Summary
Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.
Abstract
Melanositlerin fonksiyon kaybı, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen vitiligoya yol açar. Halen, vitiligo için etkili bir uzun süreli tedavi yoktur. Bu nedenle, vitiligo için uygun ve etkili bir tedavi geliştirmek zorunludur. Cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için rejeneratif tıp teknolojisi, vitiligo'nun umut verici yeni bir tedavisi gibi görünmektedir. Bu, vitiligolu hastalarda melanosit kaybını iyileştirmeye yardımcı olmak için hastanın cilt hücrelerinin fonksiyonel melanositlere doğrudan yeniden programlanmasını içerir. Bununla birlikte, bu yöntemin önce fareler üzerinde test edilmesi gerekir. Doğrudan yeniden programlama yaygın olarak kullanılmasına rağmen, melanositlere doğrudan yeniden programlama için net bir protokol yoktur. Dahası, mevcut transkripsiyon faktörlerinin sayısı çok fazladır.
Burada, cilt hücrelerini melanositlere yeniden programlamak için seçilen transkripsiyon faktörlerini üretmek için Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ve Snai2 dahil olmak üzere konsantre bir lentivirüs paketleme sistemi protokolü sunulmaktadır. Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), MEF'lerin in vitro olarak indüklenmiş melanositlere (iMel'ler) doğrudan yeniden programlanması için tüm bu transkripsiyon faktörleri için konsantre lentivirüs ile enfekte olmuştur. Ayrıca, bu transkripsiyon faktörleri tarandı ve sistem melanositlere doğrudan yeniden programlama için optimize edildi. iMel'lerde melaninin karakteristik belirteçlerinin gen veya protein seviyesinde ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanmasının vitiligo için başarılı bir yeni terapötik strateji olabileceğini ve fibroblastların in vivo melanositlere doğrudan yeniden programlanması için temel oluşturacak melanosit gelişim mekanizmasını doğrulayabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Vitiligo, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen bir cilt hastalığıdır. Metabolik anormallikler, oksidatif stres, inflamatuar mediatörlerin oluşumu, hücre dekolmanı ve otoimmün yanıt gibi çeşitli nedenlerden dolayı, fonksiyonel melanositler kaybolur ve melanin salgılanması durdurulur ve vitiligo 1,2'nin gelişmesine yol açar. Bu durum yaygın olarak görülür ve özellikle yüzünde sorunludur. Ana tedavi kortikosteroidlerin ve immünomodülatörlerin sistemik kullanımıdır. Fototerapi sistemik veya lokal hastalıklarda kullanılabilmekte olup, delikli deri nakli ve otolog melanosit transplantasyonu gibi cerrahi tedaviler vardır 3,4,5. Bununla birlikte, ilaç tedavisi ve fototerapi kullanan hastalar nüksetmeye eğilimlidir ve bu tedavilerin uzun vadeli terapötik etkileri zayıftır. Cerrahi tedavi travmatiktir ve sadece orta derecede etkilidir 2,6. Bu nedenle vitiligo için yeni ve etkili bir tedavi stratejisine ihtiyaç vardır.
İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) yeniden programlanması, bu hücreleri terminal durumlarından pluripotent bir duruma çevirir, bu da transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc7 tarafından aracılık edilen bir süreçtir. Bununla birlikte, tümörojenisite olasılığı ve uzun üretim süresi nedeniyle, bu teknoloji klinik ortamlara uygulandığında şüphecilikle karşılanmıştır8. Doğrudan yeniden programlama, bir terminal hücresi türünün başka bir terminal hücresi türüne dönüşmesini sağlayan bir teknolojidir9. Bu işlem uygun transkripsiyon faktörleri ile elde edilir. Kardiyomiyositler10, nöronlar 11 ve koklear saç hücreleri12 dahil olmak üzere çeşitli hücreler doğrudan başarıyla yeniden programlanmıştır. Bazı araştırmacılar, cilt dokusunu doğrudan in situ olarak yeniden programlamışlardır, bu da yara onarımı için kullanılabilir13. Doğrudan yeniden programlamanın avantajları arasında daha az bekleme süresi ve maliyeti, daha düşük kanser riski, daha az etik sorun ve hücre kaderinin belirlenmesinin altında yatan mekanizmanın daha iyi anlaşılmasıyer almaktadır 9.
