Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tidsopløste Förster Resonans Energy Transfer Assays til måling af endogene fosforylerede STAT-proteiner i humane celler

Published: September 9, 2021 doi: 10.3791/62915
Automatic Translation
1, 1, 1
1BioAuxilium Research

Summary

Tidsopløste Förster-resonansenergioverførselscellebaserede assayprotokoller er beskrevet for den enkle, specifikke, følsomme og robuste kvantificering af endogene phosphorylerede signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) 1/3/4/5/6 proteiner i cellelysater i et 384-brøndsformat.

Abstract

Janus kinase (JAK) / signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) signalvejen spiller en afgørende rolle i formidlelsen af cellulære reaktioner på cytokiner og vækstfaktorer. STAT-proteiner aktiveres af tyrosinphosphorylering medieret hovedsageligt af JAB'er. Den unormale aktivering af STAT-signalveje er impliceret i mange menneskelige sygdomme, især kræft og immunrelaterede tilstande. Derfor er evnen til at overvåge STAT-proteinfosforylering inden for det oprindelige cellesignalmiljø vigtig for både akademisk og lægemiddelopdagelsesforskning. De traditionelle assayformater, der er tilgængelige for at kvantificere fosforylerede STAT-proteiner, omfatter western blotting og det enzymbundne immunosorbentassay (ELISA). Disse heterogene metoder er arbejdskrævende, lav gennemstrømning og ofte ikke pålidelige (specifikke) i tilfælde af vestlig blotting. Homogene (no-wash) metoder er tilgængelige, men forbliver dyre.

Her leveres detaljerede protokoller til følsom, robust og omkostningseffektiv måling i et 384-brøndsformat af endogene niveauer af fosforyleret STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) og STAT6 (Y641) i cellelysater fra klæbende eller suspensionsceller ved hjælp af den nye THUNDER tidsopløste Förster resonansenergioverførsel (TR-FRET) platform. Arbejdsgangen for det cellulære assay er enkel, hurtig og designet til screening med høj kapacitet (HTS). Assayprotokollen er fleksibel, bruger en prøve med lavt volumen (15 μL), kræver kun et reagenstilsætningstrin og kan tilpasses applikationer med lav gennemstrømning og høj gennemstrømning. Hvert phospho-STAT sandwich immunassay valideres under optimerede betingelser med kendte agonister og hæmmere og genererer de forventede farmakologi- og Z'-faktorværdier. Da TR-FRET-assays er ratiometriske og ikke kræver vasketrin, giver de meget bedre reproducerbarhed end traditionelle tilgange. Sammen giver denne række assays nye omkostningseffektive værktøjer til en mere omfattende analyse af specifikke fosforylerede STAT-proteiner efter cellebehandling og screening og karakterisering af specifikke og selektive modulatorer af JAK / STAT-signalvejen.

Introduction

JAK / STAT-signalvejen spiller en nøglerolle i formidlelsen af cellulære reaktioner på forskellige cytokiner, interferoner, vækstfaktorer og relaterede molekyler1,2. Bindingen af disse ligander til specifikke celleoverfladereceptorer resulterer i aktivering af DYK'er, som igen aktiverer STAT-proteiner ved fosforylering af specifikke tyrosinrester. STAT fosforylering resulterer i deres dimerisering og translokation i kernen, hvor de udøver deres virkning på transkriptionen af regulerede målgener. STAT-familien består af syv medlemmer: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b og STAT6. Medlemmerne spiller en kompleks og væsentlig rolle i reguleringen af fysiologiske celleprocesser, herunder spredning, differentiering, apoptose, angiogenese og immunsystemregulering. Den unormale aktivering af STAT-signalveje er impliceret i mange humane sygdomme, især kræft og immunrelaterede tilstande3,4. Derfor er evnen til at vurdere STAT-proteinfosforylering inden for det oprindelige cellesignalmiljø vigtig for både akademisk og lægemiddelopdagelsesforskning.

Til dato er de konventionelle metoder, der anvendes til måling af intracellulære fosforylerede proteinniveauer, herunder STET'er, antistofbaserede og omfatter western blotting, ELISA og phosphoflowcytometri. Disse heterogene metoder er arbejdskrævende, tidskrævende, fejlbehæftede, lave gennemstrømninger og ofte upålidelige (f.eks. Specificitetsproblemer) i tilfælde af vestlig blotting5. I modsætning hertil kræver homogene assays færre eksperimentelle trin, bruger mindre prøvevolumener og er modtagelige for HTS. Der er fem homogene cellebaserede immunassay platforme kommercielt tilgængelige, der kan bruges til kvantitativt at overvåge JAK-afhængig fosforylering af STAT'er i cellelysater: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen og Lumit. Hver af disse platforme har sine fordele og ulemper.

