Summary
Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.
Abstract
La pérdida de función de los melanocitos conduce al vitiligo, que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Actualmente, no existe un tratamiento efectivo a largo plazo para el vitiligo. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un tratamiento conveniente y efectivo para el vitiligo. La tecnología de medicina regenerativa para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos parece ser un nuevo tratamiento prometedor para el vitiligo. Esto implica la reprogramación directa de las células de la piel del paciente en melanocitos funcionales para ayudar a mejorar la pérdida de melanocitos en pacientes con vitiligo. Sin embargo, este método debe probarse primero en ratones. Aunque la reprogramación directa es ampliamente utilizada, no existe un protocolo claro para la reprogramación directa en melanocitos. Además, el número de factores de transcripción disponibles es abrumador.
Aquí, se presenta un protocolo de sistema de empaquetado de lentivirus concentrados para producir factores de transcripción seleccionados para reprogramar células de la piel a melanocitos, incluidos Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2. Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se infectaron con el lentivirus concentrado para todos estos factores de transcripción para la reprogramación directa de los MEF en melanocitos inducidos (iMels) in vitro. Además, se examinaron estos factores de transcripción y se optimizó el sistema para la reprogramación directa a los melanocitos. La expresión de los marcadores característicos de melanina en iMels a nivel de gen o proteína aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos podría ser una nueva estrategia terapéutica exitosa para el vitiligo y confirmar el mecanismo de desarrollo de melanocitos, que proporcionará la base para una mayor reprogramación directa de fibroblastos en melanocitos in vivo.
Introduction
El vitiligo es una enfermedad de la piel que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Por diversas razones, incluyendo anomalías metabólicas, estrés oxidativo, generación de mediadores inflamatorios, desprendimiento celular y respuesta autoinmune, los melanocitos funcionales se pierden y se detiene la secreción de melanina, lo que lleva al desarrollo de vitiligo 1,2. Esta condición ocurre ampliamente y es particularmente problemática en la cara. El tratamiento principal es el uso sistémico de corticosteroides e inmunomoduladores. La fototerapia se puede utilizar para enfermedades sistémicas o locales, y existen tratamientos quirúrgicos, como el trasplante de piel perforada y el trasplante autólogo de melanocitos 3,4,5. Sin embargo, los pacientes que usan terapia farmacológica y fototerapia son propensos a la recaída, y estos tratamientos tienen efectos terapéuticos pobres a largo plazo. El tratamiento quirúrgico es traumático y sólo moderadamente efectivo 2,6. Por lo tanto, se necesita una estrategia terapéutica nueva y efectiva para el vitiligo.
La reprogramación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) revierte estas células de su estado terminal a un estado pluripotente, un proceso mediado por los factores de transcripción, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc7. Sin embargo, debido a la posibilidad de tumorigenicidad y al largo tiempo de producción, esta tecnología ha sido recibida con escepticismo cuando se aplica a entornos clínicos8. La reprogramación directa es una tecnología que hace que un tipo de célula terminal se transforme en otro tipo de célula terminal9. Este proceso se logra mediante factores de transcripción adecuados. Varias células ya han sido reprogramadas directamente con éxito, incluyendo cardiomiocitos10, neuronas11 y células ciliadas cocleares12. Algunos investigadores incluso han reprogramado el tejido de la piel directamente in situ, que se puede utilizar para la reparación de heridas13. Las ventajas de la reprogramación directa incluyen tiempos y costos de espera reducidos, menor riesgo de cáncer, menos problemas éticos y una mejor comprensión del mecanismo subyacente a la determinación del destino celular9.