Doğrudan yeniden programlama yöntemi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, özellikle14,15 olarak kabul edilecek çok sayıda transkripsiyon faktörü nedeniyle, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için şu anda kesin bir yöntem yoktur. Transkripsiyon faktörleri, Mitf, Sox10 ve Pax3, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için kullanılmıştır14. Buna karşılık, MITF, PAX3, SOX2 ve SOX9'un kombinasyonu, başka bir çalışmada cilt hücrelerinin insan melanositlerine doğrudan yeniden programlanması için de kullanılmıştır15. Bu protokolde, farklı bir tarama yönteminin kullanılmasına rağmen, daha önce tarif edildiği gibi cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için Mitf, Sox10 ve Pax3 kombinasyonu ile aynı sonuç elde edilmiştir14. Diğer cilt hücrelerinden melanosit üretmek için bir sistem geliştirmek, vitiligo hastalarının diğer cilt hücrelerini melanositlere dönüştürmek için bir şema sağlayabilir. Bu nedenle, melanositleri başarılı bir şekilde üretmek için bu doğrudan yeniden programlama için basit ve etkili bir yöntem oluşturmak çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Jiangsu Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yönetimi ve Kullanım Komitesi (UJS-IACUC-AP--20190305010) tarafından onaylanmıştır. Deneyler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC International) tarafından belirlenen standartlara sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. İnsanları içeren hiçbir deney yoktu, bu yüzden bu çalışmanın insan araştırma etik komitesinden onay alması gerekmiyordu. Reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Transkripsiyon faktörleri için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin yapımı
- Konsantre virüsün üretimi (Şekil 1A, B)
- Plaka 1.5 × 106 HEK-293T hücrelerini 60 mm'lik bir kaba yerleştirin ve bu hücreleri normal ortamla (bakınız Tablo 1) 37 °C'de %5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde kültürealın.
NOT: Virüsün gruplar halinde paketlenmesi gerekiyorsa, 100 mm'lik bir hücre kültürü kabı kullanılabilir (ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız). - 24 saat sonra, HEK-293T hücrelerinin transdüksiyon gününde% 80-90 birleşime ulaştığından emin olun ve ortamı 3.5 mL DMEM (1cm2 başına 150 μL DMEM) ile değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 2 saat boyunca% 5 CO2 ile bırakın.
NOT: Değiştirme ortamı serumsuz olmalıdır, böylece hücreler daha iyi plazmid transfeksiyonu için "açlıktan ölebilir". - Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 veya Snai2'nin hedef plazmidlerinin 3 μg'sini içeren plazmidlerin (karışım A) karışımını hazırlayın; 1 μg ambalaj plazmidi PMD2. G ve PSPAX2 ambalaj plazmidinin 2 μg'ı. Serumsuz DMEM ile A ila 150 μL karışımının hacmini oluşturun. Transfeksiyon reaktifinin 12 μL'sini ekleyerek transfeksiyon reaktifinin karışımını (B karışımı) hazırlayın (hacim, tüm plazmidlerin toplam kütlesinin iki katıdır) ve B karışımının hacmini serumsuz DMEM ile 150 μL'ye kadar yapın.
NOT: Karışımları hazırlarken, hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça sıvı eklemek önemlidir. - A karışımını birleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika beklettikten sonra B'yi karıştırın. Transfeksiyon kompleksini oluşturmak için karışımı oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.
- HEK-293T hücrelerini inkübatörden çıkarın, ortamı DMEM +% 2 FBS ile değiştirin, karışımı adım 1.1.4'ten damla damla ekleyin ve sıvıyı yavaşça karıştırın.
- 8 saat sonra, ortamı 3,5 mL normal ortamla değiştirin. Ortamı değiştirdikten sonra, virüs süpernatantını her 24 saat ve 48 saatte bir toplayın.
- İki farklı zaman noktasında toplanan virüs süpernatantlarını karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj. Süpernatantı 0,45 μm filtrelerden geçirin ve 50 mL steril konik bir tüpte toplayın.
NOT: 24 saatte toplanan virüs 4 °C'de saklanabilir ve 48 saatte toplanan virüsle karıştırılabilir. - Virüs süpernatantını, gece boyunca 4 ° C'de (~ 16 saat) 6000 × g'de santrifüj yaparak konsantre edin. Santrifüjlemeden sonra virüs peletinin konik tüpün dibinde görülebildiğinden emin olun.