SureFire er baseret på selvlysende iltkanaliseringsteknologi, der bruger donor- og acceptorperler belagt til specifikt at fange et par antistoffer, hvoraf den ene er biotinyleret. I nærvær af fosforyleret protein bringer de to antistoffer donor- og acceptorperlerne i umiddelbar nærhed, hvilket muliggør dannelsen af et kemiluminescerende signal6. Selvom den er alsidig og følsom, er denne teknologi dyr, påvirkes af biotin i kulturmediet, er meget følsom over for omgivelsestemperatur og lys og kræver en særlig læser til detektion. HTRF og LANCE er begge baseret på TR-FRET-teknologi, der anvender selvlysende lanthanidionkomplekser med lang levetid (Europium- eller Terbiumchelater eller Europiumkryptat) som donormolekyler og langtrøde fluoroforer som acceptormolekyler7. Når to proteinspecifikke antistoffer mærket med enten donor- eller acceptormolekyler bringes i nærheden, finder FRET sted, hvilket forårsager en stigning i acceptorfluorfluorescens og et fald i donorfluorescens. Disse langlivede fluorescerende signaler kan måles på en tidsopløst og ratiometrisk måde for at reducere assayinterferens og øge datakvaliteten. Andre fordele ved TR-FRET er, at det ikke er lysfølsomt, tillader gentagne aflæsninger og udviser lang signalstabilitet. Mens TR-FRET er bredt implementeret i HTS på grund af dets alsidighed, følsomhed og høje robusthed, er alle kommercielle TR-FRET-baserede analyseplatforme dyre, hvilket forhindrer dets brede vedtagelse i akademiske og små industrielle laboratorier. LanthaScreen-analysen bruger også en TR-FRET-baseret udlæsning, men er afhængig af en konstrueret U2OS-cellelinje, der stabilt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP)-STAT1-fusionsprotein kombineret med et terbiummærket phospho-specifikt STAT1-antistof8. Ud over at være begrænset med hensyn til valg af signalproteiner kræver denne metode køb af dyre transfekterede cellelinjer, hvilket reducerer dets anvendelighed og øger muligheden for eksperimentelle artefakter. Lumit er en generisk bioluminescerende immunassay platform, der udnytter sekundære antistoffer (anti-mus og anti-kanin) kemisk mærket med de små og store NanoBit underenheder af NanoLuc Luciferase9. Bindingen af to primære antistoffer til målproteinet bringer de sekundære antistoffer i nærheden for at danne et aktivt enzym, der genererer et luminescenssignal. Mens luminescens generelt er en følsom og robust aflæsning, begrænser kravet om primære antistoffer, der er rejst i to forskellige arter, valgene til analysedesign. Derudover kan brugen af sekundære antistoffer i komplekse prøvematrixer være tilbøjelig til assayinterferens.

Der er således stadig behov for en pålidelig, hurtig, men alligevel overkommelig cellebaseret analyseplatform til måling af individuelle fosforylerede og samlede STAT-proteiner på en måde, der er kompatibel med HTS. For at imødekomme dette behov blev der udviklet en ny cellebaseret immunassayplatform med høj kapacitet baseret på en forbedret TR-FRET-teknologi (THUNDER) og designet til at muliggøre enkel, følsom, robust og omkostningseffektiv måling af endogent udtrykte intracellulære proteiner (fosforyleret eller total) i cellelysater. Fordelene ved denne teknologi stammer fra kombinationen af et donor / acceptor FRET-par, der udviser enestående spektral kompatibilitet og TR-FRET-signal, strengt validerede antistoffer og optimerede lysisbuffere. Disse assays er formateret som sandwichimmunassays og bruger en ligetil tretrins arbejdsgang (figur 1). Celler behandles først for at modulere proteinphosphorylering og lyseres derefter med den specifikke lysisbuffer, der er tilvejebragt i sættet. Det målphosphorylerede eller totale STAT-protein i cellelysatet detekteres i et enkelt reagenstilsætnings- og inkubationstrin med et par fluoroformærkede antistoffer, der genkender forskellige epitoper på målproteinet (figur 2). Et antistof er mærket med en Europiumchelatdonor (Eu-Ab1), mens det andet antistof er mærket med en langt rød acceptorfluorofor (FR-Ab2). De to mærkede antistoffer binder sig til proteinet i opløsning, hvilket bringer de to etiketter i nærheden. Excitation af donoren Europiumchelat ved 320 eller 340 nm udløser en FRET til acceptoren, som udsender et langlivet TR-FRET-signal ved 665 nm proportionalt med koncentrationen af målprotein (fosforyleret eller total) i cellelysat.

Figure 1
Figur 1: TR-FRET assay arbejdsgang. Arbejdsgangen består af tre trin: cellebehandling, cellelyse og proteindetektion ved hjælp af TR-FRET. I to-plade-assayprotokollen overføres lysater til en hvid 384-brønds detektionsplade, mens i en-pladeprotokollen udføres alle trin i den samme hvide 384-brønds detektionsplade (alt-i-en-brønd-protokol). Uanset hvilken analyseprotokol der anvendes, udføres proteindetektion i samme samlede volumen (20 μL pr. Brønd). Forkortelse: TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: TR-FRET sandwich immunoassay princip. Det ene antistof er mærket med Europiumchelatdonoren (Eu-Ab1) og det andet med den langtrøde lille fluoroforacceptor (FR-Ab2). De to mærkede antistoffer binder specifikt til forskellige epitoper på målproteinet (fosforyleret eller totalt) i cellelysatet, hvilket bringer de to fluoroforer i nærheden. Excitation af donoren Europiumchelat ved 320 eller 340 nm udløser en FRET fra donoren til acceptormolekylerne, som igen udsender et signal ved 665 nm. Dette signal er proportionalt med koncentrationen af protein i cellelysatet. I mangel af det specifikke målprotein er donor- og acceptorfluoroforerne for fjernt fra hinanden til, at FRET kan forekomme. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; TR-FRET = tidsopløst FRET; Ab = antistof; FR = langt rødt; Eu - Europium chelat; P = fosforylering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Her tilvejebringes detaljerede protokoller til måling i et 384-brøndsformat af de intracellulære niveauer af fosforyleret STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) og STAT6 (Y641) sammen med total STAT1, STAT3, STAT5 og STAT6 i cellelysater fra klæbende eller suspensionsceller ved hjælp af THUNDER TR-FRET-platformen. Disse protokoller definerer trin til cellebehandling, lysis og TR-FRET-baseret målproteindetektion ved hjælp af enten en to-pladeoverførselsprotokol eller en en-plade alt-i-en-brønd-protokol. Disse cellebaserede assays anvendes til bestemmelse af den farmakologiske profil af kendte aktivatorer og hæmmere af JAK/STAT-vejen. Robustheden og egnetheden af udvalgte assays for HTS er påvist. Endelig diskuteres nøgleeksperimenter til analyseoptimering sammen med anbefalinger til fejlfinding af assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur

  1. Vedligeholde celler i en befugtet 37 °C/5 % CO2-inkubator og dyrkning med enten DMEM suppleret med 10 % føtalt kvægserum (FBS) (HeLa- og A431-celler) eller RPMI suppleret med 15 % FBS (U266B1-celler). Kultur cellerne, indtil de når 70-80% sammenløb, prøv derefter dem og passage eller brug dem til assays.
    BEMÆRK: Kulturmedier indeholdt phenolrød. Der blev ikke udført serumsult for nogen cellelinje før udførelsen af assays.

2. Stimulator eller inhibitortitrering ved hjælp af to-plade-assayprotokollen med klæbende celler

BEMÆRK: Denne procedure beskriver, hvordan man bestemmer stimulator- eller inhibitorpotenter ved at generere en koncentrationsresponskurve fra en fortyndingsserie af testforbindelsen.

  1. Celle såning
    1. Dispenser 50 μL celler ved den forudoptimerede densitet (40.000 HeLa-celler/brønd for både STAT3 og STAT6; 75.000 A431-celler/brønd til STAT5) i en 96-brønds vævskulturbehandlet plade i det relevante dyrkningsmedium. Inkuber natten over ved 37 °C/5 % CO2.
      BEMÆRK: Optimal celletæthed og kulturinkubationstid skal bestemmes.
  2. Fortyndinger af testforbindelser
    1. Mellemliggende 2x fortyndingsserier af testforbindelse(r) ved seriel fortynding af forbindelse(r) (halvlogintervalfortyndinger) på tværs af 12 brønde af en polypropylenplade med 96 brønde til serumfrit medium.
      BEMÆRK: Det anbefales at gennemføre en 12-punkts koncentrationsresponskurve med halvloginterval i mindst to eksemplarer for at foretage en nøjagtig estimering af EC50 eller IC50.
    2. Alternativt kan hydrofobe, dimethylsulfoxid (DMSO)-opløselige testforbindelser udføre de indledende fortyndinger i 100% DMSO og derefter fortynde den sammensatte fortyndingsserie til serumfrit medium.
      BEMÆRK: Assaytolerancen over for DMSO skal etableres, før der udføres en testforbindelsestitrering i DMSO-køretøj. Det er vigtigt at holde lige opløsningsmiddelkoncentrationer mellem behandlede og ubehandlede celler. Ved test af serielle fortyndinger af forbindelser bør opløsningsmiddelkoncentrationerne desuden altid forblive konstante på tværs af fortyndingsserien.
  3. Cellebehandling
    1. Til cellestimulering tilsættes 50 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller indeholdende stimulatoren (2x).
    2. Inkuber for den foroptimerede tid ved enten stuetemperatur (RT) eller 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min ved RT for STAT3; epidermal vækstfaktor (EGF)/10 min ved RT for STAT5; interleukin (IL)-4/20 min ved RT for STAT6). Fortsæt derefter til afsnit 2.4.
      BEMÆRK: Optimal inkubationstemperatur skal bestemmes.
    3. Til cellehæmning tilsættes 25 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller indeholdende inhibitoren (4x).
    4. Inkuber for den forudoptimerede tid ved enten RT eller 37 °C (JAK-hæmmer 1/30 min ved RT for STAT3 og STAT6; Erlotinib/15 min ved RT for STAT5).
    5. Der tilsættes 25 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller med stimulatoren (4x) ved EC80.
    6. Inkuber for den forudoptimerede tid ved enten RT eller 37 °C (samme betingelser som for trin 2.3.2).
  4. Cellelyse
    1. Forbered sættets specifikke 1x supplerede lysisbuffer som angivet af producenten.
      BEMÆRK: Det er obligatorisk at supplere 1x Lysis Buffer med 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail fortyndet til en endelig koncentration på 1x. 1x Suppleret Lysis Buffer indeholder 1 mM natriumfluorid, 2 mM natriumorthovanadat og 2 mM beta-glycerophosphat. Andre fosfatasehæmmere er ikke påkrævet og bør undgås. Lysisbuffere og fosfatasehæmmere bortset fra dem, der er inkluderet i sættet, anbefales ikke, da de kan indeholde ingredienser, der kan forstyrre målingen.
    2. Fjern og kassér forsigtigt cellekulturmediet ved at aspirere supernatanten.
    3. Tilsæt straks 50 μL 1x suppleret lysisbuffer.
      BEMÆRK: Lysis Buffervolumen (25-50 μL) kan optimeres.
    4. Inkuber i 30 minutter ved RT under omrystning (orbital pladeryster indstillet til 400 o / min; moderat omrøring).
      BEMÆRK: Lysis inkubationstid (30-60 min) kan optimeres. Lysater kan anvendes straks til påvisning af målprotein eller fryses ved -80 °C.
  5. TR-FRET-detektion
    1. Forbered 4x Antistof Detection Mix i 1x detektionsbuffer som angivet af producenten.
    2. I dette overførselstrin pipetteres forsigtigt 15 μL cellelysat fra 96-brønds kulturpladen til en brønd af en hvid, lavvolumen 384-brønds mikroplade.
    3. Tilsæt 15 μL af det positive kontrollysat og 15 μL 1x lysisbuffer (negativ kontrol) for at adskille analysebrønde.
    4. Der tilsættes 5 μL 4x antistofdetektionsblanding (enten Eu-Ab1/FR-Ab2 til påvisning af phosphoproteinet eller Eu-Ab3/FR-Ab4 til påvisning af det samlede protein) til hver af analysebrøndene.
    5. Dæk pladen med en pladeforsegler, og inkuber i 1 time op til natten over ved RT, afhængigt af analysen (se det tilsvarende tekniske datablad).
      BEMÆRK: Optimal læsetid skal optimeres for hvert assay og cellelinje. Pladen kan læses flere gange uden en negativ indvirkning på assayets ydeevne.
    6. Fjern klæbepladeforsegleren, og læs pladen på en TR-FRET-kompatibel mikropladelæser.
      BEMÆRK: Filterbaserede fluorometre anbefales, selvom nogle monokromatorinstrumenter kan bruges. Kontroller, at det relevante optiske modul (filtre og spejl) til TR-FRET er installeret. Brug en excitationsbølgelængde på 320 eller 340 nm til at ophidse Europium-chelatet. Læs assays ved både 615 nm (eller 620 nm) og 665 nm for at detektere både emissionen fra henholdsvis donoren Europium og acceptorfluoroforen. Instrumentindstillingerne afhænger af den pågældende læser. Data præsenteret her blev opnået ved hjælp af lampebaseret excitation, 90 μs forsinkelse, 300 μs integrationstid og 100 blink pr. Brønd. Phospho-STAT4-analysen blev imidlertid læst ved hjælp af laserexcitation for at generere højere signal-til-baggrund (S / B) -forhold.

