Summary
Здесь мы описываем оптимизированную систему прямого перепрограммирования меланоцитов и высокоэффективную, концентрированную систему упаковки вирусов, которая обеспечивает плавное прямое перепрограммирование.
Abstract
Потеря функции меланоцитов приводит к витилиго, что серьезно сказывается на физическом и психическом здоровье пораженных лиц. В настоящее время не существует эффективного долгосрочного лечения витилиго. Поэтому крайне важно разработать удобное и эффективное лечение витилиго. Технология регенеративной медицины для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, по-видимому, является многообещающим новым методом лечения витилиго. Это включает в себя прямое перепрограммирование клеток кожи пациента в функциональные меланоциты, чтобы помочь улучшить потерю меланоцитов у пациентов с витилиго. Однако этот метод необходимо сначала протестировать на мышах. Хотя прямое перепрограммирование широко используется, нет четкого протокола для прямого перепрограммирования в меланоциты. Более того, количество доступных факторов транскрипции ошеломляет.
Здесь представлен протокол концентрированной системы упаковки лентивируса для получения факторов транскрипции, выбранных для перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, включая Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF) были инфицированы концентрированным лентивирусом для всех этих факторов транскрипции для прямого перепрограммирования MEF в индуцированные меланоциты (iMels) in vitro. Кроме того, эти факторы транскрипции были проверены, и система была оптимизирована для прямого перепрограммирования на меланоциты. Экспрессия характерных маркеров меланина в iMels на уровне гена или белка была значительно повышена. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты может стать успешной новой терапевтической стратегией при витилиго и подтвердить механизм развития меланоцитов, что обеспечит основу для дальнейшего прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты in vivo.
Introduction
Витилиго – это кожное заболевание, которое серьезно влияет на физическое и психическое здоровье пострадавших лиц. По разным причинам, включая метаболические нарушения, окислительный стресс, генерацию медиаторов воспаления, отслойку клеток и аутоиммунный ответ, функциональные меланоциты теряются, а секреция меланина прекращается, что приводит к развитию витилиго 1,2. Это состояние встречается широко и особенно проблематично на лице. Основным методом лечения является системное применение кортикостероидов и иммуномодуляторов. Фототерапия может быть использована при системных или местных заболеваниях, и существуют хирургические методы лечения, такие как перфорированная трансплантация кожи и аутологичная трансплантация меланоцитов 3,4,5. Однако пациенты, которые используют медикаментозную терапию и фототерапию, склонны к рецидивам, и эти методы лечения имеют слабые долгосрочные терапевтические эффекты. Хирургическое лечение травматично и только умеренно эффективно 2,6. Поэтому при витилиго необходима новая и эффективная терапевтическая стратегия.
Перепрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) возвращает эти клетки из их терминального состояния в плюрипотентное состояние, процесс, опосредованный факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc7. Однако из-за возможности опухолегенности и длительного времени производства эта технология была встречена со скептицизмом при применении в клинических условиях8. Прямое перепрограммирование - это технология, которая заставляет один тип терминальной ячейки превращаться в другой тип терминальной ячейки9. Этот процесс достигается подходящими факторами транскрипции. Различные клетки уже были успешно перепрограммированы, включая кардиомиоциты10, нейроны11 и кохлеарные волосковые клетки12. Некоторые исследователи даже перепрограммировали ткань кожи непосредственно на месте, которая может быть использована для заживления ран13. Преимущества прямого перепрограммирования включают сокращение времени ожидания и затрат, более низкий риск развития рака, меньше этических проблем и лучшее понимание механизма, лежащего в основе определения судьбы клеток9.
Хотя метод прямого перепрограммирования широко используется, в настоящее время нет определенного метода прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, особенно из-за многочисленных факторов транскрипции, которые следует считать14,15. Факторы транскрипции, Mitf, Sox10 и Pax3, были использованы для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты14. Напротив, комбинация MITF, PAX3, SOX2 и SOX9 также использовалась для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты человека в другом исследовании15. В этом протоколе, несмотря на использование другого метода скрининга, тот же результат был получен с комбинацией Mitf, Sox10 и Pax3 для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, как описано ранее14. Разработка системы для генерации меланоцитов из других клеток кожи может обеспечить схему преобразования других клеток кожи пациентов с витилиго в меланоциты. Следовательно, крайне важно построить простой и эффективный метод для этого прямого перепрограммирования для успешной генерации меланоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта работа была одобрена Комитетом по управлению и использованию лабораторных животных в Университете Цзянсу (UJS-IACUC-AP--20190305010). Эксперименты проводились в строгом соответствии со стандартами, установленными Международной ассоциацией по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC International). Не было никаких экспериментов с участием людей, поэтому эта работа не нуждалась в одобрении комитета по этике исследований человека. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о реагентах.