Aunque el método de reprogramación directa es ampliamente utilizado, actualmente no existe un método definido para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos, especialmente debido a los numerosos factores de transcripción que deben considerarse14,15. Los factores de transcripción, Mitf, Sox10 y Pax3, se han utilizado para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos14. En contraste, la combinación de MITF, PAX3, SOX2 y SOX9 también se ha utilizado para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos humanos en otro estudio15. En este protocolo, a pesar del uso de un método de cribado diferente, se obtuvo el mismo resultado con la combinación de Mitf, Sox10 y Pax3 para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos como se describió anteriormente14. El desarrollo de un sistema para generar melanocitos a partir de otras células de la piel puede proporcionar un esquema para transformar otras células de la piel de pacientes con vitiligo en melanocitos. Por lo tanto, es crucial construir un método simple y eficiente para que esta reprogramación directa genere melanocitos con éxito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este trabajo fue aprobado por el Comité de Manejo y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Los experimentos se realizaron en estricta conformidad con los estándares establecidos por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). No hubo experimentos con humanos, por lo que este trabajo no necesitó la aprobación del comité de ética de investigación humana. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos.
1. Construcción de un sistema concentrado de envasado de lentivirus para factores de transcripción
- Producción del virus concentrado (Figura 1A, B)
- Placa 1,5 × 106 células HEK-293T en una placa de 60 mm y cultivar estas células con medio normal (ver Tabla 1) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
NOTA: Si el virus necesita ser empaquetado en lotes, se puede utilizar una placa de cultivo celular de 100 mm (para más detalles, consulte la Tabla 2). - Después de 24 h, asegúrese de que las células HEK-293T hayan alcanzado el 80-90% de confluencia el día de la transducción, y reemplace el medio con 3,5 ml de DMEM (150 μL de DMEM por 1 cm2). Dejar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante 2 h.
NOTA: El medio de reemplazo debe estar libre de suero, de modo que las células puedan estar "hambrientas" para una mejor transfección de plásmidos. - Preparar la mezcla de plásmidos (mezcla A) que contenga 3 μg de los plásmidos diana de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 o Snai2; 1 μg del plásmido envasador PMD2. G, y 2 μg del plásmido empaquetador PSPAX2. Enrasar el volumen de la mezcla A a 150 μL con DMEM sin suero. Prepare la mezcla del reactivo de transfección (mezcla B) agregando 12 μL del reactivo de transfección (el volumen es el doble de la masa total de todos los plásmidos) y componga el volumen de la mezcla B a 150 μL con DMEM sin suero.
NOTA: Al preparar las mezclas, es importante agregar líquido lentamente para evitar burbujas de aire. - Combine la mezcla A y la mezcla B después de dejar que permanezcan durante 5 minutos a temperatura ambiente. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min para formar el complejo de transfección.
- Saque las células HEK-293T de la incubadora, reemplace el medio con DMEM + 2% FBS, agregue la mezcla del paso 1.1.4 gota a gota y mezcle el líquido suavemente.
- Después de 8 h, cambie el medio con 3,5 ml de medio normal. Después de cambiar el medio, recoger el sobrenadante del virus cada 24 h y 48 h.
- Mezcle los sobrenadantes del virus recolectados en dos puntos de tiempo diferentes. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Pase el sobrenadante a través de filtros de 0,45 μm y recójalo en un tubo cónico estéril de 50 ml.
NOTA: El virus recogido a las 24 h puede almacenarse a 4 °C y mezclarse con el virus recogido a las 48 h. - Concentrar el sobrenadante del virus centrifugando a 6000 × g a 4 °C durante la noche (~16 h). Asegúrese de que el gránulo del virus sea visible en la parte inferior del tubo cónico después de la centrifugación.
- Vierta el sobrenadante lentamente. Disolver el gránulo del virus en un volumen de medio normal que sea 1/100th del volumen del sobrenadante del virus. Usando una micropipeta P1000, pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente hasta obtener una mezcla homogénea. Divida el virus concentrado en tubos de microcentrífuga según sea necesario. Conservar a -80 °C.
NOTA: El virus se concentra 100 veces con este método. El virus concentrado (100x) se puede almacenar durante >1 año a -80 °C. Evite la congelación y descongelación repetidas del virus.
- Placa 1,5 × 106 células HEK-293T en una placa de 60 mm y cultivar estas células con medio normal (ver Tabla 1) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Detección del título concentrado del virus (Figura 1C)
- La placa 1 × 105 células HEK-293T en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Recuerda añadir uno bien como control negativo. Cultive estas células con medio normal a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Añadir 0,1 μL o 0,2 μL de virus concentrado fluorescente (100x) a cada pocillo después de 24 h, y añadir 4 ng/μL del reactivo de transfección polimérica catiónica a cada pocillo. Aproximadamente 8-12 h después de la infección, reemplace el medio con el medio normal.