3. Titrering af stimulator eller inhibitor ved hjælp af to-plade assayprotokollen med suspensionsceller

  1. Fortynding af testforbindelser
    1. Der fremstilles mellemliggende 2x fortyndingsserier af testforbindelse(r) som beskrevet i trin 2.2.1 og 2.2.2.
  2. Cellesåning og behandling
    1. Dispenser 20 μL celler ved den forudoptimerede densitet (200.000 U266B1-celler/brønd til STAT1; 400.000 U266B1-celler/brønd til STAT4) i en 96-brønds vævskulturbehandlet plade i det relevante dyrkningsmedium. Direkte fortsæt til cellebehandling eller inkuber 2-4 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
      BEMÆRK: Dette trin skal optimeres til forskellige celletyper.
    2. Til cellestimulering tilsættes 20 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller indeholdende stimulatoren (2x).
    3. Inkuber for den forudoptimerede tid ved enten RT eller 37 °C (IFNα2b/15 min ved RT for STAT1; IFNα2b/25 min ved 37 °C for STAT4). Fortsæt derefter til afsnit 3.3.
      BEMÆRK: Optimal inkubationstemperatur skal bestemmes.
    4. Til cellehæmning tilsættes 10 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller indeholdende hæmmeren (4x).
    5. Inkuber for den præoptimerede tid ved enten RT eller 37 °C (JAK-hæmmer 1/30 min ved RT for STAT1 og STAT4).
    6. Der tilsættes 10 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller indeholdes stimulatoren (4x) ved EC80.
    7. Inkuber for den forudoptimerede tid ved enten RT eller 37 °C (samme betingelser som for trin 3.2.3).
  3. Cellelyse
    1. Forbered sættets specifikke 5x supplerede lysisbuffer som angivet af producenten.
      BEMÆRK: Det er obligatorisk at supplere 5x Lysis Buffer med 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail fortyndet til en endelig koncentration på 5x. 5x Suppleret Lysis Buffer indeholder 5 mM natriumfluorid, 10 mM natriumorthovanadat og 10 mM beta-glycerophosphat. Andre fosfatasehæmmere er ikke påkrævet og bør undgås.
    2. Tilsæt 10 μL 5x suppleret lysisbuffer.
    3. Inkuber i 30 minutter ved RT under omrystning (orbital pladeryster indstillet til 400 o / min; moderat omrøring).
      BEMÆRK: Lysis inkubationstid (30-60 min) kan optimeres. Lysater kan anvendes straks til påvisning af målprotein eller fryses ved -80 °C.
  4. TR-FRET-detektion
    1. Efter cellelyse udføres TR-FRET-detektionstrinnet som beskrevet i pkt. 2.5 for 2-pladeanalyseprotokollen for klæbende celler.