1. Построение концентрированной лентивирусной упаковочной системы для транскрипционных факторов
- Производство концентрированного вируса (рисунок 1A, B)
- Пластина 1,5 × 106 клеток HEK-293T в 60-миллиметровую чашку и культивируют эти клетки с нормальной средой (см. Таблицу 1) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вирус необходимо упаковать партиями, можно использовать чашку для культивирования клеток толщиной 100 мм (подробнее см. таблицу 2). - Через 24 ч убедиться, что клетки HEK-293T достигли 80-90% слияния в день трансдукции, и заменить среду 3,5 мл DMEM (150 мкл DMEM на 1см2). Оставьте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замещающая среда должна быть без сыворотки, чтобы клетки могли быть «голодными» для лучшей трансфекции плазмид. - Готовят смесь плазмид (смесь А), содержащую 3 мкг плазмид-мишеней Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 или Snai2; 1 мкг упаковки плазмиды PMD2. G, и 2 мкг упаковочной плазмиды PSPAX2. Восполнить объем смеси А до 150 мкл с DMEM без сыворотки. Подготовьте смесь трансфекционного реагента (смесь В) путем добавления 12 мкл трансфекционного реагента (объем в два раза превышает общую массу всех плазмид) и восполните объем смеси В до 150 мкл с DMEM без сыворотки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении смесей важно медленно добавлять жидкость, чтобы избежать пузырьков воздуха. - Смешайте смесь А и перемешайте В, дав им постоять 5 мин при комнатной температуре. Инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 20-30 мин с образованием трансфекционного комплекса.
- Выньте клетки HEK-293T из инкубатора, замените среду DMEM + 2% FBS, добавьте смесь со стадии 1.1.4 по каплям и аккуратно перемешайте жидкость.
- Через 8 ч изменить среду на 3,5 мл нормальной среды. После смены среды собирают вирусный супернатант каждые 24 ч и 48 ч.
- Смешайте супернатанты вируса, собранные в двух разных временных точках. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С. Пропустите супернатант через фильтры 0,45 мкм и соберите его в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, собранный через 24 ч, можно хранить при 4 °C и смешивать с вирусом, собранным через 48 ч. - Концентрировать супернатант вируса путем центрифугирования при 6000 × г при 4 °C в течение ночи (~16 ч). Убедитесь, что гранула вируса видна в нижней части конической трубки после центрифугирования.
- Выливайте супернатант медленно. Растворить вирусную гранулу в объеме нормальной среды, который составляет 1/100-ю объема супернатанта вируса. Используя микропипетку P1000, пипетку осторожно вверх и вниз до получения однородной смеси. Разделите концентрированный вирус на микроцентрифужные трубки по мере необходимости. Хранить при температуре −80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус концентрируется 100x с помощью этого метода. Концентрированный вирус (100x) может храниться >1 год при −80 °C. Избегайте повторного замораживания и оттаивания вируса.
- Пластина 1,5 × 106 клеток HEK-293T в 60-миллиметровую чашку и культивируют эти клетки с нормальной средой (см. Таблицу 1) при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
- Обнаружение концентрированного титра вируса (рисунок 1С)
- Пластина 1 × 105 ячеек HEK-293T в одну скважину из 6-луночной пластины. Не забудьте добавить один из них в качестве отрицательного элемента управления. Культивируйте эти клетки с нормальной средой при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
- Добавляют 0,1 мкл или 0,2 мкл флуоресцентного концентрированного вируса (100x) в каждую лунку через 24 ч и добавляют 4 нг/мкл катионного полимерного трансфекционного реагента в каждую лунку. Примерно через 8-12 ч после заражения замените среду нормальной средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точности и эффективности обнаружения флуоресценции уровень инфицирования должен составлять 10-30%. Добавление 0,1 мкл или 0,2 мкл флуоресцентного концентрированного вируса может поддерживать эффективность инфекции в этом диапазоне. Концентрированный титр вируса может достигать 1 × 108 преобразовательных единиц (TU)/мл не менее. - Примерно через 48 ч после заражения вымойте посуду 1 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для удаления мертвых клеток.