NOTA: Para garantizar la precisión y la eficiencia de la detección de fluorescencia, la tasa de infección debe ser del 10-30%. La adición de 0,1 μL o 0,2 μL del virus concentrado fluorescente puede mantener la eficiencia de la infección dentro de este rango. El título concentrado del virus puede alcanzar 1 × 108 unidades transductoras (TU)/ml como mínimo. - Aproximadamente 48 h después de la infección, lave el plato con 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas.
- Tripsinizar estas células usando 250 μL de tripsina-EDTA al 0,05% por pocillo en una placa de 6 pocillos durante 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C y luego retirar el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet celular en 1 ml de PBS, agregue la suspensión a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml y detecte la eficiencia de infección de la fluorescencia del virus (proteína fluorescente verde, GFP +) utilizando citometría de flujo.
- Calcule el título concentrado del virus utilizando la siguiente fórmula: 105 (volumen celular) × tasa de infección (GFP+%)/volumen de virus añadido (0,1 μL o 0,2 μL).
2. Reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos (Figura 2A)
- Cubra un pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con 1 ml de solución de gelatina al 0,1% a temperatura ambiente durante 15-30 min. Asegúrese de que el pozo esté completamente cubierto con la solución de gelatina al 0,1%. Aspire la solución de gelatina al 0,1% después del recubrimiento.
NOTA: Prepare una solución de gelatina al 0,1% (100 ml) de la siguiente manera: 0,1 g de gelatina en polvo se disuelven en 100 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio en autoclave y luego se almacenan a 4 ° C durante no más de 2 meses. - La placa 5 × 104 MEFs en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con gelatina al 0,1% (como en el paso 2.1), y cultiva estas células con medio normal a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante la noche.
- Pasadas las 24 h, confirmar que los MEFs han alcanzado el 40-50% de confluencia. Reemplace el medio por el medio normal.
- El día 0, saque el virus concentrado del congelador y derrita el virus en hielo. Calcule el volumen del virus que se agregará mediante eq. (1). Agregue el virus concentrado para los seis factores de transcripción, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 y Snai2 (consulte la Tabla de materiales) a cada pozo de acuerdo con el volumen calculado, y luego agregue 4 μg / ml del agente de transfección polimérica catiónica.
Número de células (5 × 104) × 30 (multiplicidad de infección, MOI)/título de virus (1) - El día 1, 8-12 h después de la infección, retire el medio que contiene el virus y reemplácelo con un medio normal fresco mientras agrega 0.5 μg / ml de puromicina para detectar líneas celulares infectadas estables.
- El día 2, 48 h después de la infección, reemplace el medio sobrenadante gradualmente con el medio de reprogramación. Primero, cambie 1/4 del volumen medio total y agregue 3 μM CHIR99021.
- Desde el día 3 hasta el día 7, dependiendo de la condición de las celdas, cambie el medio reemplazando con una mayor proporción de medio de reprogramación (ver Tabla 1) gradualmente, y cambie a un medio de reprogramación completo dentro de los 5 días.
NOTA: Durante este período, puromycin y CHIR99021 deben usarse todos los días. Muchas células muertas aparecerán el primer y segundo día de cambio del medio de reprogramación. Esto es normal a medida que las células se adaptan gradualmente a la transformación. Por lo tanto, el medio debe cambiarse gradualmente para garantizar la proliferación saludable de las células. - Para pasar las células, agregue 500 μL de tripsina-EDTA al 0.05% para digerir las células durante 3 minutos a temperatura ambiente. Cuando ~ 60% de las células han flotado, detenga la digestión agregando un medio normal 2 veces el volumen de la enzima digestiva. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 15 ml, centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante, resuspendir el pellet celular con el medio de reprogramación y colocar las células en una placa estéril de 60 mm a una densidad de 3 × 104/cm2. Cultive estas células a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 .
