 바닥에 바이러스 펠렛이 보이는지 확인하십시오.
- 상층액을 천천히 붓는다. 바이러스 펠렛을 바이러스 상청액의 부피의 1/100번째 인 정상 배지의 부피에 용해시킨다. P1000 마이크로피펫을 사용하여, 균질한 혼합물이 얻어질 때까지 부드럽게 위아래로 피펫을 한다. 농축 된 바이러스를 필요에 따라 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다. -80 °C에서 보관하십시오.
참고 : 바이러스는이 방법으로 100x로 집중됩니다. 농축된 바이러스(100x)는 -80°C에서 >1년 동안 저장될 수 있다. 바이러스의 반복적 인 동결 및 해동을 피하십시오.
- 플레이트 1.5 × 106 HEK-293T 세포를 60 mm 디쉬에 넣고 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습 배양기에서 37°C에서 정상 배지(표 1 참조)로 배양하였다.
- 농축된 바이러스 역가의 검출 (도 1C)
- 플레이트 1 × 105개의 HEK-293T 세포를 6-웰 플레이트의 하나의 웰로 만들었다. 부정적인 컨트롤로 하나를 추가하는 것을 잊지 마십시오. 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 정상 배지로 배양한다.
- 24시간 후에 0.1μL 또는 0.2μL의 형광 농축 바이러스(100x)를 각 웰에 첨가하고, 양이온성 고분자 형질감염 시약 4ng/μL를 각 웰에 첨가한다. 감염 후 약 8-12 시간 후에 배지를 정상 배지로 교체하십시오.
참고: 형광 검출의 정확성과 효율성을 보장하려면 감염률이 10-30%여야 합니다. 형광 농축된 바이러스의 0.1 μL 또는 0.2 μL를 첨가하면 이 범위 내에서 감염 효율을 유지할 수 있다. 농축된 바이러스 역가는 적어도 1 × 10,8 형질도입 단위 (TU)/mL에 도달할 수 있다. - 감염 후 대략 48시간 후, 1 mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 접시를 세척하여 죽은 세포를 제거하였다.
- 이들 세포를 실온에서 1분 동안 6-웰 플레이트에서 웰 당 0.05% 트립신-EDTA의 250 μL를 사용하여 트립신화한다. 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다.
- 세포 펠릿을 PBS 1 mL에 재현탁시키고, 현탁액을 5 mL 폴리스티렌 둥근바닥 튜브에 첨가하고, 유세포 분석기를 사용하여 바이러스 형광 (녹색 형광 단백질, GFP+)의 감염 효율을 검출한다.
- 다음 공식을 사용하여 농축된 바이러스 역가를 계산하십시오: 105 (세포 부피) × 감염률 (GFP+%)/첨가된 바이러스 부피 (0.1 μL 또는 0.2 μL).
2. 섬유아세포를 멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍(도 2A)
- 6-웰 세포 배양 플레이트의 한 웰을 0.1% 젤라틴 용액 1 mL와 실온에서 15-30분 동안 코팅한다. 우물이 0.1 % 젤라틴 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 코팅 후 0.1% 젤라틴 용액을 흡인한다.
참고: 0.1% 젤라틴 용액(100 mL)을 다음과 같이 준비하십시오: 0.1 g의 젤라틴 분말을 오토클레이브 유리병에 초순수 100 mL에 녹인 다음 4°C에서 2개월 이상 보관하지 마십시오. - 플레이트 5 × 104 MEFs를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 6-웰 플레이트의 한 웰에 넣고 (단계 2.1에서와 같이), 이들 세포를 5%CO2 가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 정상 배지로 밤새 배양하였다.
- 24시간 후, MEF가 40-50% 합류율에 도달했는지 확인합니다. 매체를 일반 매체로 교체합니다.
- 0 일째에 농축 된 바이러스를 냉동실에서 꺼내 얼음 위에서 바이러스를 녹입니다. eq. (1)을 사용하여 첨가될 바이러스의 부피를 계산한다. 계산된 부피에 따라 여섯 개의 전사 인자인 Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 및 Snai2( 물질 표 참조)에 대해 농축된 바이러스를 각 웰에 첨가한 다음, 양이온성 고분자 형질감염제 4 μg/mL를 첨가한다.