- Süpernatantı yavaşça dökün. Virüs peletini, virüs süpernatan hacminin 1 /100'ü olan normal bir ortam hacminde çözün. Bir P1000 mikropipet kullanarak, homojen bir karışım elde edilene kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Konsantre virüsü gerektiğinde mikrosantrifüj tüplerine bölün. −80 °C'de saklayın.
NOT: Virüs bu yöntemle 100x konsantre edilir. Konsantre virüs (100x) -80 ° C'de >1 yıl saklanabilir. Virüsün tekrar tekrar dondurulmasından ve çözülmesinden kaçının.
- Plaka 1.5 × 106 HEK-293T hücrelerini 60 mm'lik bir kaba yerleştirin ve bu hücreleri normal ortamla (bakınız Tablo 1) 37 °C'de %5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde kültürealın.
- Konsantre virüs titresinin tespiti (Şekil 1C)
- Plaka 1 × 105 HEK-293T hücrelerini 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Negatif bir kontrolün yanı sıra bir tane eklemeyi unutmayın. Bu hücreleri% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de normal ortamlakültürleyin.
- 24 saat sonra her bir kuyucuğa 0.1 μL veya 0.2 μL floresan konsantre virüs (100x) ekleyin ve her bir kuyucuğa 4 ng / μL katyonik polimerik transfeksiyon reaktifi ekleyin. Enfeksiyondan yaklaşık 8-12 saat sonra, ortamı normal ortamla değiştirin.
NOT: Floresan algılamanın doğruluğunu ve verimliliğini sağlamak için, enfeksiyon oranı% 10-30 olmalıdır. Floresan konsantre virüsün 0.1 μL veya 0.2 μL eklenmesi, enfeksiyon verimliliğini bu aralıkta koruyabilir. Konsantre virüs titresi en az 1 × 108 dönüştürücü üniteye (TU) / mL'ye ulaşabilir. - Enfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra, ölü hücreleri çıkarmak için bulaşığı 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Bu hücreleri, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 6 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 250 μL% 0.05 tripsin-EDTA kullanarak tripsinize edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın ve ardından süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın, süspansiyonu 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin ve akış sitometrisini kullanarak virüs floresansının (yeşil floresan proteini, GFP +) enfeksiyon etkinliğini tespit edin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak konsantre virüs titresini hesaplayın: 105 (hücre hacmi) × enfeksiyon hızı (GFP +%)/eklenen virüs hacmi (0,1 μL veya 0,2 μL).
2. Fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması (Şekil 2A)
- 6 delikli bir hücre kültürü plakasının bir kuyuğunu oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca 1 mL% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Kuyunun% 0.1 jelatin çözeltisi ile tamamen kaplandığından emin olun. Kaplamadan sonra% 0.1 jelatin çözeltisini aspire edin.
NOT: % 0.1 jelatin çözeltisini (100 mL) aşağıdaki gibi hazırlayın: 0.1 g jelatin tozu, otoklavlanmış bir cam şişede 100 mL ultra saf su içinde çözülür ve daha sonra 4 ° C'de 2 aydan fazla olmamak üzere saklanır. - Plaka 5 × 104 MEF'i% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna (adım 2.1'de olduğu gibi) yerleştirin ve bu hücreleri, gece boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de normal ortamla kültürleyin.
- 24 saat sonra, MEF'lerin% 40-50 birleşme noktasına ulaştığını onaylayın. Ortamı normal ortamla değiştirin.
- 0. Günde, konsantre virüsü dondurucudan çıkarın ve virüsü buz üzerinde eritin. Eklenecek virüsün hacmini eq. (1) kullanarak hesaplayın. Altı transkripsiyon faktörü olan Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ve Snai2 için konsantre virüsü hesaplanan hacme göre her bir kuyucuğa ekleyin ve ardından katyonik polimerik transfeksiyon ajanının 4 μg / mL'sini ekleyin.
Hücre sayısı (5 × 104) × 30 (enfeksiyon çokluğu, MOI)/virüs titresi (1) - 1. Günde, enfeksiyondan 8-12 saat sonra, virüsü içeren ortamı çıkarın ve stabil enfekte hücre hatlarını taramak için 0.5 μg / mL puromisin eklerken taze normal ortamla değiştirin.