NOTA: Desde el día 8 hasta el día 21, estas células se subcultivan cada 3-5 días y se cultivan en platos estériles de 60 mm para expandirse. Se pueden cultivar para llegar al menos al pasaje 5.
3. Optimización para la reprogramación e identificación directa
- Detección de los factores de transcripción optimizados
- Repita los pasos 2.1-2.7, reduciendo uno de los seis factores de transcripción cada vez. Infectar los MEF con el virus con combinaciones de cinco factores de transcripción.
- Siete días después de la infección, extraer el ARN de estas células16 y analizar los niveles de expresión de sus genes melanocíticos mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR)17 para detectar los factores de transcripción con mayor impacto en la conversión a melanocitos eliminándolos uno por uno (Figura 3A).
- Utilice los tres principales factores de transcripción que afectan la conversión a melanocitos para infectar los MEF. Repita los pasos 2.1 a 2.7.
NOTA: Siete días después de la infección, los genes melanocíticos deben ser detectables en estas células transformadas (Figura 3B). La información de imprimación para la caracterización de iMels se incluye en la Tabla 3.
- Identificación de melanocitos inducidos (iMels)
- Utilice la tinción de inmunofluorescencia18 para verificar que los iMels expresan proteínas melanocíticas, incluyendo TYRP-1 y DCT (Figura 4A).
- Tinción de 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) específica de melanina (Figura 4B)
- Prepare paraformaldehído al 4% (10 ml) de la siguiente manera: disuelva 0,4 g de polvo de paraformaldehído en 10 ml de PBS. Coloque la solución en un horno a 56 °C durante 2 h para promover la disolución.
NOTA: La solución se puede mantener a 4 °C durante no más de un mes. - Cultive los iMels en un plato de 30 mm y lave el plato dos veces con PBS precalentado. Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% para fijar las células durante 20 minutos y lave el plato 3 veces con PBS.
- Prepare la solución de tinción de DOPA al 0,1% (10 ml) justo antes de su uso disolviendo 0,01 g de polvo de L-DOPA en 10 ml de PBS. Coloque la solución en un baño de agua a 37 °C durante 30 min; agitarlo varias veces para promover la disolución.
- Agregue 1 ml de solución de tinción de DOPA al 0,1% recién preparada. Incubar en un horno a 37 °C durante 2-5 h. Si no hay partículas marrón-negras, continúe incubando a 37 °C durante otras 2 h, pero no durante >5 h. Compruebe las muestras cada 30 minutos.
- Lave el plato 3 veces con PBS durante 1 minuto cada vez. Mante el núcleo con 1 ml de solución de tinción de hematoxilina durante 2 min.
- Para el almacenamiento a largo plazo, deshidrate las muestras con etanol al 95% durante 3 minutos y luego etanol al 100% durante 5 minutos. Selle el plato con xileno y bálsamo neutro.
- Prepare paraformaldehído al 4% (10 ml) de la siguiente manera: disuelva 0,4 g de polvo de paraformaldehído en 10 ml de PBS. Coloque la solución en un horno a 56 °C durante 2 h para promover la disolución.
- Tinción de Masson-Fontana específica de melanina (Figura 4B)
- Placa iMels en un plato de 30 mm y fijar las células con 4% de paraformaldehído durante 20 min; lavar el plato 3 veces con PBS.
- Agregue 1 ml de solución A (solución de plata de amoníaco) del kit de tinción Masson-Fontana (consulte la Tabla de materiales), coloque el plato en una caja oscura y coloque la caja oscura en un horno a 56 ° C durante 15-40 min.
NOTA: Si las partículas marrón-negras no son visibles después de 15 min en el horno, devuelva las muestras al horno de 56 °C para continuar incubando, pero no durante >40 min. Se puede agregar un poco de agua a la caja oscura para evitar que se seque. - Aspirar la solución A y lavar el plato 5-6 veces con agua destilada, 1-2 min cada vez.
- Agregue 1 ml de solución B (hipo solución) del kit de tinción Masson-Fontana y deje el plato a temperatura ambiente durante 3-5 min.
- Aspire la solución B y lave el plato con agua del grifo 3 veces, 1 min cada vez.