세포 번호 (5 × 104) × 30 (감염 다중, MOI) / 바이러스 역가 (1) - 감염 후 1 일째, 8-12 시간 후, 바이러스가 포함 된 배지를 제거하고 신선한 정상 배지로 교체하면서 0.5 μg / mL 퓨로 마이신을 첨가하여 안정적인 감염된 세포주를 선별하십시오.
- 감염 후 48시간 후인 2일째에, 상청액 배지를 점차적으로 리프로그래밍 배지로 교체한다. 먼저, 총 배지 부피의 1/4번째 를 변경하고, 3 μM CHIR99021을 첨가한다.
- 제3일째부터 제7일까지, 세포의 상태에 따라, 더 높은 비율의 리프로그래밍 배지로 대체하여 배지를 변경하고( 표 1 참조), 5일 이내에 완전한 리프로그래밍 배지로 전환한다.
참고 :이 기간 동안 퓨로 마이신과 CHIR99021을 매일 사용해야합니다. 많은 죽은 세포가 재 프로그래밍 배지를 변경하는 첫 번째 및 두 번째 날에 나타납니다. 이것은 세포가 점차적으로 형질전환에 적응함에 따라 정상입니다. 따라서, 세포의 건강한 증식을 보장하기 위해 배지를 점진적으로 변화시킬 필요가 있다. - 세포를 통과시키기 위해, 500 μL의 0.05% 트립신-EDTA를 첨가하여 실온에서 3분 동안 세포를 소화시킨다. 세포의 ~ 60 %가 떠 올랐을 때, 소화 효소의 부피의 2 배에 달하는 정상 배지를 첨가하여 소화를 중단하십시오. 세포 현탁액을 15 mL 멸균 원뿔형 튜브에 수집하고, 4°C에서 5분 동안 200 × g 에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 리프로그래밍 배지로 재현탁하고, 세포를 3 내지 104/cm2의 밀도로 60 mm 멸균 접시에 ×판화한다. 이들 세포를 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
참고: 8일째부터 21일째까지, 이들 세포는 3-5일마다 계대배양되고 팽창하기 위해 60mm 멸균 접시에서 배양된다. 그들은 적어도 계대 5에 도달하도록 배양될 수 있다.
3. 직접 재 프로그래밍 및 식별을위한 최적화
- 최적화된 전사인자에 대한 스크리닝
- 2.1-2.7 단계를 반복하여 매번 여섯 가지 전사 인자 중 하나를 줄입니다. MEF를 다섯 가지 전사 인자의 조합으로 바이러스로 감염시킵니다.
- 감염 7일 후, 이들 세포의 RNA를 추출하고(16), 역전사 PCR(RT-PCR)17 을 이용하여 이들의 멜라노시스 유전자의 발현 수준을 분석하여 이를 하나씩 제거함으로써 멜라닌 세포로의 전환에 가장 큰 영향을 미치는 전사 인자를 선별한다(도 3A).
- MEF를 감염시키기 위해 멜라노사이트로의 전환에 영향을 미치는 상위 세 가지 전사 인자를 사용하십시오. 2.1-2.7단계를 반복합니다.
참고: 감염 후 칠일 후, 멜라노시스 유전자는 이러한 형질전환된 세포에서 검출될 수 있어야 한다(그림 3B). iMels 특성화를 위한 프라이머 정보가 표 3에 포함되어 있다.
- 유도된 멜라닌 세포 (iMels)의 확인
- 면역형광 염색18 을 사용하여 iMels가 TYRP-1 및 DCT를 포함하는 멜라닌성 단백질을 발현하는지 확인하였다(도 4A).
- 멜라닌 특이적 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA) 염색(도 4B)
- 다음과 같이 4% 파라포름알데히드(10 mL)를 준비한다: 파라포름알데히드 분말 0.4 g을 PBS 10 mL에 용해시킨다. 용해를 촉진하기 위해 용액을 2시간 동안 56°C의 오븐에 놓는다.
참고 : 용액은 한 달 이상 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. - iMels를 30mm 접시에 배양하고 미리 데운 PBS로 접시를 두 번 씻으십시오. 세포를 고정시키기 위해 4% 파라포름알데히드 1 mL를 20분 동안 첨가하고, 접시를 PBS로 3회 세척하였다.