- 2. Günde, enfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatant ortamı yavaş yavaş yeniden programlama ortamı ile değiştirin. İlk olarak, toplam orta hacmin 1/4'ünü değiştirin ve 3 μM CHIR99021 ekleyin.
- 3. Gün'den 7. Gün'e kadar, hücrelerin durumuna bağlı olarak, daha yüksek oranda yeniden programlama ortamıyla değiştirerek ortamı değiştirin (bkz. Tablo 1) kademeli olarak ve 5 gün içinde tam yeniden programlama ortamına geçin.
NOT: Bu süre zarfında, puromisin ve CHIR99021 her gün kullanılmalıdır. Yeniden programlama ortamının değiştirilmesinin ilk ve ikinci gününde birçok ölü hücre ortaya çıkacaktır. Hücreler yavaş yavaş dönüşüme adapte olduğu için bu normaldir. Bu nedenle, hücrelerin sağlıklı çoğalmasını sağlamak için ortamın kademeli olarak değiştirilmesi gerekir. - Hücreleri geçmek için, hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca sindirmek için 500 μL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücrelerin ~% 60'ı yüzdüğünde, sindirim enziminin hacminin 2 katı normal orta ekleyerek sindirimi durdurun. Hücre süspansiyonunu 15 mL steril konik bir tüpte toplayın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın, süpernatanı çıkarın, hücre peletini yeniden programlama ortamıyla yeniden askıya alın ve hücreleri 60 mm steril bir kapta 3 × 104 /cm2 yoğunlukta tabaklayın. Bu hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe 37 °C'de kültürleyin .
NOT: 8. günden 21. güne kadar, bu hücreler her 3-5 günde bir alt kültüre alınır ve genişlemek için 60 mm'lik steril kaplarda kültürlenir. En azından 5. pasaja ulaşmak için kültürlenebilirler.
3. Doğrudan yeniden programlama ve tanımlama için optimizasyon
- Optimize edilmiş transkripsiyon faktörlerinin taranması
- 2.1-2.7 arasındaki adımları yineleyerek her seferinde altı transkripsiyon faktöründen birini azaltın. MEF'leri beş transkripsiyon faktörünün kombinasyonlarıyla virüsle enfekte edin.
- Enfeksiyondan yedi gün sonra, bu hücrelerin RNA'sını16 çıkarın ve melanositik genlerinin ekspresyon seviyelerini, melanositlere dönüşüm üzerinde en büyük etkiye sahip transkripsiyon faktörlerini tek tek çıkararak taramak için ters transkripsiyon PCR (RT-PCR)17 kullanarak analiz edin (Şekil 3A).
- MEF'leri enfekte etmek için melanositlere dönüşümü etkileyen ilk üç transkripsiyon faktörünü kullanın. 2.1-2.7 arasındaki adımları yineleyin.
NOT: Enfeksiyondan yedi gün sonra, melanositik genler bu dönüştürülmüş hücrelerde tespit edilebilmelidir (Şekil 3B). iMels karakterizasyonu için astar bilgileri Tablo 3'te yer almaktadır.
- İndüklenmiş melanositlerin (iMels) tanımlanması
- iMel'lerin TYRP-1 ve DCT dahil melanositik proteinleri eksprese ettiğini doğrulamak için immünofloresan boyama18'i kullanın (Şekil 4A).
- Melanine özgü 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA) boyama (Şekil 4B)
- % 4 paraformaldehit (10 mL) hazırlayın: 10 mL PBS'de 0.4 g paraformaldehit tozu çözün. Çözünmeyi önlemek için çözeltiyi 56 ° C'de 2 saat boyunca bir fırına koyun.
NOT: Çözelti 4 °C'de bir aydan fazla tutulamaz. - iMel'leri 30 mm'lik bir tabakta kültürleyin ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 20 dakika boyunca sabitlemek için 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin ve bulaşığı PBS ile 3 kez yıkayın.
- 10 mL PBS içinde 0,01 g L-DOPA tozunu çözerek kullanımdan hemen önce% 0,1 DOPA leke çözeltisi (10 mL) hazırlayın. Çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin; çözülmeyi teşvik etmek için birkaç kez sallayın.
- 1 mL taze hazırlanmış% 0.1 DOPA boyama çözeltisi ekleyin. 37 °C'de bir fırında 2-5 saat boyunca inkübe edin. Kahverengi-siyah parçacıklar yoksa, 37 ° C'de 2 saat daha inkübe etmeye devam edin, ancak >5 saat boyunca inkübe etmeye devam etmeyin. Numuneleri her 30 dakikada bir kontrol edin.
- Bulaşığı PBS ile her seferinde 1 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Çekirdeği 2 dakika boyunca 1 mL hematoksilin boyama çözeltisi ile sabitleyin.
- Uzun süreli depolama için, numuneleri 3 dakika boyunca% 95 etanol ve daha sonra% 100 etanol kullanarak 5 dakika boyunca dehidre edin. Çanağı ksilen ve nötr balzam ile kapatın.
- % 4 paraformaldehit (10 mL) hazırlayın: 10 mL PBS'de 0.4 g paraformaldehit tozu çözün. Çözünmeyi önlemek için çözeltiyi 56 ° C'de 2 saat boyunca bir fırına koyun.
- Melanine özgü Masson-Fontana boyama (Şekil 4B)
- Plaka iMels 30 mm'lik bir tabakta ve hücreleri 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin; bulaşığı PBS ile 3 kez yıkayın.
- Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti A (amonyak gümüşü çözeltisi) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), tabağı karanlık bir kutuya yerleştirin ve karanlık kutuyu 15-40 dakika boyunca 56 ° C'de bir fırına yerleştirin.
NOT: Fırında 15 dakika sonra kahverengi-siyah parçacıklar görünmüyorsa, inkübe devam etmek için numuneleri 56 °C fırına iade edin, ancak >40 dakika boyunca değil. Kurumasını önlemek için karanlık kutuya biraz su eklenebilir. - Çözelti A'yı aspire edin ve bulaşığı 5-6 kez damıtılmış suyla yıkayın, her seferinde 1-2 dakika.
- Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti B (hipo çözelti) ekleyin ve kabı 3-5 dakika oda sıcaklığında bırakın.
- B çözeltisini aspire edin ve bulaşığı musluk suyuyla 3 kez, her seferinde 1 dakika yıkayın.
- Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti C (nötr kırmızı boya) ekleyin ve kabı 3-5 dakika oda sıcaklığında bırakın.
- C çözeltisini aspire edin ve bulaşığı 3 kez damıtılmış suyla yıkayın, her seferinde 1 dakika.
- Hızlı dehidrasyon için 1 mL% 100 etanol ekleyin ve 3 dakika sonra etanolün aspire edilmesini sağlayın.
NOT: Lekeli numuneler, ksilen ve nötr balsam ile kapatıldıktan sonra uzun süre saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması için transkripsiyon faktörlerinin lentivirüsünü üretmek için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin protokolleri ve transkripsiyon faktörlerinin taranması ve melanositlerin MEF'lerden doğrudan yeniden programlanması için protokoller bulunmaktadır.
Konsantre lentivirüs üretiminin başarısı, GFP'nin floresan yoğunluğunu gözlemleyerek (Şekil 1A) veya HEK-293T hücrelerini konsantre olmayan lentivirüs (1x) ve konsantre lentivirüs (100x) ile 48 saat enfekte ettikten sonra akış sitometrisi (Şekil 1B) ile değerlendirildi. Konsantre virüsün titresi 108 TU / mL veya daha fazlaydı, bu da nispeten yüksektir (Şekil 1C).
Fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması, transkripsiyon faktörü lentivirüsü ile enfeksiyon ve optimize edilmiş yeniden programlama ortamı ile dönüşüm yoluyla elde edilir. MEF'lerden iMel'lerin üretilmesi için şema Şekil 2A'da gösterilmiştir. Hücre morfolojisi doğrudan yeniden programlama sırasında yavaş yavaş değişir. Hücre sinapsları uzar ve hücre çekirdekleri büyür. Bununla birlikte, bu hücreler ~ Gün 20'den (~ 5 pasaj) sonra yavaş yavaş yaşlanır (Şekil 2B).