- Трипсинизируют эти клетки, используя 250 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА на лунку в 6-луночной пластине в течение 1 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С, а затем удаляют надосадочное вещество.
- Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл PBS, добавляют суспензию в 5 мл полистирольной трубки круглого дна и обнаруживают инфекционную эффективность флуоресценции вируса (зеленый флуоресцентный белок, GFP+) с помощью проточной цитометрии.
- Рассчитайте титр концентрированного вируса, используя следующую формулу: 105 (клеточный объем) × уровень инфицирования (GFP+%)/добавленный объем вируса (0,1 мкл или 0,2 мкл).
2. Прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты (рисунок 2А)
- Обмазывайте одну лунку 6-луночной клеточной культуральной пластины 1 мл 0,1% раствора желатина при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Убедитесь, что скважина полностью покрыта 0,1% раствором желатина. Аспирировать 0,1% раствор желатина после нанесения покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят 0,1% раствор желатина (100 мл) следующим образом: 0,1 г желатинового порошка растворяют в 100 мл сверхчистой воды в автоклавном стеклянном флаконе и затем хранят при 4 °C не более 2 месяцев. - Пластина 5 × 104 MEF в одну лунку из 6-луночной пластины, покрытой 0,1% желатина (как на стадии 2.1), и культивировать эти клетки с нормальной средой при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 в течение ночи.
- Через 24 ч подтвердите, что МЭФ достигли 40-50% слияния. Замените среду обычной средой.
- На 0-й день достаньте концентрированный вирус из морозильной камеры и растопите вирус на льду. Рассчитайте объем добавляемого вируса с помощью экв. (1). Добавьте концентрированный вирус для шести факторов транскрипции, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 и Snai2 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину в соответствии с расчетным объемом, а затем добавьте 4 мкг/мл катионного полимерного трансфекционного агента.
Количество клеток (5 × 104) × 30 (множественность инфекции, MOI)/титр вируса (1) - На 1-й день, через 8-12 ч после заражения, удалите среду, содержащую вирус, и замените ее свежей нормальной средой, добавив 0,5 мкг / мл пуромицина для скрининга стабильных инфицированных клеточных линий.
- На 2-й день, через 48 ч после заражения, замените надпочивающую среду постепенно средой перепрограммирования. Во-первых,измените 1/4 от общего объема среды и добавьте 3 мкм CHIR99021.
- С 3 по 7 день, в зависимости от состояния клеток, изменяют среду путем замены более высокой долей перепрограммирующей среды (см. табл. 1) постепенно, и переходят на полную перепрограммирующую среду в течение 5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого периода пуромицин и CHIR99021 должны использоваться каждый день. Многие мертвые клетки появятся на первый и второй день смены среды перепрограммирования. Это нормально, так как клетки постепенно адаптируются к трансформации. Поэтому среду необходимо менять постепенно, чтобы обеспечить здоровую пролиферацию клеток. - Для прохождения клеток добавляют 500 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА для переваривания клеток в течение 3 мин при комнатной температуре. Когда ~ 60% клеток всплывут, остановите пищеварение, добавив нормальную среду в 2 раза больше объема пищеварительного фермента. Собрать клеточную суспензию в 15 мл стерильной конической трубки, центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С, удалить надосадочный агент, повторно суспендировать клеточную гранулу с перепрограммирующей средой и наложить ячейки в 60 мм стерильную посуду при плотности 3 × 104/см2. Культивируйте эти клетки при 37 °C в увлажненном 5%CO2 инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: С 8-го по 21-й день эти клетки субкультурируют каждые 3-5 дней и культивируют в 60-миллиметровых стерильных блюдах для расширения. Их можно культивировать, чтобы достичь по крайней мере прохода 5.