- 0.01 g의 L-DOPA 분말을 PBS 10 mL에 용해시켜 사용 직전에 0.1% DOPA 염색 용액(10 mL)을 준비한다. 용액을 30분 동안 37°C의 수조에 놓고; 용해를 촉진하기 위해 여러 번 흔들어주십시오.
- 갓 준비한 0.1% DOPA 염색 용액 1 mL를 첨가한다. 37°C의 오븐에서 2-5시간 동안 인큐베이션한다. 갈색-흑색 입자가 없는 경우, 37°C에서 2시간 동안 계속 인큐베이션하되 >5시간 동안은 인큐베이션하지 않는다. 30 분마다 샘플을 확인하십시오.
- 매번 1분 동안 PBS로 접시를 3회 세척한다. 2분 동안 헤마톡실린 염색 용액 1 mL로 핵을 착색시킨다.
- 장기간 보관을 위해 95% 에탄올을 사용하여 샘플을 3분 동안 탈수시킨 다음 5분 동안 100% 에탄올을 사용하여 탈수시킵니다. 자일렌과 중성 발삼으로 접시를 밀봉하십시오.
- 다음과 같이 4% 파라포름알데히드(10 mL)를 준비한다: 파라포름알데히드 분말 0.4 g을 PBS 10 mL에 용해시킨다. 용해를 촉진하기 위해 용액을 2시간 동안 56°C의 오븐에 놓는다.
- 멜라닌 특이적 마손-폰타나 염색(도 4B)
- iMels를 30 mm 접시에 플레이트하고 세포를 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시키고; PBS로 접시를 3 번 씻으십시오.
- Masson-Fontana 염색 키트(자료표 참조)에서 용액 A(암모니아 실버 용액) 1 mL를 첨가하고, 접시를 어두운 상자에 넣고, 어두운 상자를 56°C 의 오븐에서 15-40분 동안 놓는다.
참고: 오븐에서 15분 후에 갈색-검은색 입자가 보이지 않으면 샘플을 56°C 오븐으로 돌려 보내 배양을 계속하되 >40분 동안은 배양하지 마십시오. 일부 물은 건조를 방지하기 위해 어두운 상자에 추가 할 수 있습니다. - 흡인물 용액 A는 증류수로 5-6회, 매번 1-2분 동안 접시를 세척한다.
- Masson-Fontana 염색 키트에서 1 mL 용액 B (하이포 용액)를 첨가하고, 접시를 실온에서 3-5 분 동안 두십시오.
- 흡인물 용액 B는 수돗물로 접시를 3 번, 매번 1 분 동안 씻는다.
- Masson-Fontana 염색 키트에서 용액 C (중성 적색 염료) 1 mL를 첨가하고 접시를 실온에서 3-5 분 동안 두십시오.
- 흡인물 용액 C는 증류수로 3회, 매번 1분간 접시를 세척한다.
- 신속한 탈수를 위해 100% 에탄올 1 mL를 첨가하고, 3분 후에 에탄올을 흡인한다.
참고 : 염색 된 샘플은 자일렌 및 중성 발삼으로 밀봉 한 후 오랜 시간 동안 보관할 수 있습니다.
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Representative Results
이 문서에는 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 전사 인자의 렌티바이러스를 생산하기 위한 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템의 프로토콜과 MEF로부터 멜라닌 세포의 전사 인자 스크리닝 및 직접 리프로그래밍을 위한 프로토콜이 포함되어 있다.
농축된 렌티바이러스 생산의 성공은 GFP의 형광 강도를 관찰(도 1A) 또는 HEK-293T 세포를 비농축 렌티바이러스(1x) 및 농축 렌티바이러스(100x)로 48시간 동안 감염시킨 후 유세포 분석기(도 1B)에 의해 평가하였다. 농축된 바이러스의 역가는 10,8 TU/mL 이상이었으며, 이는 비교적 높다(도 1C).