Yeniden programlama üzerinde en büyük etkiye sahip transkripsiyon faktörünü belirlemek için orijinal altı transkripsiyon faktörü kümesinden (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ve Snai2) bir seferde bir transkripsiyon faktörü çıkarıldı. Mitf, Pax3 veya Sox10'un çıkarılması, melanositik genler Tyr, Tyrp1 ve Mlana'nın ekspresyonunun susturulmasıyla sonuçlandı (Şekil 3A), bu üç transkripsiyon faktörünün fibroblastın melanositlere dönüşümü üzerinde en büyük etkiye sahip olduğunu gösterdi. Üç transkripsiyon faktörü ile doğrudan yeniden programlama ile indüklenen melanositik genlerin ekspresyonu, altı transkripsiyon faktörünün hepsinden daha yüksekti (Şekil 3B).
Son olarak, bu optimize edilmiş doğrudan yeniden programlama sistemi kullanılarak elde edilen iMel'lerin özellikleri belirlendi. Melanositik belirteçlerin ekspresyonu (TYR, TYYP1) immünofloresan boyama kullanılarak saptandı (Şekil 4A). DOPA ve Masson-Fontana boyama dahil olmak üzere melanine özgü boyama yöntemleri de olumlu sonuçlar göstermiştir (Şekil 4B).
Şekil 1: Konsantre virüs üretimi ve titrenin tahmini . (A) HEK-293T hücrelerini konsantre olmayan lentivirüs (1x) ve konsantre lentivirüs (100x) ile enfekte ettikten sonra GFP'nin floresan yoğunluğu, (B) Konsantrasyonsuz lentivirüs (1x) ve konsantre lentivirüsün (100x) enfeksiyon oranlarının akış sitometrisi ile tespit edildiği şekilde karşılaştırılması. (C) Konsantre lentivirüsün titre tahmini. Ölçek çubukları = 250 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; TU = dönüştürücü birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MEF'lerden iMel üretimi. (A) iMels üretiminin şematik diyagramı. (B) 0. gün, 3. gün, 10. gün ve 20+ gününde doğrudan yeniden programlamada MEF'lerden iMel'lere dönüşüm sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikler. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: iMels = indüklenmiş melanositler; MEF'ler = fare embriyonik fibroblastları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Optimize edilmiş transkripsiyon faktörlerinin taranması. (A) Beş transkripsiyon faktörü ile transdüklenen hücrelerdeki Tyr, Tyrp1 ve Mlana mRNA seviyelerinin qRT-PCR'si (orijinal altı transkripsiyon faktöründen biri çıkarılmıştır). MEF + EV ve MEF + 6F sırasıyla negatif kontrol ve pozitif kontrol olarak kullanılır. mRNA ekspresyonu Gapdh ekspresyonuna normalleştirilir. (B) Tyr, Tyrp1 ve Mlana mRNA seviyelerinin qRT-PCR'si, orijinal altı transkripsiyon faktörü ve üç transkripsiyon faktörü ile transdüke edildi. MEF, MEF + EV ve MMC sırasıyla boş, negatif kontrol ve pozitif kontrol olarak kullanılır. mRNA seviyeleri Gapdh seviyelerine normalleştirilir. Tüm değerler, üç bağımsız deneyin ortalama ± SD'sidir. Astar dizileri Tablo 3'te gösterilmiştir. Kısaltmalar: qRT-PCR = kantitatif ters transkripsiyon PCR; MEF = fare embriyonik fibroblastları; MEF + EV = fare embriyonik fibroblastları + boş vektör; MMC = fare melanosit; 6F = Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ve Snai2'den oluşan altı transkripsiyon faktörü; 3F: Mitf, Pax3 ve Sox10'u içeren üç transkripsiyon faktörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: iMel'lerin fonksiyonel olarak tanımlanması. (A) iMel'lerde melanositik belirteçlerin (TYR, TYYP1) immün boyaması. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu çalışmada kullanılan antikorların seyreltilmesi için Malzeme Tablosuna bakınız. (B) Masson-Fontana boyama ve DOPA boyama. MEF ve Melan-a hücre hattı sırasıyla negatif kontrol ve pozitif kontrol olarak kullanılır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: iMels = indüklenmiş melanositler; DOPA = 3,4-dihidroksifenilalanin; MEF = fare embriyonik fibroblastı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşen | Doz (konsantrasyon, hacim) | Son Konsantrasyon | |
| Normal Orta (100 mL) | DMEM/YÜKSEK GLIKOZ | 89 mL | |
| Isı ile inaktive edilmiş FBS | 10 mL | ||
| Antibiyotikler (Pen/Strep) | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| Yeniden programlama ortamı (100 mL) | RPMI-1640 | 88 mL | |
| Isı ile inaktive edilmiş FBS | 10 mL | ||
| Rekombinant İnsan SCF | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL | |
| Rekombinant İnsan bFGF | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL | |
| Rekombinant İnsan insülini | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| EDN3 insan | 100 μM, 100 μL | 0,1 μM | |
| Kolera Toksini | 0,3 mg/mL, 0,56 μL | 20:00 | |
| Phorbol 12-myristate 13-asetat (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| Hidrokortizon | 100 μg/mL, 500 μL | 0,5 μg/mL | |
| Arjantin | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
Tablo 1: Normal ve yeniden programlama ortamının bileşenleri.
| Kültür Yemeği | Tohumlama Yoğunluğu (hücreler/çanak) | Orta (mL) | Plazmid Sistemi | Transfeksiyon reaktifi (μL) | ||
| Hedef plazmid (μg) | PMD2. G (μg) | PSPAX2 (μg) | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
Tablo 2: Lentivirüs paketleme sisteminin detayları.
| RT-PCR Astarlar | |
| Hedef | Astar setleri |
| Arjantin | İleri: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| Ters: CATTCTCGGCCTTGACTGTG | |
| Tyr | İleri: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| Ters: ATGGGTGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | İleri: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| Ters: TCAGTGAGGAGAGGCTGTT | |
| Arjantin | İleri: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| Ters: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
Tablo 3: Astar bilgileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virüsün kalitesi, bu protokolde melanositlere doğrudan yeniden programlamanın başarısı için çok önemlidir. Bu protokoldeki virüsleri paketleme ve yoğunlaştırma yöntemi basit ve tekrarlanması kolaydır ve başka herhangi bir yardımcı konsantre reaktife dayanmaz. Bu protokol çoğu laboratuvarda başarıyla takip edilebilir. Konsantre virüsün kalitesini sağlamak için, aşağıdaki noktalara özel dikkat gösterilmesi gerekir. Birincisi, HEK-293T'nin hücre durumudur. HEK-293T hücreleri ölümsüzleştirilmiş hücreler olmasına rağmen, konsantre virüsü yapmak için kullanılan hücreler 10 pasajda sağlıklı hücreler olmalıdır (titre daha yüksek pasajlarla azalır).
Bir diğer kritik nokta, kullanılan transfeksiyon reaktifinin (bu durumda, lipofektamin) oranıdır. Transfeksiyon reaktifi eklendikten sonra hücreler hasar gördüğünden, hücrelerin optimal durumunu ve virüsün kalitesini sağlamak için reaktifin plazmidlere oranı tekrar tekrar kontrol edilmelidir. Transfeksiyon reaktifinin plazmidlere 2: 1 oranı, bu sistemde virüsü paketlemek için HEK-293T hücreleri için en uygun olanıdır. Ek olarak, tüm adımlar süreç boyunca nazik bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Virüs titresini etkileyen kaplamadan sonra virüs parçacıkları emilebildiğinden, virüsü paketlerken kabın herhangi bir matrisle kaplanması önerilmez. HEK-293T'nin ayrılma olasılığı nedeniyle, süpernatant, özellikle 24 saat sonra virüs süpernatantını topladıktan sonra taze ortam eklendiğinde, dikkatlice değiştirilmelidir. Diğer bazı hususlar hücre yoğunluğunu, transfeksiyon süresinin uzunluğunu ve ortamdaki serum içeriğini içerir. Bunlar transfeksiyon verimliliğini etkileyen önemli konulardır. Bu protokolde sunulan koşullar, tekrarlanan birçok deneyden sonra elde edilen sonuçlara dayanarak en uygun olanlardır.