4. Stimulatortitrering ved hjælp af en-plade-assayprotokollen med klæbende eller suspensionsceller

  1. Fortynding af testforbindelser
    1. Mellemliggende fortyndingsserier af testforbindelse(r) ved 3x ved seriel fortynding af forbindelse(r) (fortyndinger med halvt loginterval) på tværs af 12 brønde af en polypropylenplade med 96 brønde til serumfrit medium.
  2. Cellesåning og behandling
    1. Dispenser 8 μL celler ved den forudoptimerede densitet (160.000 U266B1-celler/ brønd til STAT4; 80.000 HeLa-celler / brønd til STAT6) i det passende serumfrie dyrkningsmedium til en hvid, lavvolumen 384-brønds assayplade. Direkte fortsæt til cellebehandling eller inkuber 2-4 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
      BEMÆRK: Kravet om en cellekulturinkubationsperiode før behandling skal bestemmes for forskellige celletyper.
    2. Til cellestimulering tilsættes 4 μL serumfrit medium alene (ubehandlede celler) eller indeholdende stimulatoren (3x).
    3. Inkuber for den forudoptimerede tid ved enten stuetemperatur eller 37 °C (IFNα2b/25 min ved 37 °C for STAT4; IL-4/20 min ved 37°C for STAT6). Fortsæt derefter til afsnit 4.3.
  3. Cellelyse
    1. Forbered sættets specifikke 5x supplerede lysisbuffer som angivet af producenten.
      BEMÆRK: Det er obligatorisk at supplere 5x Lysis Buffer med 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail fortyndet til en endelig koncentration på 5x.
    2. Tilsæt 3 μL 5x suppleret lysisbuffer.
    3. Inkuber i 30 minutter ved RT under omrystning (orbital pladeryster ved 400 o / min).
      BEMÆRK: Lysis inkubationstid (30-60 min) kan optimeres. Lysater kan anvendes straks eller fryses ved 80 °C.
  4. TR-FRET-detektion
    1. Tilsæt 15 μL positivt kontrollysat (ufortyndet) og 15 μL 1x suppleret lysisbuffer (negativ kontrol) for at adskille analysebrønde.
    2. Der tilsættes 5 μL 4x antistofdetektionsblanding (enten Eu-Ab1/FR-Ab2 for phosphoproteinet eller Eu-Ab3-/FR-Ab4 for det samlede protein) fremstillet i 1x detektionsbuffer til hver af analysebrøndene.
    3. Dæk pladen med en pladeforsegler og inkuber i 1 time op til natten over ved RT, afhængigt af analysen.
      BEMÆRK: Optimal læsetid skal optimeres for hvert assay og cellelinje. Pladen kan læses flere gange uden en negativ indvirkning på assayets ydeevne.
    4. Fjern klæbepladeforsegleren. Læs pladen på en TR-FRET-kompatibel mikropladelæser.

5. Analyse af data

  1. Beregn TR-FRET-forholdet for hver brønd ved hjælp af følgende formel (1):
    Equation 1 (1)
    BEMÆRK: Fordi TR-FRET-signalet læses i en tidsopløst tilstand, er baggrundssubtraktion normalt ikke nødvendig. Hvis der udføres baggrundssubtraktion, skal du bruge de cellefrie brønde, der indeholder 1x Suppleret lysisbuffer (negativ kontrol) til baggrundssubtraktion. Bestem det gennemsnitlige TR-FRET-forhold fra de cellefrie brønde, og træk derefter denne værdi fra TR-FRET-forholdet for hver brønd.
  2. For koncentrationsresponskurver skal dataene analyseres i henhold til en ikke-lineær regression ved hjælp af den 4 parameter logistiske ligning (sigmoidal dosis-responskurve med variabel hældning) og en 1/Y2-datavægtning for at generere EC50- eller IC50-værdier.
  3. For Z'-faktoreksperimentet analyseres dataene i henhold til følgende formel (2)10
    Equation 2 (2)
    Hvor μ og σ er middelværdierne og standardafvigelserne for henholdsvis den positive kontrol (p; stimulerede celler) og den negative kontrol (n; ubehandlede celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hvert THUNDER TR-FRET-assay blev farmakologisk valideret ved at behandle klæbende (HeLa eller A431) eller suspensionsceller (U266B1) med JAK/STAT-vejspecifikke aktivatorer eller hæmmere og derefter måle niveauerne af specifikke phosphorylerede og totale STAT'er, hvor det var relevant. Assays blev udført i 384-brøndsformat ved hjælp af to-pladeoverførselsprotokollen og forudoptimerede analysebetingelser. Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7 opsummerer repræsentative koncentrationsresponskurver opnået for alle STAT-assays. Samlet set viste alle stimulator- og inhibitorkoncentrationsresponskurver for phospho-STAT-assays robuste TR-FRET-signaler, brede dynamiske områder, lav variationskoefficient mellem brønde (typisk ≤5%) og acceptable S / B-forhold. De EC50- og IC50-værdier , der er rapporteret her, ligger inden for området for forventede værdier.

Behandling af celler med JAK-aktivatorerne IFNα2b (phospho-STAT1, phospho-STAT3 og phospho-STAT4), IL-4 (phospho-STAT6) og EGF (phospho-STAT5) viste den forventede koncentrationsafhængige stigning i STAT-fosforylering ved specifikke tyrosinrester, mens de tilsvarende samlede STAT-proteiner (STAT1, STAT3, STAT5 og STAT6) forblev stabile (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7 , Panel A). Signalfaldet (mindre end 20%) observeret for total STAT5 med stigende STAT5-fosforylering forventes og skyldes sterisk hindring, hvor fosforylering af STAT5 hindrer bindingen af et af de to anti-total STAT5-antistoffer til dets respektive antigen. EC50-værdierne lå i det subnanomolære interval for IFNα2b og IL-4 (0,083 til 0,47 nM) og i det lave nanomolære interval for EGF (12 nM). Disse værdier er i overensstemmelse med offentliggjorte data6,11.