멜라노사이트로의 섬유아세포의 직접 리프로그래밍은 전사 인자 렌티바이러스에 의한 감염 및 최적화된 리프로그래밍 매질로의 형질전환을 통해 달성된다. MEF로부터 iMels를 생성하기 위한 스킴이 도 2A에 도시되어 있다. 세포 형태학은 직접 재 프로그래밍 중에 점차적으로 변화합니다. 세포 시냅스는 길어지고 세포 핵은 확대됩니다. 그러나, 이들 세포는 ∼Day 20(∼5 계대) 후에 점차적으로 노화된다(도 2B).
하나의 전사 인자를 여섯 개의 전사 인자 (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 및 Snai2)의 원래 세트로부터 한 번에 제거하여 리프로그래밍에 가장 큰 영향을 미치는 전사 인자를 결정하였다. Mitf, Pax3 또는 Sox10의 제거는 멜라닌시스 유전자인 Tyr, Tyrp1 및 Mlana의 발현을 침묵시키는 결과를 가져왔고(도 3A), 이는 이들 3개의 전사 인자가 멜라노사이트로의 섬유아세포 전환에 가장 큰 영향을 미쳤다는 것을 나타낸다. 세 개의 전사 인자를 사용한 직접 리프로그래밍에 의해 유도된 멜라노시스 유전자의 발현은 여섯 전사 인자 모두의 발현보다 높았다(도 3B).
마지막으로, 직접 리프로그래밍의 최적화된 시스템을 사용하여 얻어진 iMels의 특성이 확인되었다. 멜라닌시스 마커(TYR, TYYP1)의 발현을 면역형광 염색을 이용하여 검출하였다(도 4A). DOPA 및 Masson-Fontana 염색을 포함한 멜라닌 특이적 염색 방법도 양성 결과를 보였다(도 4B).
도 1: 농축된 바이러스의 생산 및 역가의 추정. (A) HEK-293T 세포를 비농축 렌티바이러스(1x) 및 농축 렌티바이러스(100x)로 감염시킨 후 GFP의 형광 강도(B) 유세포 분석기에 의해 검출된 미농축 렌티바이러스(1x) 및 농축 렌티바이러스(100x)의 감염률 비교. (c) 농축된 렌티바이러스의 역가 추정. 스케일 바 = 250 μm. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; TU = 트랜스듀싱 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MEF에서 iMels 생성. (A) iMels 생성의 개략도. (B) 0일째, 3일째, 10일째 및 20일째에 직접 재프로그래밍을 통해 MEF에서 iMels로 전환하는 동안 세포 형태학의 변화. 스케일 바 = 100 μm. 약어: iMels = 유도된 멜라닌 세포; MEFs = 마우스 배아 섬유아세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 최적화된 전사 인자에 대한 스크리닝. (a) 다섯 개의 전사 인자로 형질도입된 세포에서 Tyr, Tyrp1, 및 Mlana mRNA 수준의 qRT-PCR(원래의 여섯 전사 인자 중 하나가 제거됨). MEF + EV 및 MEF + 6F는 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용됩니다. mRNA 발현은 Gapdh 발현으로 정규화된다. (b) Tyr, Tyrp1 및 Mlana mRNA의 qRT-PCR은 원래의 여섯 개의 전사 인자 및 세 개의 전사 인자로 형질도입된 세포에서의 수준이다. MEF, MEF+EV, 및 MMC는 각각 블랭크, 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용된다. mRNA 수준은 Gapdh 수준으로 정규화된다. 모든 값은 세 개의 독립적인 실험의 SD± 평균값입니다. 프라이머 서열은 표 3에 나타내었다. 약어: qRT-PCR = 정량적 역전사 PCR; MEF = 마우스 배아 섬유아세포; MEF+EV = 마우스 배아 섬유아세포 + 빈 벡터; MMC = 마우스 멜라노사이트; 6F = Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2, 및 Snai2를 포함하는 6개의 전사 인자; 3F: Mitf, Pax3 및 Sox10을 포함하는 3개의 전사 인자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: iMels의 기능 식별. (A) iMels에서 멜라노시스 마커 (TYR, TYYP1)의 면역염색. 스케일 바 = 50 μm. 본 연구에 사용된 항체의 희석에 대한 물질의 표를 참조한다. (b) 마손-폰타나 염색 및 DOPA 염색. MEF 및 Melan-a 세포주는 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용된다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: iMels = 유도된 멜라닌 세포; DOPA = 3,4-디하이드록시페닐알라닌; MEF = 마우스 배아 섬유아세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 복용량 (농도, 부피) | 최종 집중 | |
| 일반 중형 (100 mL) | DMEM/고 글루코스 | 89 mL | |
| 열 불활성화 FBS | 10 mL | ||
| 항생제 (펜 / 스트렙) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| 리프로그래밍 매체 (100 mL) | RPMI-1640 | 88 mL | |
| 열 불활성화 FBS | 10 mL | ||
| 재조합 인간 SCF | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL | |
| 재조합 인간 bFGF | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL | |
| 재조합 인간 인슐린 | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| EDN3 인간 | 100 μM, 100 μL | 0.1 μM | |
| 콜레라 독소 | 0.3 mg/mL, 0.56 μL | 20 플렘 | |
| 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (TPA) | 1 밀리미터, 20 μL | 200 nM | |
| 하이드로코르티손 | 100 μg/mL, 500 μL | 0.5 μg/mL | |
| 아데닌 | 40 밀리그램/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
표 1: 정상 및 재프로그래밍 매체의 구성 요소.
| 문화 요리 | 파종 밀도 (세포 / 접시) | 중형(mL) | 플라스미드 시스템 | 형질감염 시약(μL) | ||
| 표적 플라스미드 (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 밀리미터 | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 밀리미터 | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 밀리미터 | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
표 2: 렌티바이러스 패키징 시스템의 세부사항.
| RT-PCR 프라이머 | |
| 과녁 | 프라이머 세트 |
| 갓드 | 앞으로: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| 역: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| 티르 | 앞으로: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| 역: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | 앞으로: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| 역: TCAGTGAGGAGGAGGCTGGTT | |
| 믈라나 | 앞으로: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| 역: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
표 3: 프라이머 정보.
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Discussion
바이러스의 품질은이 프로토콜에서 멜라닌 세포에 대한 직접 재 프로그래밍의 성공에 중요합니다. 이 프로토콜에서 바이러스를 포장하고 농축하는 방법은 간단하고 반복하기 쉬우며 다른 보조 농축 시약에 의존하지 않습니다. 이 프로토콜은 대부분의 실험실에서 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 농축 된 바이러스의 품질을 보장하기 위해 다음 사항은 특별한주의가 필요합니다. 하나는 HEK-293T의 세포 상태입니다. HEK-293T 세포는 불멸화 된 세포이지만, 농축 된 바이러스를 만드는 데 사용되는 세포는 10 계대 이내에 건강한 세포이어야합니다 (역가는 더 높은 계대에 따라 감소합니다).
또 다른 중요한 점은 사용 된 형질 감염 시약 (이 경우 리포펙타민)의 비율입니다. 형질감염 시약을 첨가한 후 세포가 손상되기 때문에, 세포의 최적 상태와 바이러스의 품질을 보장하기 위해 플라스미드에 대한 시약의 비율을 반복적으로 점검해야 한다. 플라스미드에 대한 트랜스펙션 시약의 2:1 비율은 이 시스템에서 바이러스를 패키징하기 위한 HEK-293T 세포에 가장 적합하다. 또한 모든 단계는 프로세스 전반에 걸쳐 부드러운 처리가 필요합니다. 바이러스 입자는 바이러스 역가에 영향을 미치는 코팅 후 흡수 될 수 있으므로 바이러스를 포장 할 때 접시를 매트릭스로 코팅하는 것은 바람직하지 않습니다. HEK-293T의 분리 가능성으로 인해 특히 24 시간 후에 바이러스 상청액을 수집 한 후 신선한 배지를 첨가 할 때 상청액을 조심스럽게 교체해야합니다. 일부 다른 고려사항은 세포 밀도, 형질감염 시간의 길이, 및 배지 내의 혈청 함량을 포함한다. 이들은 형질 감염 효율에 영향을 미치는 중요한 문제입니다. 이 프로토콜에 제시된 조건은 많은 반복 실험 후에 얻은 결과를 기반으로 가장 적합합니다.
멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍 과정에서, 원래의 MEF의 상태와 직접 재프로그래밍에 사용되는 MEF의 밀도를 고려하는 것이 중요하다. 직접 리프로그래밍을 시작하기 전에, MEF는 코팅되지 않은 세포 배양 접시에서 배양되어야 한다. 증식 단계 (40-50% 합류)에서 세포는 직접 재프로그래밍을 위해 선택되어야 한다; 감염 효율은 세포 밀도가 증가함에 따라 감소합니다. 재프로그램된 세포는 젤라틴 코팅 배양 접시에 플레이팅되어야 한다.
바이러스가 세포를 감염시키는 데 필요한 시간 또한 중요합니다. 감염 시간이 너무 길면 세포 생존이 저해되는 반면, 감염 시간이 너무 짧으면 효율성이 떨어집니다. 여덟 시간은 농축된 바이러스가 이 프로토콜에서 MEFs를 감염시키기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 마지막 중요한 점은 재프로그래밍 매체를 변경하는 올바른 방법입니다. MEF는 새로운 매체에 적응해야 합니다. 세포의 상태는 매일 점검되어야하며, 배지는 세포 상태에 따라주의 깊게 변경되어야합니다. 리프로그래밍 배지를 너무 빨리 변경하면 많은 수의 셀이 죽습니다.
iMels를 재배하고 계대배양할 때, 세포의 통과 밀도가 매우 중요합니다. iMels는 성장을 유지하기 위해 상대적으로 높은 밀도가 필요합니다. 세포 시냅스는 이들 세포의 정상적인 증식을 위해 서로 접촉해야 한다. 밀도가 너무 낮으면 세포 증식이 멈출 수 있습니다. 여기서, 3 내지 10× 4/cm2 의 밀도는 iMels에 적합한 통과 밀도인 것으로 밝혀졌다. 5 계대 후, iMels는 노화를 시작합니다 (그림 2B); 이 때 멜라닌은 더 성숙하고, 생성된 세포는 면역형광, DOPA, 또는 마손-폰타나 염색에 사용될 수 있다. 세포의 초기 계대는 유전자의 발현이 비교적 초기 단계에서 변할 것이기 때문에 RT-PCR에 사용될 수 있다.
직접적인 재 프로그래밍이 널리 연구되고 있지만, 섬유아세포를 멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍에 대한 연구는 거의 없다. 다른 연구에서는 서로 다른 전사 인자14,15를 사용하여 많은 혼란을 초래했습니다. 이 프로토콜은 고품질의 농축 바이러스를 생산하는 방법을 설명하고 멜라닌 세포에 대한 직접 재 프로그래밍을위한 가장 중요한 것을 선택하기 위해 여러 전사 인자를 선별합니다. 배지는 이 프로토콜에서 멜라닌 세포로의 직접 재프로그래밍을 위한 영양 인자로 보충되었다(표 2). 마지막으로, 기능적 iMels가 성공적으로 확인되었습니다. 명확하고 최적화 된 멜라노사이트 직접 재 프로그래밍 시스템은 vitiligo와 같은 탈색 질환에 대한 새로운 치료 전략을 제공 할 수 있습니다.
그러나 이 문서에 나와 있는 기술에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째,이 프로토콜의 효율성을 추정하는 것은 어렵습니다. CRISPR-Cas9 유전자 편집은 이 프로토콜과 결합하여 Tyr 또는 Tyrp-1과 같은 멜라노시스 유전자를 초기 세포 내 로 녹핑하여 리프로그래밍 과정 동안 유도된 세포의 백분율을 관찰할 수 있었다. 또한, 이 프로토콜에 사용되는 렌티바이러스 도입 시스템은 유전자 재조합 및 삽입 돌연변이(19)의 위험을 지닐 수 있다. 앞으로는 비바이러스성 재조합 단백질 발현 벡터 또는 mRNA 벡터와 같은 보다 효율적이고 안전한 도입 방법이 사용될 수 있을 것이다. 이 프로토콜의 실험은 여전히 시험관내 단계에 있습니다. 다음 단계는 생체 내에서 멜라닌 세포를 직접 재 프로그래밍하여 색소가 묻지 않은 피부를 색소 침착하게하고 직접 재 프로그래밍 시스템을 사용하여 vitiligo의 효과적인 치료법을 설계하는 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82070638 및 81770621)과 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20180281)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
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