Melanositlere doğrudan yeniden programlama sürecinde, orijinal hücre MEF'lerinin durumunu ve doğrudan yeniden programlama için kullanılan MEF'lerin yoğunluğunu dikkate almak önemlidir. Doğrudan yeniden programlamaya başlamadan önce, MEF'ler kaplanmamış hücre kültürü yemeklerinde kültürlenmelidir. Proliferasyon fazındaki hücreler (% 40-50 birleşim) doğrudan yeniden programlama için seçilmelidir; enfeksiyon etkinliği hücre yoğunluğunun artmasıyla azalır. Yeniden programlanan hücrelerin jelatin kaplı kültür tabaklarında kaplanması gerekir.
Virüsün hücreleri enfekte etmesi için gereken sürenin uzunluğu da kritiktir; Çok uzun bir enfeksiyon süresi hücre sağkalımını bozarken, çok kısa bir enfeksiyon süresi verimliliği azaltacaktır. Bu protokolde konsantre virüsün MEF'leri enfekte etmesi için sekiz saatin uygun olduğu bulunmuştur. Son kritik nokta, yeniden programlama ortamını değiştirmenin doğru yoludur. MEF'lerin yeni bir ortama uyum sağlaması gerekiyor. Hücrelerin durumu her gün kontrol edilmeli ve ortam hücre durumuna göre dikkatlice değiştirilmelidir. Yeniden programlama ortamını çok hızlı değiştirmek, çok sayıda hücrenin ölmesine neden olur.
İMel'leri yetiştirirken ve alt kültüre alırken, hücrelerin geçiş yoğunluğu kritiktir. iMel'lerin büyümeyi sürdürmek için nispeten yüksek bir yoğunluğa ihtiyacı vardır. Bu hücrelerin normal proliferasyonu için hücre sinapsları birbirleriyle temas halinde olmalıdır. Yoğunluk çok düşükse, hücreler çoğalmayı durdurabilir. Burada 3 × 104/cm2 yoğunluğunun iMel'ler için uygun bir geçiş yoğunluğu olduğu bulunmuştur. 5 pasajdan sonra, iMel'ler yaşlanmaya başlar (Şekil 2B); melanin şu anda daha olgundur ve ortaya çıkan hücreler immünofloresan, DOPA veya Masson-Fontana boyama için kullanılabilir. RT-PCR için hücrelerin daha erken pasajları kullanılabilir, çünkü genlerin ekspresyonu nispeten erken bir aşamada değişecektir.
Doğrudan yeniden programlama yaygın olarak çalışılmasına rağmen, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması konusunda çok az araştırma vardır. Farklı çalışmalar, farklı transkripsiyon faktörleri14,15 kullanmış ve bu da çok fazla karışıklığa yol açmıştır. Bu protokol, yüksek kaliteli konsantre virüslerin nasıl üretileceğini ve melanositlere doğrudan yeniden programlama için en önemli olanları seçmek için çeşitli transkripsiyon faktörlerinin nasıl taranacağını açıklar. Bu protokolde melanositlere doğrudan yeniden programlama için ortam beslenme faktörleri ile desteklenmiştir (Tablo 2). Son olarak, fonksiyonel iMel'ler başarıyla tanımlandı. Net ve optimize melanosit doğrudan yeniden programlama sistemi, vitiligo gibi depigmentasyon hastalıkları için yeni tedavi stratejileri sağlayabilir.
Bununla birlikte, bu makalede sunulan teknolojide hala bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu protokolün verimliliğini tahmin etmek zordur. CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi, Tyr veya Tyrp-1 gibi melanositik genleri, yeniden programlama işlemi sırasında indüklenen hücrelerin yüzdesini gözlemlemek için ilk hücrelere vurmak için bu protokolle birleştirilebilir. Ayrıca bu protokolde kullanılan lentivirüs giriş sistemi gen rekombinasyonu ve yerleştirme mutasyonu riski taşıyabilir19. Gelecekte, viral olmayan rekombinant protein ekspresyon vektörleri veya mRNA vektörleri gibi daha verimli ve daha güvenli giriş yöntemleri kullanılabilir. Bu protokoldeki deney hala in vitro aşamasındadır. Bir sonraki adım, melanositleri doğrudan in vivo olarak yeniden programlamak, pigmentli olmayan cildin pigmentlenmesine neden olmak ve vitiligo'nun etkili bir tedavisini tasarlamak için doğrudan yeniden programlama sistemini kullanmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070638 ve 81770621) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20180281) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