For at bekræfte, at signalet induceret af aktivatorerne blev medieret ved aktivering af endogene receptorer, blev cellerne forbehandlet med stigende koncentrationer af enten JAK-hæmmer 1 (en pan JAK-hæmmer) eller Erlotinib (en EGFR-tyrosinkinasehæmmer) før submaksimal stimulering (EC80) med STAT-aktivatorerne. Som forventet hæmmede både JAK-hæmmer 1 og Erlotinib de tilsvarende phospho-STAT-niveauer på en koncentrationsafhængig måde med IC50-værdier, der spænder mellem det lave nanomolære og det høje nanomolære interval for JAK-hæmmer 1 (29-759 nM) og i det lave nanomolære interval for Erlotinib (10 nM) (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7, Panel B). IC50-værdierne er i overensstemmelse med offentliggjorte data11,12,13. Som det var tilfældet for stimuleringsforsøg, blev niveauerne af tilsvarende total STAT ikke påvirket af nogen af behandlingerne. Samlet set viser disse resultater specificiteten af hvert assay for dets endogene mål STAT-protein (fosforyleret eller totalt) og deres evne til at profilere aktivatorer eller hæmmere, der udviser en række potenser.

Assays, hvor hele arbejdsgangen (cellebehandling, lysis og proteindetektion) udføres i en enkelt brønd på en 384-brønds plade uden et overførselstrin, er mere egnede til HTS. Følgelig blev phospho-STAT4- og phospho-STAT6-assays udført under anvendelse af en-pladeprotokollen. Repræsentative data opnået under optimerede forhold er opsummeret i figur 8 og figur 9. Stimulering af enten phosphoryleret STAT4 af IFNα2b i en suspensionscellelinje (U266B1; Figur 8) eller fosforyleret STAT6 af IL-4 i en klæbende cellelinje (HeLa; Figur 9) blev opnået med acceptable S/B-forhold og EC50-værdier , der er i overensstemmelse med dem, der er opnået ved anvendelse af topladeprotokollen. Disse data viser, at phospho-STAT-assays med succes kan tilpasses fra en to-plade overførselsprotokol til en en-plade alt-i-en-brønd-protokol.

Z'-faktoren anvendes almindeligvis i HTS-samfundet til evaluering af egnetheden og robustheden af et assay for HTS10. For yderligere at validere phospho-STAT-assays blev foreløbige Z'-faktorundersøgelser manuelt udført ved hjælp af to-pladeprotokollen. For at vurdere assaystabiliteten blev pladerne aflæst efter både en 4-timers inkubation og en inkubation natten over. Resultater opnået for phospho-STAT1- og phospho-STAT3-assays ved anvendelse af henholdsvis en suspensionscellelinje (U266B1) eller en klæbende cellelinje (HeLa) opsummeres i figur 10. Beregnede Z′-faktorværdier var 0,85 for phospho-STAT1 og 0,79 for phospho-STAT3. Efter inkubation natten over forblev Z'-faktorværdierne stabile (0,83 for phospho-STAT1 og 0,78 for phospho-STAT3). Lignende Z'-faktorværdier blev opnået for de andre phospho-STAT-assays (STAT4: 0,79; STAT5: 0,78; STAT6: 0,63). Et cellebaseret assay med en Z'-faktor ≥ 0,40 anses for egnet til HTS15. Følgelig viser disse resultater robustheden af disse phospho-STAT-assays til HTS-applikationer.