3. Оптимизация для прямого перепрограммирования и идентификации
- Скрининг оптимизированных факторов транскрипции
- Повторите шаги 2.1-2.7, каждый раз уменьшая один из шести факторов транскрипции. Заразить MEF вирусом комбинациями пяти факторов транскрипции.
- Через семь дней после заражения извлеките РНК этих клеток16 и проанализируйте уровни экспрессии их меланоцитарных генов с использованием ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)17 для скрининга факторов транскрипции с наибольшим влиянием на превращение в меланоциты, удаляя их один за другим (рисунок 3A).
- Используйте три основных фактора транскрипции, влияющих на превращение в меланоциты, чтобы заразить MEF. Повторите шаги 2.1–2.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через семь дней после заражения меланоцитарные гены должны быть обнаружены в этих трансформированных клетках (рисунок 3B). Информация о грунтовке для характеристики iMels приведена в таблице 3.
- Идентификация индуцированных меланоцитов (iMels)
- Используйте иммунофлуоресцентное окрашивание18 для проверки того, что iMels экспрессируют меланоцитарные белки, включая TYRP-1 и DCT (фиг.4A).
- Меланин-специфическое окрашивание 3,4-дигидроксифенилаланином (DOPA) (рисунок 4B)
- Готовят 4% параформальдегид (10 мл) следующим образом: растворяют 0,4 г порошка параформальдегида в 10 мл PBS. Поместите раствор в духовку при температуре 56 °C в течение 2 ч, чтобы способствовать растворению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C не более одного месяца. - Выращивайте iMels в посуде толщиной 30 мм и дважды мойте ее предварительно подогретым PBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать клетки в течение 20 минут, и вымойте посуду 3 раза PBS.
- Приготовьте 0,1% раствор для окрашивания DOPA (10 мл) непосредственно перед использованием, растворив 0,01 г порошка L-DOPA в 10 мл PBS. Поместите раствор на водяную баню при 37 °C в течение 30 мин; встряхните его несколько раз, чтобы способствовать растворению.
- Добавить 1 мл свежеприготовленного 0,1% раствора для окрашивания DOPA. Инкубировать в духовке при 37 °С в течение 2-5 ч. Если нет коричнево-черных частиц, продолжайте инкубировать при 37 °C еще 2 ч, но не в течение >5 ч. Проверяйте образцы каждые 30 минут.
- Мойте посуду 3 раза PBS в течение 1 мин каждый раз. Окрашивают ядро 1 мл раствора для окрашивания гематоксилина в течение 2 мин.
- Для длительного хранения обезвоживайте образцы, используя 95% этанол в течение 3 мин, а затем 100% этанол в течение 5 мин. Запечатайте блюдо ксилолом и нейтральным бальзамом.
- Готовят 4% параформальдегид (10 мл) следующим образом: растворяют 0,4 г порошка параформальдегида в 10 мл PBS. Поместите раствор в духовку при температуре 56 °C в течение 2 ч, чтобы способствовать растворению.
- Меланин-специфическое окрашивание Массона-Фонтана (рисунок 4B)
- Пластину iMels в тарелку 30 мм и зафиксировать ячейки с 4% параформальдегидом в течение 20 мин; вымойте посуду 3 раза PBS.
- Добавьте 1 мл раствора А (раствора аммиачного серебра) из набора окрашивания Masson-Fontana (см. Таблицу материалов), поместите блюдо в темную коробку и поместите темную коробку в духовку при 56 °C на 15-40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если коричнево-черные частицы не видны через 15 мин в духовке, верните образцы в духовку с температурой 56 °C для продолжения инкубации, но не в течение >40 мин. Немного воды можно добавить в темный ящик, чтобы предотвратить высыхание. - Аспирировать раствором А и промыть посуду 5-6 раз дистиллированной водой, по 1-2 мин каждый раз.
- Добавить 1 мл раствора В (гипо-раствор) из набора для окрашивания Массон-Фонтана и оставить посуду при комнатной температуре на 3-5 мин.
- Аспирировать раствором В и промыть посуду водопроводной водой 3 раза по 1 мин каждый раз.
- Добавить 1 мл раствора С (нейтральный красный краситель) из набора для окрашивания Masson-Fontana, и оставить посуду при комнатной температуре на 3-5 мин.
- Аспирировать раствор С и промыть посуду 3 раза дистиллированной водой, по 1 мин каждый раз.
- Добавьте 1 мл 100% этанола для быстрого обезвоживания и аспирируйте этанол через 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы могут храниться в течение длительного времени после герметизации ксилолом и нейтральным бальзамом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данная статья включает протоколы концентрированной лентивирусной упаковочной системы для получения лентивируса факторов транскрипции для прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты и протоколы скрининга факторов транскрипции и прямого перепрограммирования меланоцитов из MEF.
Успешность концентрированного производства лентивируса оценивали путем наблюдения за интенсивностью флуоресценции GFP (рисунок 1A) или с помощью проточной цитометрии (рисунок 1B) после заражения клеток HEK-293T в течение 48 ч неконцентрированным лентивирусом (1x) и концентрированным лентивирусом (100x). Титр концентрированного вируса составлял 108 TU/мл и более, что является относительно высоким (рисунок 1C).
Прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты достигается за счет заражения лентивирусом транскрипционного фактора и трансформации оптимизированной средой перепрограммирования. Схема генерации iMels из MEF показана на рисунке 2A. Морфология клеток постепенно изменяется при прямом перепрограммировании. Клеточные синапсы становятся удлиненными, а ядра клеток увеличиваются. Однако эти клетки постепенно стареют после ~ Дня 20 (~ 5 проходов) (Рисунок 2B).
Один транскрипционный фактор был удален за один раз из первоначального набора из шести факторов транскрипции (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 и Snai2), чтобы определить фактор транскрипции с наибольшим влиянием на перепрограммирование. Удаление Mitf, Pax3 или Sox10 привело к заглушанию экспрессии меланоцитарных генов Tyr, Tyrp1 и Mlana (рисунок 3A), что указывает на то, что эти три фактора транскрипции оказали наибольшее влияние на превращение фибробластов в меланоциты. Экспрессия меланоцитарных генов, индуцированных прямым перепрограммированием с тремя факторами транскрипции, была выше, чем у всех шести факторов транскрипции (рисунок 3B).
Наконец, были выявлены характеристики iMels, полученные с помощью этой оптимизированной системы прямого перепрограммирования. Экспрессия меланоцитарных маркеров (TYR, TYYP1) была обнаружена с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (рисунок 4A). Меланин-специфические методы окрашивания, включая окрашивание DOPA и Masson-Fontana, также показали положительные результаты (рисунок 4B).
Рисунок 1: Продуцирование концентрированного вируса и оценка титра. (А) Интенсивность флуоресценции GFP после заражения клеток HEK-293T неконцентрированным лентивирусом (1x) и концентрированным лентивирусом (100x) (B) Сравнение показателей инфицирования неконцентрированным лентивирусом (1x) и концентрированным лентивирусом (100x), обнаруженным с помощью проточной цитометрии. (C) Оценка титра концентрированного лентивируса. Шкала стержней = 250 мкм. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; TU = преобразовательные блоки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Генерация iMels из MEF. (A) Принципиальная схема генерации iMels. (B) Изменения морфологии клеток при преобразовании из MEF в iMels при прямом перепрограммировании в день 0, день 3, день 10 и день 20+. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: iMels = индуцированные меланоциты; MEF = эмбриональные фибробласты мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Скрининг оптимизированных факторов транскрипции. (A) qRT-PCR уровней мРНК Tyr, Tyrp1 и Mlana в клетках, трансдуцированных пятью факторами транскрипции (один из первоначальных шести факторов транскрипции был удален). MEF + EV и MEF + 6F используются в качестве отрицательного контроля и положительного контроля соответственно. Экспрессия мРНК нормализуется до экспрессии Гапдха . (B) qRT-PCR уровней мРНК Tyr, Tyrp1 и Mlana в клетках, трансдуцированных