- Agregue 1 ml de solución C (tinte rojo neutro) del kit de tinción Masson-Fontana y deje el plato a temperatura ambiente durante 3-5 min.
- Aspirar la solución C y lavar el plato 3 veces con agua destilada, 1 min cada vez.
- Agregue 1 ml de etanol al 100% para una deshidratación rápida y aspire el etanol después de 3 min.
NOTA: Las muestras teñidas se pueden almacenar durante mucho tiempo después del sellado con xileno y bálsamo neutro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este artículo incluye los protocolos de un sistema concentrado de empaquetado de lentivirus para producir lentivirus de factores de transcripción para la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos y protocolos para la detección de factores de transcripción y reprogramación directa de melanocitos a partir de MEFs.
El éxito de la producción concentrada de lentivirus se evaluó observando la intensidad de fluorescencia de GFP (Figura 1A) o por citometría de flujo (Figura 1B) después de infectar células HEK-293T durante 48 h con lentivirus no concentrado (1x) y lentivirus concentrado (100x). El título del virus concentrado fue de 108 TU /ml o más, lo cual es relativamente alto (Figura 1C).
La reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos se logra a través de la infección con lentivirus del factor de transcripción y la transformación con el medio de reprogramación optimizado. El esquema para la generación de iMels a partir de MEFs se muestra en la Figura 2A. La morfología celular cambia gradualmente durante la reprogramación directa. Las sinapsis celulares se alargan y los núcleos celulares se agrandan. Sin embargo, estas células envejecen gradualmente después de ~ Día 20 (~ 5 pasajes) (Figura 2B).
Se eliminó un factor de transcripción a la vez del conjunto original de seis factores de transcripción (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 y Snai2) para determinar el factor de transcripción con el mayor impacto en la reprogramación. La eliminación de Mitf, Pax3 o Sox10 resultó en el silenciamiento de la expresión de los genes melanocíticos Tyr, Tyrp1 y Mlana (Figura 3A), lo que indica que estos tres factores de transcripción tuvieron el mayor impacto en la conversión de fibroblastos a melanocitos. La expresión de genes melanocíticos inducida por reprogramación directa con tres factores de transcripción fue mayor que la de los seis factores de transcripción (Figura 3B).
Finalmente, se identificaron las características de los iMels obtenidas mediante el uso de este sistema optimizado de reprogramación directa. La expresión de marcadores melanocíticos (TYR, TYYP1) se detectó mediante tinción inmunofluorescente (Figura 4A). Los métodos de tinción específicos de melanina, incluida la DOPA y la tinción de Masson-Fontana, también mostraron resultados positivos (Figura 4B).
Figura 1: Producción de virus concentrados y estimación del título. (A) Intensidad de fluorescencia de GFP después de infectar células HEK-293T con lentivirus no concentrado (1x) y lentivirus concentrado (100x) (B) Comparación de las tasas de infección de lentivirus no concentrado (1x) y lentivirus concentrado (100x) detectados por citometría de flujo. (C) Estimación del título del lentivirus concentrado. Barras de escala = 250 μm. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; TU = unidades de transducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de iMels a partir de MEFs. (A) Diagrama esquemático de la generación de iMels. (B) Cambios en la morfología celular durante la conversión de MEFs a iMels en reprogramación directa el día 0, día 3, día 10 y día 20+. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: iMels = melanocitos inducidos; MEFs = fibroblastos embrionarios de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Detección de factores de transcripción optimizados. (A) qRT-PCR de los niveles de ARNm de Tyr, Tyrp1 y Mlana en células transducidas con cinco factores de transcripción (se ha eliminado uno de los seis factores de transcripción originales). MEF + EV y MEF + 6F se utilizan como control negativo y control positivo, respectivamente. La expresión de ARNm se normaliza a la expresión de Gapdh. (B) qRT-PCR de los niveles de ARNm de Tyr, Tyrp1 y Mlana en células transducidas con los seis factores de transcripción originales y con tres factores de transcripción. MEF, MEF + EV y MMC se utilizan como un control negativo y positivo en blanco, respectivamente. Los niveles de ARNm se normalizan a los niveles de Gapdh. Todos los valores son medios ± SD de tres experimentos independientes. Las secuencias de imprimación se muestran en la Tabla 3. Abreviaturas: qRT-PCR = PCR cuantitativa de transcripción inversa; MEF = fibroblastos embrionarios de ratón; MEF+EV = fibroblastos embrionarios de ratón + vector vacío; MMC = melanocito de ratón; 6F = seis factores de transcripción que comprenden Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 y Snai2; 3F: tres factores de transcripción que comprenden Mitf, Pax3 y Sox10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación funcional de iMels. (A) Inmunotinción de marcadores melanocíticos (TYR, TYYP1) en iMels. Barra de escala = 50 μm. Consulte la Tabla de materiales para la dilución de los anticuerpos utilizados en este estudio. (B) Tinción de Masson-Fontana y tinción de DOPA. MEF y la línea celular Melan-a se utilizan como control negativo y control positivo, respectivamente. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: iMels = melanocitos inducidos; DOPA = 3,4-dihidroxifenilalanina; MEF = fibroblasto embrionario de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componentes | Dosis (concentración, volumen) | Concentración final | |
| Medio normal (100 ml) | DMEM/GLUCOSA ALTA | 89 ml | |
| FBS inactivado por calor | 10 ml | ||
| Antibióticos (pluma/estreptococo) | 10000 U/mL, 1 ml | 100 U/ml | |
| Medio de reprogramación (100 mL) | RPMI-1640 | 88 ml | |
| FBS inactivado por calor | 10 ml | ||
| SCF humano recombinante | 200 μg/ml, 50 μL | 100 ng/ml | |
| bFGF humano recombinante | 4 μg/ml, 250 μL | 10 ng/ml | |
| Insulina humana recombinante | 10 mg/ml, 50 μL | 5 μg/ml | |
| EDN3 humano | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Toxina del cólera | 0,3 mg/ml, 0,56 μL | 20 pM | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hidrocortisona | 100 μg/ml, 500 μL | 0,5 μg/ml | |
| Adenina | 40 mg/ml, 60 μL | 24 μg/ml |
Tabla 1: Componentes de los medios normales y de reprogramación.
| Plato de cultura | Densidad de siembra (células/plato) | Medio (ml) | Sistema de plásmidos | Reactivo de transfección (μL) | ||
| Plásmido objetivo (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 milímetros | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 milímetros | 1,5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 milímetros | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tabla 2: Detalles del sistema de envasado de lentivirus.
| Cartillas RT-PCR | |
| Blanco | Conjuntos de imprimación |
| Gapdh | Adelante: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Reverso: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | Delantero: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Reverso: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | Adelante: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Reverso: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT | |
| Mlana | Adelante: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Reverso: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tabla 3: Información de la imprimación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La calidad del virus es crucial para el éxito de la reprogramación directa a los melanocitos en este protocolo. El método de envasado y concentración de virus en este protocolo es simple y fácil de repetir y no depende de ningún otro reactivo concentrado auxiliar. Este protocolo se puede seguir con éxito en la mayoría de los laboratorios. Para garantizar la calidad del virus concentrado, los siguientes puntos necesitan una atención especial. Uno es el estado celular de HEK-293T. Aunque las células HEK-293T son células inmortalizadas, las células utilizadas para hacer el virus concentrado deben ser células sanas dentro de 10 pasajes (el título disminuye con pasajes más altos).
Otro punto crítico es la proporción del reactivo de transfección (en este caso, lipofectamina) utilizado. Como las células se dañan después de agregar el reactivo de transfección, la proporción del reactivo a los plásmidos debe verificarse repetidamente para garantizar la condición óptima de las células y la calidad del virus. La proporción 2:1 del reactivo de transfección a los plásmidos es la más adecuada para las células HEK-293T para empaquetar el virus en este sistema. Además, todos los pasos requieren un manejo suave durante todo el proceso. Como las partículas de virus pueden absorberse después del recubrimiento, lo que afecta el título del virus, no es aconsejable cubrir el plato con ninguna matriz al envasar el virus. Debido a la posibilidad de desprendimiento de HEK-293T, el sobrenadante debe reemplazarse con cuidado, especialmente cuando se agrega medio fresco después de recolectar el sobrenadante del virus después de 24 h. Algunas otras consideraciones incluyen la densidad celular, la duración del tiempo de transfección y el contenido sérico en el medio. Estas son cuestiones importantes que afectan la eficiencia de la transfección. Las condiciones presentadas en este protocolo son las más adecuadas, basadas en los resultados obtenidos después de muchos experimentos repetidos.
En el proceso de reprogramación directa a los melanocitos, es importante considerar el estado de los MEF celulares originales y la densidad de los MEF utilizados para la reprogramación directa. Antes de comenzar la reprogramación directa, los MEF deben cultivarse en platos de cultivo celular no recubiertos. Las células en fase de proliferación (40-50% de confluencia) deben seleccionarse para la reprogramación directa; la eficiencia de la infección disminuye con el aumento de la densidad celular. Las células reprogramadas deben ser chapadas en platos de cultivo recubiertos de gelatina.
El tiempo necesario para que el virus infecte las células también es crítico; un tiempo de infección demasiado largo afectará la supervivencia celular, mientras que un tiempo de infección demasiado corto reducirá la eficiencia. Se encontró que ocho horas eran apropiadas para que el virus concentrado infectara a los MEF en este protocolo. El último punto crítico es la forma correcta de cambiar el medio de reprogramación. Los MEF necesitan adaptarse a un nuevo medio. El estado de las celdas debe verificarse todos los días y el medio debe cambiarse cuidadosamente de acuerdo con el estado de la celda. Cambiar el medio de reprogramación demasiado rápido hará que muera un gran número de células.
Al cultivar y subculpir iMels, la densidad de paso de las células es crítica. Los iMels necesitan una densidad relativamente alta para mantener el crecimiento. Las sinapsis celulares deben estar en contacto entre sí para la proliferación normal de estas células. Si la densidad es demasiado baja, las células pueden dejar de proliferar. Aquí, se encontró que la densidad de 3 × 104 / cm2 es una densidad de paso adecuada para iMels. Después de 5 pasajes, los iMels comienzan a envejecer (Figura 2B); la melanina está más madura en este momento, y las células resultantes se pueden usar para la inmunofluorescencia, DOPA o tinción de Masson-Fontana. Los pasajes anteriores de las células se pueden usar para RT-PCR porque la expresión de los genes cambiará en una etapa relativamente temprana.
Aunque la reprogramación directa es ampliamente estudiada, hay poca investigación sobre la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos. Diferentes estudios han utilizado diferentes factores de transcripción14,15, lo que lleva a mucha confusión. Este protocolo explica cómo producir virus concentrados de alta calidad y examinar varios factores de transcripción para seleccionar los más importantes para la reprogramación directa de los melanocitos. El medio se complementó con factores nutricionales para la reprogramación directa a melanocitos en este protocolo (Tabla 2). Finalmente, los iMels funcionales se identificaron con éxito. El sistema de reprogramación directa de melanocitos claro y optimizado podría proporcionar nuevas estrategias de tratamiento para enfermedades de despigmentación como el vitiligo.
Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones para la tecnología presentada en este artículo. En primer lugar, es difícil estimar la eficiencia de este protocolo. La edición de genes CRISPR-Cas9 podría combinarse con este protocolo para introducir genes melanocíticos, como Tyr o Tyrp-1, en las células iniciales para observar el porcentaje de células inducidas durante el proceso de reprogramación. Además, el sistema de introducción de lentivirus utilizado en este protocolo puede conllevar el riesgo de recombinación de genes y mutación de inserción19. En el futuro, se podrían utilizar métodos de introducción más eficientes y seguros, como vectores de expresión de proteínas recombinantes no virales o vectores de ARNm. El experimento en este protocolo aún se encuentra en la etapa in vitro . El siguiente paso es reprogramar los melanocitos directamente in vivo, haciendo que la piel no pigmentada se pigmente y utilizar el sistema de reprogramación directa para diseñar un tratamiento eficaz del vitiligo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue parcialmente apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070638 y 81770621) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