Figure 3
Figur 3: Påvisning af phospho-STAT1 (Y701) modulering i U266B1-celler. Celler (200.000 celler/brønd) podet i en 96-brønds dyrkningsplade blev behandlet med stigende koncentrationer af enten (A) IFNα2b i 15 minutter ved RT eller (B) JAK-hæmmer 1 i 30 minutter ved RT, derefter med 1 nM (EC80) IFNα2b i 15 minutter ved RT. Efter lysis blev lysater overført til en hvid plade med lavt volumen på 384 brønde efterfulgt af tilsætning af Antistof Detection Mix. Pladen blev inkuberet i 4 timer ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IFN = interferon; RT = stuetemperatur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Påvisning af phospho-STAT3 (Y705) og total STAT3-modulering i HeLa-celler. Celler (40.000 celler/brønd) dyrket natten over i en 96-brønds dyrkningsplade blev behandlet med stigende koncentrationer af enten (A) IFNα2b i 20 minutter ved RT eller (B) JAK-hæmmer 1 i 30 minutter ved RT og derefter med 1,5 nM IFNα2b i 20 minutter ved RT. Efter mediefjernelse og lysis blev lysater overført til en hvid plade med lavt volumen på 384 brønde efterfulgt af tilsætning af Antistof Detection Mix. Pladen blev inkuberet i 4 timer ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IFN = interferon; RT = stuetemperatur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Påvisning af phospho-STAT4 (Y693) modulering i U266B1-celler. Celler (400.000 celler/brønd) podet i en 96-brønds dyrkningsplade blev behandlet med stigende koncentrationer af enten (A) IFNα2b i 25 minutter ved 37 °C eller (B) JAK-hæmmer 1 i 30 minutter ved RT, derefter med 1 nM IFNα2b i 25 minutter ved 37 °C. Efter mediefjernelse og lysis blev lysater overført til en hvid plade med lavt volumen på 384 brønde efterfulgt af tilsætning af Antistof Detection Mix. Pladen blev inkuberet natten over ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IFN = interferon; RT = stuetemperatur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Påvisning af phospho-STAT5 (Y694/Y699) og total STAT5-modulering i A431-celler. Celler (75.000 celler/brønd) dyrket natten over i en 96-brønds dyrkningsplade blev behandlet med stigende koncentrationer af enten (A) EGF i 10 minutter ved RT eller (B) Erlotinib i 15 minutter ved RT, derefter med 73 nM EGF i 10 minutter ved RT. Efter mediefjernelse og lysis blev lysater overført til en hvid plade med lavt volumen på 384 brønde efterfulgt af tilsætning af Antistof Detection Mix. Pladen blev inkuberet natten over ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; EGF = epidermal vækstfaktor; RT = stuetemperatur; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Påvisning af phospho-STAT6 (Y641) og total STAT6-modulering i HeLa-celler. Celler (40.000 celler / brønd) dyrket natten over i en 96-brønds dyrkningsplade blev behandlet med stigende koncentrationer af enten (A) IL-4 i 20 minutter ved RT eller (B) JAK-hæmmer 1 i 30 minutter ved RT, derefter med 0,5 nM IL4 i 20 minutter ved RT. Efter mediefjernelse og lysis blev lysater overført til en hvid plade med lavt volumen på 384 brønde efterfulgt af tilsætning af Antistof Detection Mix. Pladen blev inkuberet i 4 timer ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IL = interleukin; JAK = Janus kinase; RT = stuetemperatur; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Påvisning af phospho-STAT4 (Y693) stimulering i U266B1-celler med en-plade-protokollen. Celler (160.000 celler/brønd) podet i en hvid plade med lavt volumen på 384 brønde blev straks behandlet med stigende koncentrationer af IFNα2b i 25 minutter ved 37 °C. Efter lysis blev Antibody Detection Mix tilsat direkte til lysatet. Pladen blev inkuberet natten over ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser ved hjælp af en flashlampe eller laserexcitation. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IFN = interferon; RT = stuetemperatur; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Påvisning af phospho-STAT6 (Y641) stimulering i HeLa-celler med en-pladeprotokollen. Celler (80.000 celler / brønd) podet i en lavvolumen 384-brønd hvid plade blev straks behandlet med stigende koncentrationer af IL-4 i 20 minutter ved RT. Efter lysis blev Antibody Detection Mix tilsat direkte til lysatet. Pladen blev inkuberet 4 timer ved RT og derefter læst på en TR-FRET-kompatibel læser. Data vises som gennemsnittet af tredobbelte brønde pr. Analysepunkt. Fejllinjer angiver standardafvigelse. Nogle fejllinjer er mindre end symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IL = interleukin; RT = stuetemperatur; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S/B = signal/baggrundsforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Intraplate variabilitetsundersøgelse af phospho-STAT1 (Y701) og phospho-STAT3 (Y705) assays. (A) Phospho-STAT1-assay: suspensionsceller (200.000 U266B1-celler / brønd) blev behandlet enten med 10 nM IFNα2b i 15 minutter eller serumfrit medium alene (lav kontrol). (B) Phospho-STAT3-assay: klæbende celler (20.000 HeLa-celler/brønd) blev behandlet enten med 5 nM IFNα2b i 20 minutter eller med serumfrit medium alene. For begge assays blev TR-FRET-signalet aflæst efter 4 timers inkubation. Forkortelser: STAT = signaltransducer og aktivator af transkription; IFN = interferon; TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel; S / B = signal / baggrundsforhold; CV = variationskoefficient. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med konventionelle metoder til phosphoproteinanalyse såsom western blotting og ELISA-baserede metoder er arbejdsgangen for et THUNDER TR-FRET-cellulært assay enkel og hurtig, bruger en prøve med lavt volumen (15 μL), er designet til HTS i et 384-brøndsformat og er meget modtagelig for automatisering. Analyseprotokollen er fleksibel og kan let tilpasses til både mellem- og højkapacitetsapplikationer. Assays kan køres ved hjælp af enten en to-plade overførselsprotokol eller en en-384-brønds pladeprotokol. I to-pladeoverførselsprotokollen podes, behandles og lyseres celler i en cellekulturplade, og lysater overføres efterfølgende til en separat hvid detektionsplade (halvareal 96-brønd eller 384-brønds plade) til analyse. I en pladeprotokol med en 384 brønd udføres hele arbejdsgangen i samme brønd, hvilket eliminerer behovet for et væskeoverførselstrin. Analyserne kunne let tilpasses 1536-brøndformatet ved at reducere lydstyrken proportionalt. Uanset assayprotokollen er der kun tre reagensløsninger at forberede og ingen vasketrin, og assays kan køres efter en "addition-only" protokol, der kræver minimal praktisk tid.

Et kritisk skridt i udførelsen af ethvert cellebaseret assay er optimeringen af cellekultur og behandlingsbetingelser16. Både celleantal og behandlingsbetingelser kræver omhyggelig optimering, før du kører et assay, da disse nøgleparametre ofte varierer for hver cellelinje og hvert phosphoprotein. Optimeringen af disse parametre gør det muligt at maksimere analysevinduet, opnå en optimal ydeevne med et højt S /B-forhold og lav variationskoefficient mellem brøndene og sikre resultaternes robusthed og reproducerbarhed. Celleantal, serumsult (hvis relevant) og stimulerings- eller hæmningstid (ved enten stuetemperatur eller 37 °C) bør optimeres for hver cellelinje og målprotein. For høje eller for lave celletal kan påvirke moduleringen af intracellulære signalveje negativt. Cellesåningstætheder på 40.000-80.000 celler / brønd for klæbende celler eller 100.000-200.000 celler / brønd til suspensionsceller er generelt acceptable for de fleste cellelinjer. Bemærk, at den optimale tid til stimulering og hæmning kan variere meget mellem cellelinjer og målproteiner, fra et par minutter til flere timer. Som sådan anbefales en tidskursusundersøgelse kraftigt for at bestemme de optimale stimulerings- og hæmningsinkubationstider, ideelt set ved både stuetemperatur og 37 ° C, da inkubationstemperaturen påvirker kinetikken ved målproteinstimulering.