исходными шестью факторами транскрипции и тремя факторами транскрипции. MEF, MEF + EV и MMC используются в качестве пустого, отрицательного и положительного контроля соответственно. Уровни мРНК нормализуются до уровней Гапдха . Все значения являются средними ± SD трех независимых экспериментов. Последовательности праймеров приведены в таблице 3. Сокращения: qRT-PCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией; MEF = эмбриональные фибробласты мышей; MEF+EV = мышиные эмбриональные фибробласты + пустой вектор; MMC = меланоцит мыши; 6F = шесть факторов транскрипции, включающих Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 и Snai2; 3F: три фактора транскрипции, включающие Mitf, Pax3 и Sox10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Функциональная идентификация iMels. (A) Иммуноокрашивание меланоцитарных маркеров (TYR, TYYP1) в iMels. Шкала бара = 50 мкм. Смотрите Таблицу материалов для разведения антител, используемых в этом исследовании. (B) Окрашивание Массон-Фонтана и окрашивание DOPA. MEF и клеточная линия Мелан-а используются в качестве отрицательного контроля и положительного контроля соответственно. Шкала бара = 50 мкм. Сокращения: iMels = индуцированные меланоциты; ДОФА = 3,4-дигидроксифенилаланин; MEF = эмбриональный фибробласт мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Компоненты | Доза (концентрация, объем) | Конечная концентрация | |
| Нормальная среда (100 мл) | DMEM/ВЫСОКИЙ УРОВЕНЬ ГЛЮКОЗЫ | 89 мл | |
| Термоинактивированный FBS | 10 мл | ||
| Антибиотики (ручка / стрептококк) | 10000 Ед/мл, 1 мл | 100 Ед/мл | |
| Среда перепрограммирования (100 мл) | РПИ-1640 | 88 мл | |
| Термоинактивированный FBS | 10 мл | ||
| Рекомбинантный человеческий SCF | 200 мкг/мл, 50 мкл | 100 нг/мл | |
| Рекомбинантный человеческий bFGF | 4 мкг/мл, 250 мкл | 10 нг/мл | |
| Рекомбинантный человеческий инсулин | 10 мг/мл, 50 мкл | 5 мкг/мл | |
| EDN3 человек | 100 мкМ, 100 мкл | 0,1 мкМ | |
| Холерический токсин | 0,3 мг/мл, 0,56 мкл | 20 пМ | |
| Форбол 12-миристат 13-ацетат (TPA) | 1 мМ, 20 мкл | 200 нМ | |
| Гидрокортизон | 100 мкг/мл, 500 мкл | 0,5 мкг/мл | |
| Аденин | 40 мг/мл, 60 мкл | 24 мкг/мл |
Таблица 1: Компоненты нормальных и перепрограммирующих сред.
| Культурное блюдо | Плотность посева (ячейки/тарелка) | Средний (мл) | Плазмидная система | Трансфекционный реагент (мкл) | ||
| Плазмида-мишень (мкг) | ПМД2. Г (мкг) | PSPAX2 (мкг) | ||||
| 35 мм | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 мм | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 мм | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Таблица 2: Подробная информация о системе упаковки лентивируса.
| Грунтовки РТ-ПЦР | |
| Цель | Наборы грунтовок |
| Гапдх | Нападающий: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Реверс: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Тир | Нападающий: GGGCCCAAATTGTACAGAGAGA |
| Реверс: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Тирп1 | Нападающий: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Реверс: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Млана | Форвард: АГАГГКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТКТ |
| Реверс: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Таблица 3: Информация о грунтовке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Качество вируса имеет решающее значение для успеха прямого перепрограммирования на меланоциты в этом протоколе. Способ упаковки и концентрирования вирусов в этом протоколе прост и легко повторяется и не опирается на какой-либо другой вспомогательный концентрированный реагент. Этот протокол можно успешно соблюдать в большинстве лабораторий. Для обеспечения качества концентрированного вируса особого внимания требуют следующие моменты. Одним из них является клеточный статус HEK-293T. Хотя клетки HEK-293T являются увековеченными клетками, клетки, используемые для создания концентрированного вируса, должны быть здоровыми клетками в течение 10 проходов (титр уменьшается с более высокими проходами).
Другим критическим моментом является доля используемого трансфекционного реагента (в данном случае липофектамина). Поскольку клетки повреждаются после добавления трансфекционного реагента, отношение реагента к плазмидам необходимо неоднократно проверять, чтобы обеспечить оптимальное состояние клеток и качество вируса. Соотношение 2:1 трансфекционного реагента к плазмидам наиболее подходит для клеток HEK-293T для упаковки вируса в этой системе. Кроме того, все этапы требуют бережного обращения на протяжении всего процесса. Поскольку вирусные частицы могут всасываться после покрытия, которое влияет на титр вируса, не рекомендуется покрывать блюдо какой-либо матрицей при упаковке вируса. Из-за возможности отслоения HEK-293T супернатант необходимо заменять осторожно, особенно при добавлении свежей среды после сбора супернатанта вируса через 24 ч. Некоторые другие соображения включают плотность клеток, продолжительность времени трансфекции и содержание сыворотки в среде. Это важные вопросы, которые влияют на эффективность трансфекции. Условия, представленные в этом протоколе, являются наиболее подходящими, основанными на результатах, полученных после многих повторных экспериментов.
В процессе прямого перепрограммирования на меланоциты важно учитывать состояние исходных клеточных MEF и плотность MEF, используемых для прямого перепрограммирования. Перед началом прямого перепрограммирования MEF должны быть культивированы в чашках с культурой клеток без покрытия. Клетки в фазе пролиферации (40-50% слияние) следует отбирать для прямого перепрограммирования; эффективность инфекции снижается с увеличением плотности клеток. Перепрограммированные клетки должны быть покрыты желатиновыми культуральными блюдами.
Продолжительность времени, необходимого вирусу для заражения клеток, также имеет решающее значение; слишком длительное время заражения ухудшит выживание клеток, тогда как слишком короткое время заражения снизит эффективность. Было установлено, что восемь часов подходят для концентрированного вируса для заражения MEF в этом протоколе. Последним критическим моментом является правильный способ изменения среды перепрограммирования. MEF необходимо адаптироваться к новой среде. Состояние клеток должно проверяться каждый день, а среда должна быть тщательно изменена в соответствии со статусом клетки. Слишком быстрая смена среды перепрограммирования приведет к гибели большого количества клеток.
При культивировании и субкультурировании iMels плотность прохождения клеток имеет решающее значение. iMels нуждается в относительно высокой плотности для поддержания роста. Клеточные синапсы должны контактировать друг с другом для нормальной пролиферации этих клеток. Если плотность слишком низкая, клетки могут перестать размножаться. Здесь плотность 3 × 104/см2 была признана подходящей плотностью прохода для iMels. После 5 проходов iMels начинают стареть (рисунок 2B); меланин в это время более зрелый, и полученные клетки могут быть использованы для иммунофлуоресценции, DOPA или окрашивания Массона-Фонтана. Более ранние проходы клеток могут быть использованы для ОТ-ПЦР, потому что экспрессия генов будет изменяться на относительно ранней стадии.
Хотя прямое перепрограммирование широко изучено, существует мало исследований по прямому перепрограммированию фибробластов в меланоциты. В различных исследованиях использовались разные факторы транскрипции14,15, что привело к большой путанице. Этот протокол объясняет, как производить высококачественные концентрированные вирусы и проверять несколько факторов транскрипции, чтобы выбрать наиболее важные для прямого перепрограммирования на меланоциты. Среду дополняли питательными факторами для прямого перепрограммирования на меланоциты в этом протоколе (таблица 2). Наконец, функциональные iMels были успешно идентифицированы. Четкая и оптимизированная система прямого перепрограммирования меланоцитов может обеспечить новые стратегии лечения заболеваний депигментации, таких как витилиго.
Тем не менее, есть еще некоторые ограничения для технологии, представленной в этой статье. Во-первых, трудно оценить эффективность этого протокола. Редактирование гена CRISPR-Cas9 может быть объединено с этим протоколом для вбивания меланоцитарных генов, таких как Tyr или Tyrp-1, в исходные клетки для наблюдения за процентом индуцированных клеток во время процесса перепрограммирования. Кроме того, система интродукции лентивируса, используемая в этом протоколе, может нести риск рекомбинации генов и мутации вставки19. В будущем могут быть использованы более эффективные и безопасные методы внедрения, такие как невирусные рекомбинантные векторы экспрессии белка или векторы мРНК. Эксперимент по этому протоколу все еще находится на стадии in vitro . Следующим шагом является перепрограммирование меланоцитов непосредственно in vivo, в результате чего непигментированная кожа становится пигментированной, и использование системы прямого перепрограммирования для разработки эффективного лечения витилиго.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82070638 и 81770621) и Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