Fejlfinding af et cellebaseret assay kan være vanskeligt og tidskrævende på grund af de mange trin, der er involveret i arbejdsgangen (cellekultur, cellebehandling, lysis og proteindetektion). Disse analysesæt indeholder et positivt kontrollysat. Det anbefales at anvende disse positive kontrollysater og negativ kontrol (1x suppleret Lysis Buffer alene) i hvert eksperiment. Brugen af korrekte kontroller letter fejlfinding, da problemer derefter hurtigt kan tilskrives enten detektionstrinnet (forkert reagensforberedelse og / eller assayudførelse) eller kvaliteten af de lysater, der anvendes i eksperimentet. Sidstnævnte skyldes generelt brugen af suboptimale cellulære forhold.

En yderligere fordel ved denne platform er tilgængeligheden af en række optimerede lysisbuffere med forskellige strengheder. Dette gør det muligt at generere mere eller mindre heterogene lysater fra delvis subcellulær fraktionering. Dette er nyttigt, fordi signalproteiner er placeret i forskellige intracellulære rum, og nogle, som STAT-proteiner, penduler mellem rum (f.eks. Mellem cytoplasmaet og kernen). Det bemærkes, at fosforyleret og total STAT1 bruger lysisbuffer 1, fordi de ikke kan påvises godt med lysisbufferen 2, der anvendes til de andre STAT-proteiner. I modsætning hertil er andre homogene metoder afhængige af en enkelt "universel" lysisbuffer, som genererer en mere kompleks prøve, der kan skabe ikke-specifikke interaktioner med antistofferne. Anvendelsen af forskellige lysisbuffere kan dog udelukke analyse af flere signalproteiner fra en enkelt lysatprøve. Ikke desto mindre kan man stadig teste lysater genereret med forskellige lysisbuffere samtidigt på en enkelt plade til parallel vejanalyse.

Afslutningsvis tilbyder de metoder, der præsenteres her baseret på denne homogene TR-FRET-cellulære immunassayplatform, et alternativ med høj gennemstrømning til overvågning af JAK/STAT-signalering via påvisning og kvantificering af endogene phosphorylerede STAT1/3/4/5/6-proteiner sammen med total STAT1/3/5/6 i cellelysater. Disse assays giver nye værktøjer til en mere omfattende analyse af specifikke STAT-proteiner efter cellebehandling og screening og karakterisering af specifikke og selektive modulatorer af JAK / STAT-signalvejene. I betragtning af sin enkelhed, specificitet, følsomhed, reproducerbarhed og omkostningseffektivitet repræsenterer denne nye analyseplatform et attraktivt alternativ til traditionelle immunassays, både i en akademisk indstilling og i industrielle laboratorier til HTS-applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Konkurrerende interesser: Jaime Padros, Mireille Caron og Geneviève Chatel er ansatte i BioAuxilium Research, som fremstiller THUNDER TR-FRET-analysesættene, der anvendes i denne undersøgelse. Derudover er Jaime Padros og Mireille Caron aktionærer i BioAuxilium Research. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse af alle JoVE-politikker om deling af data og materialer.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile Corning 3595 This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used
384-well microplate, white, low-volume PerkinElmer 6007290 This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used
A431 cell line ATCC CRL-1555
Adhesive microplate seal PerkinElmer 6050185
DMSO Fisher D159-4
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Wisent 319-005-CL  THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
EnVision Xcite Multilabel plate reader PerkinElmer 2104-0020A The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option
Erlotinib hydrochloride Sigma CDS022564
Falcon tissue culture treated flasks Fisher 13-680-65
Fetal bovine serum (FBS) Wisent 098-150
HeLa cell line ATCC CCL-2
JAK Inhibitor 1 Cayman Chemical 15146
Orbital plate shaker Many options available Not applicable
Recombinant human EGF PeproTech AF-100-15
Recombinant human IFNα2b ProSpec CYT-460
Recombinant human IL-4 R&D Systems 204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Wisent 350-007-CL THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0.05% Wisent 325-542-CL
U266B1 cell line ATCC TIB-196
Ultrapure water NA NA Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
  2. Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
  3. O'Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
  4. Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
  5. Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
  6. Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
  7. Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
  8. Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
  9. Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
  10. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  11. Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
  12. Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
  13. Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
  14. Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
  15. Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).
  16. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).

Tags

Biokemi Udgave 175 JAK/STAT-signalering STAT-proteiner Fosforylering Homogene assays TR-FRET Immunoassay Cellebaseret assay Kinaser Cellesignalering Screening med høj gennemstrømning Cytokinsignalering
Tidsopløste Förster Resonans Energy Transfer Assays til måling af endogene fosforylerede STAT-proteiner i humane celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Padros, J., Chatel, G., Caron, M.… More

Padros, J., Chatel, G., Caron, M. Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells. J. Vis. Exp. (175), e62915, doi:10.3791/62915 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter