Summary
Tidsavklarte Förster-resonansenergioverføringscellebaserte analyseprotokoller er beskrevet for enkel, spesifikk, sensitiv og robust kvantifisering av endogen fosforylater og aktivator for transkripsjon (STAT) 1/3/4/5/6 proteiner i cellelysater i et 384-brønns format.
Abstract
Janus kinase (JAK)/signaltransduser og aktivator for transkripsjon (STAT) signalvei spiller en avgjørende rolle i å formidle cellulære responser på cytokiner og vekstfaktorer. STAT-proteiner aktiveres av tyrosinfosforylering som hovedsakelig formidles av JAKs. Den unormale aktiveringen av STAT-signalveier er involvert i mange menneskelige sykdommer, spesielt kreft og immunrelaterte forhold. Derfor er evnen til å overvåke STAT-proteinfosforylering i det opprinnelige cellesignaleringsmiljøet viktig for både akademisk og narkotikaoppdagelsesforskning. De tradisjonelle analyseformatene som er tilgjengelige for å kvantifisere fosforylaterte STAT-proteiner inkluderer vestlig blotting og den enzymbundne immunosorbente analysen (ELISA). Disse heterogene metodene er arbeidsintensive, lavgjennomstrømning, og ofte ikke pålitelige (spesifikke) i tilfelle vestlig blotting. Homogene (no-wash) metoder er tilgjengelige, men forblir dyre.
Her er det gitt detaljerte protokoller for de sensitive, robuste, og kostnadseffektiv måling i et 384-brønns format av endogene nivåer av fosforilert STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (7Y694/Y699) og STAT6 (Y641) i cellelysater fra adherent- eller suspensjonsceller ved hjelp av den nye THUNDER-plattformen for tidsavklart Förster-resonansenergioverføring (TR-FRET). Arbeidsflyten for mobilanalysen er enkel, rask og utformet for screening med høy gjennomstrømning (HTS). Analyseprotokollen er fleksibel, bruker en prøve med lavt volum (15 μL), krever bare ett reagenstilleggstrinn, og kan tilpasses applikasjoner med lav gjennomstrømning og høy gjennomstrømning. Hver fosfo-STAT sandwich immunoassay er validert under optimaliserte forhold med kjente agonister og inhibitorer og genererer forventede farmakologi- og Z-faktorverdier. Siden TR-FRET-analysene er rasjonsmetriske og ikke krever vasketrinn, gir de mye bedre reproduserbarhet enn tradisjonelle tilnærminger. Sammen gir denne pakken med analyser nye kostnadseffektive verktøy for en mer omfattende analyse av spesifikke fosforaterte STAT-proteiner etter cellebehandling og screening og karakterisering av spesifikke og selektive modulatorer av JAK / STAT-signalveien.
Introduction
JAK/STAT-signalveien spiller en nøkkelrolle i å formidle cellulære responser på ulike cytokiner, interferoner, vekstfaktorer og relaterte molekyler1,2. Bindingen av disse ligandene til spesifikke celleoverflatereseptorer resulterer i aktivering av JAK-er, som igjen aktiverer STAT-proteiner ved fosforylering av spesifikke tyrosinrester. STAT fosforylering resulterer i dimerisering og translokasjon i kjernen, hvor de utøver sin effekt på transkripsjon av regulerte målgener. STAT-familien består av syv medlemmer: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b og STAT6. Medlemmene spiller en kompleks og viktig rolle i reguleringen av fysiologiske celleprosesser, inkludert spredning, differensiering, apoptose, angiogenese og immunsystemregulering. Den unormale aktiveringen av STAT-signalveier er involvert i mange menneskelige sykdommer, spesielt kreft og immunrelaterte tilstander3,4. Derfor er evnen til å vurdere STAT-proteinfosforylering i det opprinnelige cellesignaleringsmiljøet viktig for både akademisk og narkotikaoppdagelsesforskning.
Til dags dato er de konvensjonelle metodene som brukes til å måle intracellulære fosforylaterte proteinnivåer, inkludert STATs, antistoffbaserte og inkluderer vestlig blotting, ELISA og fosfoflowcytometri. Disse heterogene metodene er arbeidsintensive, tidkrevende, feilutsatte, lavgjennomstrømning og ofte upålitelige (f.eks. spesifisitetsproblemer) når det gjelder vestlig blotting5. I motsetning krever homogene analyser færre eksperimentelle trinn, bruker mindre prøvevolumer og er mottagelige for HTS. Det finnes fem homogene cellebaserte immunoassayplattformer kommersielt tilgjengelig som kan brukes til kvantitativt å overvåke JAK-avhengig fosforylering av STATs i cellelytter: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen og Lumit. Hver av disse plattformene har sine fordeler og ulemper.
SureFire er basert på luminescerende oksygenkanalteknologi, som benytter donor- og akseptorperler belagt for å spesifikt fange et par antistoffer, hvorav den ene er biotinylert. I nærvær av fosforylatert protein bringer de to antistoffene donor- og akseptorperlene i nærheten, noe som muliggjør generering av et chemiluminescent signal6. Selv om den er allsidig og følsom, er denne teknologien dyr, påvirkes av biotin i kulturmediet, er svært følsom for omgivelsestemperatur og lys, og krever en spesiell leser for deteksjon. HTRF og LANCE er begge basert på TR-FRET-teknologi som benytter lystetthetskomplekser med lang levetid (Europium eller Terbium chelater, eller Europium kryptat) som donormolekyler og fjernrøde fluoroforer som akseptormolekylene7. Når to proteinspesifikke antistoffer merket med enten donor- eller akseptormolekyler bringes i nærheten, finner FRET sted, noe som forårsaker en økning i akseptorfluorescens og en reduksjon i donorfluorescens. Disse langvarige fluorescerende signalene kan måles på en tidsavklart og forholdsmetrisk måte for å redusere analyseinterferens og øke datakvaliteten. Andre fordeler med TR-FRET er at den ikke er lysfølsom, tillater gjentatte avlesninger og viser lang signalstabilitet. Mens TR-FRET er bredt implementert i HTS på grunn av sin allsidighet, følsomhet og høye robusthet, er alle kommersielle TR-FRET-baserte analyseplattformer dyre, og dermed utelukker den brede adopsjonen i akademiske og små industrielle laboratorier. LanthaScreen-analysen bruker også en TR-FRET-basert avlesning, men er avhengig av en konstruert U2OS-cellelinje som stabilt uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP)-STAT1 fusjonsprotein kombinert med et terbium-merket fosfo-spesifikt STAT1 antistoff8. I tillegg til å være begrenset når det gjelder valg av signalproteiner, krever denne metoden å kjøpe dyre transfekterte cellelinjer, redusere anvendbarheten og øke muligheten for eksperimentelle gjenstander. Lumit er en generisk bioluminescent immunoassay plattform som benytter sekundære antistoffer (anti-mus og anti-kanin) kjemisk merket med de små og store NanoBit underenheter av NanoLuc Luciferase9. Bindingen av to primære antistoffer mot målproteinet bringer de sekundære antistoffene i nærheten for å danne et aktivt enzym som genererer et luminescenssignal. Selv om luminescens generelt er en sensitiv og robust avlesning, begrenser kravet til primære antistoffer som er reist i to forskjellige arter valgene for analysedesign. I tillegg kan bruk av sekundære antistoffer i komplekse prøvematriser være utsatt for analyseforstyrrelser.
Dermed eksisterer det fortsatt et behov for en pålitelig, rask, men rimelig cellebasert analyseplattform for måling av individuelle fosforierte og totale STAT-proteiner på en måte som er kompatibel med HTS. For å møte dette behovet ble en ny cellebasert immunoassay-plattform med høy gjennomstrømning utviklet basert på en forbedret TR-FRET-teknologi (THUNDER) og designet for å muliggjøre enkel, sensitiv, robust og kostnadseffektiv måling av endogenede uttrykte intracellulære proteiner (fosforert eller total) i cellelytter. Fordelene med denne teknologien stammer fra kombinasjonen av et donor/akseptor FRET-par som viser eksepsjonell spektralkompatibilitet og TR-FRET-signal, strengt validerte antistoffer og optimaliserte lysisbuffere. Disse analysene er formatert som sandwichimmunoassays og bruker en enkel, tretrinns arbeidsflyt (figur 1). Celler behandles først for å modulere proteinfosforylering og deretter lyses med den spesifikke lysisbufferen som følger med i settet. Målet fosforylatert eller totalt STAT-protein i cellelysatet påvises i et enkelt reagenstilsetnings- og inkubasjonstrinn med et par fluoroformerkede antistoffer som gjenkjenner distinkte epitoper på målproteinet (figur 2). Ett antistoff er merket med en Europium chelatdonor (Eu-Ab1), mens det andre antistoffet er merket med en fjernrød akseptorfluofor (FR-Ab2). De to merkede antistoffene binder seg til proteinet i løsningen, og bringer de to etikettene i nærheten. Eksitasjon av donoren Europium chelate ved 320 eller 340 nm utløser en FRET til akseptoren, som avgir et langvarig TR-FRET-signal på 665 nm proporsjonalt med konsentrasjonen av målprotein (fosforilert eller totalt) i cellelyset.
Figur 1: Arbeidsflyt for TR-FRET-analyse. Arbeidsflyten består av tre trinn: cellebehandling, cellelys og proteindeteksjon ved hjelp av TR-FRET. I toplateanalyseprotokollen overføres lysater til en hvit 384-brønns deteksjonsplate, mens i enplateprotokollen utføres alle trinnene i samme hvite 384-brønns deteksjonsplate (alt-i-ett-brønnsprotokoll). Uavhengig av analyseprotokollen som brukes, utføres proteindeteksjon i samme totale volum (20 μL per brønn). Forkortelse: TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: TR-FRET sandwichimmunoassay-prinsippet. Ett antistoff er merket med Europium chelate donor (Eu-Ab1) og det andre med den fjerne røde lille fluorofor akseptoren (FR-Ab2). De to merkede antistoffene binder seg spesielt til distinkte epitoper på målproteinet (fosforylatert eller totalt) i cellelysatet, og bringer de to fluoroforene i nærheten. Eksitasjon av donoren Europium chelate på 320 eller 340 nm utløser en FRET fra donoren til akseptormolekylene, som igjen avgir et signal på 665 nm. Dette signalet er proporsjonalt med konsentrasjonen av protein i cellelyset. I fravær av det spesifikke målproteinet er donor og akseptorfluoreorer for fjerne fra hverandre for at FRET skal oppstå. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverføring; TR-FRET = tidsavklart FRET; Ab = antistoff; FR = fjernrød; Eu - Europium chelate; P = fosforylering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Her er detaljerte protokoller gitt for måling, i et 384-brønns format, intracellulære nivåer av fosforilert STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) og STAT6 (Y641), sammen med total STAT1, STAT3, STAT5 og STAT6, i cellelysater fra adherent- eller suspensjonsceller ved hjelp av THUNDER TR-FRET-plattformen. Disse protokollene definerer trinn for cellebehandling, lysis og TR-FRET-basert målproteindeteksjon ved hjelp av enten en to-plate overføringsprotokoll eller en en-plate alt-i-ett-brønns protokoll. Disse cellebaserte analysene brukes til å bestemme den farmakologiske profilen til kjente aktivatorer og hemmere av JAK / STAT-banen. Robustheten og egnetheten til utvalgte analyser for HTS er demonstrert. Til slutt diskuteres viktige eksperimenter for analyseoptimalisering, sammen med anbefalinger for analysefeilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
- Opprettholde celler i en fuktet 37 ° C / 5% CO2 inkubator og kultur med enten DMEM supplert med 10% foster bovint serum (FBS) (HeLa og A431 celler) eller RPMI supplert med 15% FBS (U266B1 celler). Kultur cellene til de når 70-80% samløp, deretter prøve å prøve dem og passasje eller bruke dem til analysene.
MERK: Kulturmedier inneholdt fenolrød. Ingen serum sult ble utført for noen cellelinje før gjennomføring av analysene.
2. Stimulator- eller hemmertitrering ved bruk av toplateanalyseprotokollen med adherentceller
MERK: Denne prosedyren beskriver hvordan du bestemmer stimulator- eller inhibitorgryter ved å generere en konsentrasjonsresponskurve fra en fortynningsserie av testforbindelsen.
- Celle såing
- Dispenser 50 μL celler med den forhåndsoptimaliserte tettheten (40 000 HeLa-celler/brønn for både STAT3 og STAT6; 75 000 A431 celler/brønn for STAT5) til en 96-brønns vevskulturbehandlet plate i riktig kulturmedium. Inkuber over natten ved 37 °C/5 % CO2.
MERK: Optimal celletetthet og kulturinkubasjonstid må bestemmes.
- Dispenser 50 μL celler med den forhåndsoptimaliserte tettheten (40 000 HeLa-celler/brønn for både STAT3 og STAT6; 75 000 A431 celler/brønn for STAT5) til en 96-brønns vevskulturbehandlet plate i riktig kulturmedium. Inkuber over natten ved 37 °C/5 % CO2.
- Fortynning av testforbindelser
- Forbered mellomliggende 2x fortynningsserier av testforbindelser ved å seriefortynne forbindelser (halvloggintervallfortynning) over 12 brønner av en polypropylen 96-brønnsplate i serumfritt medium.
MERK: Det anbefales å gjennomføre en 12-punkts, halvlogget intervallkonsentrasjonsresponskurve i minst duplisert for en nøyaktig estimering av EC50 eller IC50. - Alternativt, for hydrofobe, dimetylsulfoksid (DMSO)-løselige testforbindelser, utfør de første fortynningene i 100% DMSO, og fortynn deretter den sammensatte fortynningsserien til serumfritt medium.
MERK: Analysetoleransen til DMSO må etableres før du utfører en testsammensetning titrering i DMSO-kjøretøy. Det er viktig å holde like løsemiddelkonsentrasjoner mellom behandlede og ubehandlede celler. I tillegg, når du tester serielle fortynninger av forbindelser, bør løsningsmiddelkonsentrasjonene alltid forbli konstante over fortynningsserien.
- Forbered mellomliggende 2x fortynningsserier av testforbindelser ved å seriefortynne forbindelser (halvloggintervallfortynning) over 12 brønner av en polypropylen 96-brønnsplate i serumfritt medium.
- Cellebehandling
- For cellestimulering tilsettes 50 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller inneholder stimulatoren (2x).
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten romtemperatur (RT) eller 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min ved RT for STAT3; epidermal vekstfaktor (EGF)/10 min ved RT for STAT5; interleukin (IL)-4/20 min ved RT for STAT6). Fortsett deretter til avsnitt 2.4.
MERK: Optimal inkubasjonstemperatur må bestemmes. - For celleinhibering, tilsett 25 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller inneholder inhibitoren (4x).
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten RT eller 37 °C (JAK-hemmer 1/30 min ved RT for STAT3 og STAT6; Erlotinib/15 min ved RT for STAT5).
- Tilsett 25 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller som inneholder stimulatoren (4x) ved EC80.
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten RT eller 37 °C (samme forhold som for trinn 2.3.2).
- Celle lysis
- Klargjør settets spesifikke 1x supplerte lysisbuffer som angitt av produsenten.
MERK: Det er obligatorisk å supplere 1x Lysis Buffer med 100x fosfatasehemmercocktail fortynnet til en endelig konsentrasjon på 1x. Den 1x supplerte Lysis Buffer inneholder 1 mM natriumfluorid, 2 mM natriumorthovanadate og 2 mM beta-glyserofosfat. Andre fosfatasehemmere er ikke nødvendig og bør unngås. Lysis buffere og fosfatasehemmere annet enn de som er inkludert i settet, anbefales ikke, da de kan inneholde ingredienser som kan forstyrre målingen. - Fjern og kast cellekulturmediet forsiktig ved å aspirere supernatanten.
- Tilsett umiddelbart 50 μL 1x supplert lysisbuffer.
MERK: Lysis Buffervolum (25-50 μL) kan optimaliseres. - Inkuber i 30 min ved RT under risting (orbital plate shaker satt til 400 rpm; moderat agitasjon).
MERK: Lysis inkubasjonstid (30-60 min) kan optimaliseres. Lysater kan brukes umiddelbart for målproteindeteksjon eller frosset ved -80 °C.
- Klargjør settets spesifikke 1x supplerte lysisbuffer som angitt av produsenten.
- TR-FRET-deteksjon
- Klargjør 4x antistoffdeteksjonsblandingen i 1x deteksjonsbuffer som angitt av produsenten.
- I dette overføringstrinnet, forsiktig pipette 15 μL cellelys fra 96-brønns kulturplaten til en brønn av en hvit, lavvolum 384-brønns mikroplate.
- Tilsett 15 μL av Positive Control Lysate og 15 μL 1x Lysis Buffer (negativ kontroll) for å skille analysebrønner.
- Tilsett 5 μL 4x antistoffdeteksjonsblanding (enten Eu-Ab1/FR-Ab2 for påvisning av fosfoproteinet eller Eu-Ab3/FR-Ab4 for påvisning av det totale proteinet) til hver av analysebrønnene.
- Dekk platen med en plateforsegler og inkuber i 1 time opp til over natten på RT, avhengig av analysen (se det tilsvarende tekniske databladet).
MERK: Optimal lesetid må optimaliseres for hver analyse og cellelinje. Platen kan leses flere ganger uten en negativ effekt på analyseytelsen. - Fjern klebeplatetetningsmiddelet og les platen på en TR-FRET-kompatibel mikroplateleser.
MERK: Filterbaserte fluorometre anbefales, selv om noen monokromerinstrumenter kan brukes. Kontroller at riktig optisk modul (filtre og speil) for TR-FRET er installert. Bruk en eksitasjonsbølgelengde på 320 eller 340 nm for å begeistre Europium chelate. Les analyser både på 615 nm (eller 620 nm) og 665 nm for å oppdage både utslippet fra donor europium og akseptor fluorophore, henholdsvis. Instrumentinnstillingene avhenger av den bestemte leseren. Data presentert her ble innhentet ved hjelp av lampebasert eksitasjon, 90 μs forsinkelse, 300 μs integrasjonstid og 100 blink per brønn. Fosfo-STAT4-analysen ble imidlertid lest ved hjelp av lasereksitasjon for å generere høyere signal-til-bakgrunn (S / B) forhold.
3. Stimulator- eller hemmertitrering ved hjelp av toplateanalyseprotokollen med suspensjonsceller
- Fortynning av testforbindelser
- Forbered mellomliggende 2x fortynningsserier av testforbindelser som beskrevet i trinn 2.2.1 og 2.2.2.
- Cellesåing og behandling
- Dispenser 20 μL celler ved den forhåndsoptimaliserte tettheten (200 000 U266B1 celler/brønn for STAT1; 400 000 U266B1 celler/brønn for STAT4) til en 96-brønns vevskulturbehandlet plate i riktig kulturmedium. Fortsett direkte til cellebehandling eller inkuber 2-4 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Dette trinnet må optimaliseres for forskjellige celletyper. - For cellestimulering tilsettes 20 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller inneholder stimulatoren (2x).
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten RT eller 37 °C (IFNα2b/15 min ved RT for STAT1; IFNα2b/25 min ved 37 °C for STAT4). Fortsett deretter til avsnitt 3.3.
MERK: Optimal inkubasjonstemperatur må bestemmes. - For celleinhibering, tilsett 10 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller inneholder inhibitoren (4x).
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten RT eller 37 °C (JAK-hemmer 1/30 min ved RT for STAT1 og STAT4).
- Tilsett 10 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller som inneholder stimulatoren (4x) ved EC80.
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten RT eller 37 °C (samme forhold som for trinn 3.2.3).
- Dispenser 20 μL celler ved den forhåndsoptimaliserte tettheten (200 000 U266B1 celler/brønn for STAT1; 400 000 U266B1 celler/brønn for STAT4) til en 96-brønns vevskulturbehandlet plate i riktig kulturmedium. Fortsett direkte til cellebehandling eller inkuber 2-4 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Celle lysis
- Klargjør settets spesifikke 5x supplerte Lysis Buffer som angitt av produsenten.
MERK: Det er obligatorisk å supplere 5x Lysis Buffer med 100x fosfatasehemmercocktail fortynnet til en endelig konsentrasjon på 5x. Den 5x supplerte Lysis Buffer inneholder 5 mM natriumfluorid, 10 mM natriumorthovanadate og 10 mM beta-glyserofosfat. Andre fosfatasehemmere er ikke nødvendig og bør unngås. - Tilsett 10 μL 5x ekstra lysisbuffer.
- Inkuber i 30 min ved RT under risting (orbital plate shaker satt til 400 rpm; moderat agitasjon).
MERK: Lysis inkubasjonstid (30-60 min) kan optimaliseres. Lysater kan brukes umiddelbart for målproteindeteksjon eller frosset ved -80 °C.
- Klargjør settets spesifikke 5x supplerte Lysis Buffer som angitt av produsenten.
- TR-FRET-deteksjon
- Etter cellelysis utfører du TR-FRET-registreringstrinnet som beskrevet i avsnitt 2.5 for 2-plateanalyseprotokollen for tilhengerceller.
4. Stimulatortitrering ved hjelp av enplateanalyseprotokollen med tilhenger- eller suspensjonsceller
- Fortynning av testforbindelser
- Forbered mellomliggende fortynningsserier av testforbindelser ved 3x ved serielt fortynningsforbindelser (halvloggintervallfortynning) over 12 brønner av en polypropylen 96-brønnsplate i serumfritt medium.
- Cellesåing og behandling
- Dispenser 8 μL celler ved den forhåndsoptimaliserte tettheten (160 000 U266B1 celler/brønn for STAT4; 80 000 HeLa-celler/brønn for STAT6), i det aktuelle serumfrie kulturmediet, til en hvit, lavvolum 384well analyseplate. Fortsett direkte til cellebehandling eller inkuber 2-4 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Kravet til en inkubasjonsperiode for cellekultur før behandling må bestemmes for forskjellige celletyper. - For cellestimulering tilsettes 4 μL serumfritt medium alene (ubehandlede celler) eller inneholder stimulatoren (3x).
- Inkuber for forhåndsoptimalisert tid ved enten romtemperatur eller 37 °C (IFNα2b/25 min ved 37 °C for STAT4; IL-4/20 min ved 37°C for STAT6). Fortsett deretter til avsnitt 4.3.
- Dispenser 8 μL celler ved den forhåndsoptimaliserte tettheten (160 000 U266B1 celler/brønn for STAT4; 80 000 HeLa-celler/brønn for STAT6), i det aktuelle serumfrie kulturmediet, til en hvit, lavvolum 384well analyseplate. Fortsett direkte til cellebehandling eller inkuber 2-4 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Celle lysis
- Klargjør settets spesifikke 5x supplerte Lysis Buffer som angitt av produsenten.
MERK: Det er obligatorisk å supplere 5x Lysis Buffer med 100x fosfatasehemmercocktail fortynnet til en endelig konsentrasjon på 5x. - Tilsett 3 μL 5x supplert Lysis-buffer.
- Inkuber i 30 min ved RT under risting (orbital plate shaker ved 400 rpm).
MERK: Lysis inkubasjonstid (30-60 min) kan optimaliseres. Lysater kan brukes umiddelbart eller fryses ved 80 °C.
- Klargjør settets spesifikke 5x supplerte Lysis Buffer som angitt av produsenten.
- TR-FRET-deteksjon
- Tilsett 15 μL positiv kontrolllysat (ufortynnet) og 15 μL 1x supplert lysisbuffer (negativ kontroll) for å skille analysebrønner.
- Tilsett 5 μL 4x antistoffdeteksjonsblanding (enten Eu-Ab1/FR-Ab2 for fosfoproteinet eller Eu-Ab3-/FR-Ab4 for det totale proteinet) fremstilt i 1x deteksjonsbuffer til hver av analysebrønnene.
- Dekk platen med en plateforsegler og inkuber i 1 time opp til over natten på RT, avhengig av analysen.
MERK: Optimal lesetid må optimaliseres for hver analyse og cellelinje. Platen kan leses flere ganger uten en negativ effekt på analyseytelsen. - Fjern selvklebende plateforsegler. Les platen på en TR-FRET-kompatibel mikroplateleser.
5. Dataanalyse
- Beregn forholdet mellom TR og FRET for hver brønn ved hjelp av følgende formel (1):
(1)
MERK: Fordi TR-FRET-signalet leses i tids løst modus, er det vanligvis ikke nødvendig med bakgrunnsdeltrekk. Hvis det gjennomføres bakgrunnsdeltrekk, bruker du de cellefrie brønnene som inneholder 1x supplert Lysis buffer (negativ kontroll) for bakgrunnsdelsnitt. Bestem det gjennomsnittlige TR-FRET-forholdet fra de cellefrie brønnene, og trekk deretter denne verdien fra forholdet mellom TR og FRET for hver brønn. - For konsentrasjonsresponskurver analyserer du dataene i henhold til en ikke-lineær regresjon ved hjelp av 4-parameterens logistiske ligning (sigmoidal doseresponskurve med variabel helling) og en 1/Y2-datavekting for å generere EC50- eller IC50-verdier.
- For Z'-faktoreksperimentet analyserer du dataene i henhold til følgende formel (2)10
(2)
Der μ og σ er gjennomsnittsverdiene og standardavvikene for henholdsvis den positive kontrollen (p; stimulerte celler) og negativ kontroll (n; ubehandlede celler).
(1)
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hver THUNDER TR-FRET-analyse ble farmakologisk validert ved å behandle tilhenger (HeLa eller A431) eller suspensjonsceller (U266B1) med JAK/STAT-banespesifikke aktivatorer eller hemmere og deretter måle nivåene av spesifikke fosforylerte og totale STATs, når det er aktuelt. Analysene ble utført i 384-brønnsformat ved hjelp av to-plate overføringsprotokollen og forhåndsoptimaliserte analyseforhold. Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7 oppsummerer representative konsentrasjonsresponskurver oppnådd for alle STAT-analyser. Samlet sett viste alle stimulator- og hemmerkonsentrasjonsresponskurver for fosfo-STAT-analysene robuste TR-FRET-signaler, brede dynamiske områder, lav variasjonskoeffisient mellom brønner (vanligvis ≤5 %) og akseptable S/B-forhold. EC50 - og IC50-verdiene som rapporteres her, er innenfor området for forventede verdier.
Behandling av celler med JAK-aktivatorene IFNα2b (fosfo-STAT1, fosfo-STAT3, og fosfo-STAT4), IL-4 (fosfo-STAT6) og EGF (fosfo-STAT5) viste den forventede konsentrasjonsavhengige økningen i STAT fosforylering ved spesifikke tyrosinrester, mens de tilsvarende totale STAT-proteinene (STAT1, STAT3, STAT5 og STAT6) holdt seg stabile (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7 , Panel A). Signalreduksjonen (mindre enn 20%) observert for total STAT5 med økende STAT5 fosforylering forventes og skyldes sterisk hindring, hvor fosforylering av STAT5 hindrer bindingen av ett av de to anti-totale STAT5-antistoffene mot det respektive antigenet. EC50-verdiene var i sub-nanomolarområdet for IFNα2b og IL-4 (0,083 til 0,47 nM) og i det lave nanomolarområdet for EGF (12 nM). Disse verdiene er i samsvar med publiserte data6,11.
For å bekrefte at signalet fra aktivatorene ble formidlet ved aktivering av endogene reseptorer, ble celler forbehandlet med økende konsentrasjoner av enten JAK Inhibitor 1 (en pan JAK-hemmer) eller Erlotinib (en EGFR tyrosinkinasehemmer) før submaksimal stimulering (EC80) med STAT-aktivatorene. Som forventet hemmet både JAK Inhibitor 1 og Erlotinib de tilsvarende fosfo-STAT-nivåene på en konsentrasjonsavhengig måte, med IC50-verdier som spenner mellom det lave nanomolaren og det høye nanomolarområdet for JAK-hemmer 1 (29-759 nM) og i det lave nanomolarområdet for Erlotinib (10 nM) (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 7, Panel B). IC50-verdiene samsvarer med publiserte data11,12,13. Som tilfellet var for stimuleringsforsøk, ble nivåene av tilsvarende total STAT ikke påvirket av noen av behandlingene. Samlet viser disse resultatene spesifisiteten til hver analyse for sitt endogene mål STAT-protein (fosforylatert eller totalt) og deres evne til å profilere aktivatorer eller inhibitorer som viser en rekke potenser.
Analyser der hele arbeidsflyten (cellebehandling, lysis og proteindeteksjon) utføres i en enkelt brønn av en 384-brønns plate uten overføringstrinn, er mer egnet for HTS. Følgelig ble fosfo-STAT4- og fosfo-STAT6-analysene utført ved hjelp av enplateprotokollen. Representative data innhentet under optimaliserte forhold er oppsummert i figur 8 og figur 9. Stimulering av enten fosforert STAT4 av IFNα2b i en suspensjonscellelinje (U266B1; Figur 8) eller fosforylert STAT6 av IL-4 i en tilhengercellelinje (HeLa; Figur 9) ble oppnådd med akseptable S/B-forhold og EC50-verdier i samsvar med verdiene som ble oppnådd ved hjelp av toplateprotokollen. Disse dataene viser at fosfo-STAT-analysene kan tilpasses fra en to-plate overføringsprotokoll til en en-plate alt-i-en-brønns protokoll.
Z'-faktoren brukes ofte i HTS-samfunnet for evaluering av egnetheten og robustheten til en analyse for HTS10. For å validere fosfo-STAT-analysene ytterligere, ble foreløpige Z'-faktorstudier utført manuelt ved hjelp av toplateprotokollen. For å vurdere analysestabilitet ble plater lest etter både en 4-timers inkubasjon og en overnatting inkubasjon. Resultater oppnådd for fosfo-STAT1- og fosfo-STAT3-analysene, ved hjelp av en suspensjonscellelinje (U266B1) eller en tilhengercellelinje (HeLa), oppsummeres i figur 10. Beregnede Z′-faktor verdier var 0,85 for fosfo-STAT1 og 0,79 for fosfo-STAT3. Etter inkubering over natten holdt Z'-faktorverdiene seg stabile (0,83 for fosfo-STAT1 og 0,78 for fosfo-STAT3). Lignende Z-faktorverdier ble oppnådd for de andre fosfo-STAT-analysene (STAT4: 0,79; STAT5: 0,78; STAT6: 0,63). En cellebasert analyse med Z-faktor ≥ 0,40 anses som egnet for HTS15. Følgelig viser disse resultatene robustheten til disse fosfo-STAT-analysene for HTS-applikasjoner.
Figur 3: Påvisning av fosfo-STAT1 (Y701) modulering i U266B1-celler. Celler (200.000 celler/brønn) frøet i en 96-brønns kulturplate ble behandlet med økende konsentrasjoner av enten (A) IFNα2b i 15 min ved RT eller (B) JAK Inhibitor 1 i 30 min ved RT, deretter med 1 nM (EC80) IFNα2b i 15 min ved RT. Etter lysis ble lysater overført til en lavvolum 384-brønns hvit plate, etterfulgt av tilsetningen av Antistoffdeteksjonsblandingen. Platen ble inkubert i 4 timer ved RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IFN = interferon; RT = romtemperatur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påvisning av fosfo-STAT3 (Y705) og total STAT3-modulasjon i HeLa-celler. Celler (40 000 celler/brønner) dyrket over natten i en 96-brønns kulturplate ble behandlet med økende konsentrasjoner av enten (A) IFNα2b i 20 minutter ved RT eller (B) JAK Inhibitor 1 i 30 min ved RT, deretter med 1,5 nM IFNα2b i 20 minutter ved RT. Etter mediefjerning og lysis ble lysater overført til en lavvolum 384-brønns hvit plate, etterfulgt av tilsetning av Antistoffdeteksjonsblandingen. Platen ble inkubert i 4 timer ved RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IFN = interferon; RT = romtemperatur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Påvisning av fosfo-STAT4 (Y693) modulering i U266B1-celler. Celler (400.000 celler/brønn) sådd i en 96-brønns kulturplate ble behandlet med økende konsentrasjoner av enten (A) IFNα2b i 25 min ved 37 °C eller (B) JAK Inhibitor 1 i 30 minutter ved RT, deretter med 1 nM IFNα2b i 25 minutter ved 37 °C. Etter mediefjerning og lysis ble lysater overført til en lavvolum 384-brønns hvit plate, etterfulgt av tilsetning av Antistoffdeteksjonsblandingen. Platen ble inkubert over natten på RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IFN = interferon; RT = romtemperatur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Påvisning av fosfo-STAT5 (Y694/Y699) og total STAT5-modulasjon i A431-celler. Celler (75 000 celler/brønner) dyrket over natten i en 96-brønns kulturplate ble behandlet med økende konsentrasjoner av enten (A) EGF i 10 minutter ved RT eller (B) Erlotinib i 15 min ved RT, deretter med 73 nM EGF i 10 minutter ved RT. Etter mediefjerning og lysis ble lysater overført til en lavvolum 384-brønns hvit plate, etterfulgt av tilsetning av Antistoffdeteksjonsblandingen. Platen ble inkubert over natten på RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; EGF = epidermal vekstfaktor; RT = romtemperatur; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Påvisning av fosfo-STAT6 (Y641) og total STAT6-modulasjon i HeLa-celler. Celler (40 000 celler/brønner) dyrket over natten i en 96-brønns kulturplate ble behandlet med økende konsentrasjoner av enten (A) IL-4 i 20 minutter ved RT eller (B) JAK Inhibitor 1 i 30 min ved RT, deretter med 0,5 nM IL4 i 20 minutter ved RT. Etter mediefjerning og lysis ble lysater overført til en lavvolum 384-brønns hvit plate, etterfulgt av tilsetning av Antistoffdeteksjonsblandingen. Platen ble inkubert i 4 timer ved RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IL = interleukin; JAK = Janus kinase; RT = romtemperatur; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Påvisning av fosfo-STAT4 (Y693) stimulering i U266B1-celler med enplateprotokollen. Celler (160.000 celler/brønn) sådd i en lavvolum 384-brønns hvit plate ble umiddelbart behandlet med økende konsentrasjoner av IFNα2b i 25 min ved 37 °C. Etter lysis ble Antistoffdeteksjonsblandingen tilsatt direkte til lysatet. Platen ble inkubert over natten på RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser ved hjelp av en blitslampe eller lasereksitasjon. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IFN = interferon; RT = romtemperatur; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Påvisning av fosfo-STAT6 (Y641) stimulering i HeLa-celler med enplateprotokollen. Celler (80.000 celler/brønn) sådd i en lavvolum 384-brønns hvit plate ble umiddelbart behandlet med økende konsentrasjoner på IL-4 i 20 min ved RT. Etter lysis ble Antistoffdeteksjonsblandingen tilsatt direkte til lysatet. Platen ble inkubert 4 timer ved RT og deretter lest på en TR-FRET-kompatibel leser. Data vises som gjennomsnittet av triplikatbrønner per analysepunkt. Feilfelt angir standardavvik. Noen feilfelt er mindre enn symbolstørrelsen. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IL = interleukin; RT = romtemperatur; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal-/bakgrunnsforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Intraplatevariabilitetsstudie av fosfo-STAT1 (Y701) og fosfo-STAT3 (Y705)-analysene. (A) Fosfo-STAT1-analyse: suspensjonsceller (200 000 U266B1 celler/brønn) ble behandlet enten med 10 nM IFNα2b i 15 minutter eller serumfritt medium alene (lave kontroller). (B) Fosfo-STAT3-analyse: adherentceller (20 000 HeLa-celler/brønn) ble behandlet enten med 5 nM IFNα2b i 20 minutter eller med serumfritt medium alene. For begge analysene ble TR-FRET-signalet lest etter 4 timers inkubasjon. Forkortelser: STAT = signaltransduser og aktivator for transkripsjon; IFN = interferon; TR-FRET = tidsavklart Förster resonans energioverføring; S/B = signal/bakgrunnsforhold; CV = variasjonskoeffisient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med konvensjonelle metoder for fosfoproteinanalyse som vestlig blotting og ELISA-baserte metoder, er arbeidsflyten for en THUNDER TR-FRET cellulær analyse enkel og rask, bruker en lavvolumprøve (15 μL), er designet for HTS i et 384-brønns format, og er svært mottagelig for automatisering. Analyseprotokollen er fleksibel og kan lett tilpasses både mellomstore og høye gjennomstrømningsapplikasjoner. Analyser kan kjøres enten ved hjelp av en to-plate overføringsprotokoll eller en en-384-brønns plateprotokoll. I toplateoverføringsprotokollen blir cellene sådd, behandlet og lysed i en cellekulturplate, og lysater overføres deretter til en separat hvit deteksjonsplate (halvareal 96-brønns eller 384-brønns plate) for analyse. I en en-384-brønns plateprotokoll utføres hele arbeidsflyten i samme brønn, og eliminerer behovet for et flytende overføringstrinn. Analysene kan enkelt tilpasses 1536-brønnsformatet ved å redusere volumet proporsjonalt. Uavhengig av analyseprotokollen er det bare tre reagensløsninger for å forberede og ingen vasketrinn, og analysene kan kjøres etter en "tilleggsprotokoll", som krever minimal praktisk tid.
Et kritisk skritt i å utføre en cellebasert analyse er optimalisering av cellekultur og behandlingsbetingelser16. Både cellenummeret og behandlingsforholdene krever nøye optimalisering før du kjører en analyse, da disse nøkkelparametrene ofte varierer for hver cellelinje og hvert fosfoprotein. Optimaliseringen av disse parametrene gjør det mulig å maksimere analysevinduet, oppnå optimal ytelse med et høyt S/B-forhold og lav variasjonskoeffisient mellom brønner, og sikre robustheten og reproduserbarheten til resultatene. Cellenummer, serumsult (når det er hensiktsmessig), og stimulering eller hemmingstid (ved enten romtemperatur eller 37 °C) bør optimaliseres for hver cellelinje og målprotein. For høye eller for lave celletall kan påvirke moduleringen av intracellulære signalveier negativt. Cellesåingstettheter på 40 000-80 000 celler/brønn for adherentceller eller 100 000-200 000 celler/brønn for suspensjonsceller er generelt akseptable for de fleste cellelinjer. Vær oppmerksom på at den optimale tiden for stimulering og hemming kan variere mye mellom cellelinjer og målproteiner, fra noen få minutter til flere timer. Som sådan anbefales en tidskursstudie sterkt for å bestemme optimal stimulering og inhibering inkubasjonstider, ideelt ved både romtemperatur og 37 °C, da inkubasjonstemperatur påvirker kinetikken til målproteinstimulering.
Feilsøking av en cellebasert analyse kan være vanskelig og tidkrevende på grunn av de mange trinnene som er involvert i arbeidsflyten (cellekultur, cellebehandling, lysis og proteindeteksjon). Disse analysesettene inkluderer en positiv kontrolllys. Det anbefales å bruke disse positive kontrolllysene og negativ kontroll (1x supplert Lysis Buffer alene) i hvert eksperiment. Bruken av riktige kontroller forenkler feilsøking, da problemer deretter raskt kan tilskrives enten deteksjonstrinnet (feil reagensforberedelse og / eller analyseutførelse) eller kvaliteten på lysatene som brukes i eksperimentet. Sistnevnte skyldes vanligvis bruk av suboptimale cellulære forhold.
En ekstra fordel med denne plattformen er tilgjengeligheten av en pakke med optimaliserte lysisbuffere med forskjellige strenger. Dette gjør det mulig å generere mer eller mindre heterogene lysater fra delvis subcellulær fraksjonering. Dette er nyttig fordi signalproteiner er plassert i ulike intracellulære rom, og noen, som STAT-proteiner, romferger mellom rom (f.eks. mellom cytoplasma og kjernen). Vær oppmerksom på at fosforylatert og total STAT1 bruker lysisbuffer 1 fordi de ikke kan påvises godt med lysisbufferen 2 som brukes til de andre STAT-proteinene. I motsetning er andre homogene metoder avhengige av en enkelt "universell" lysisbuffer, som genererer en mer kompleks prøve som kan skape ikke-spesifikke interaksjoner med antistoffene. Bruken av forskjellige lysisbuffere kan imidlertid utelukke analyse av flere signalproteiner fra en enkelt lysatprøve. Likevel kan man fortsatt teste lysater generert med forskjellige lysisbuffere samtidig på en enkelt plate for parallellbaneanalyse.
Avslutningsvis tilbyr metodene som presenteres her basert på denne homogene TR-FRET cellulære immunoassay-plattformen et høygjennomstrømningsalternativ for overvåking av JAK/ STAT-signalering via deteksjon og kvantifisering av endogene fosforlater STAT1/3/4/5/6 proteiner, sammen med total STAT1/3/5/6, i cellelysater. Disse analysene gir nye verktøy for en mer omfattende analyse av spesifikke STAT-proteiner etter cellebehandling og screening og karakterisering av spesifikke og selektive modulatorer av JAK / STAT-signalveiene. Gitt sin enkelhet, spesifisitet, følsomhet, reproduserbarhet og kostnadseffektivitet, representerer denne nye analyseplattformen et attraktivt alternativ til tradisjonelle immunoassays, både i akademiske omgivelser og i industrielle laboratorier for HTS-applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Konkurrerende interesser: Jaime Padros, Mireille Caron og Geneviève Chatel er ansatte i BioAuxilium Research, som produserer THUNDER TR-FRET analysesett som brukes i denne studien. I tillegg er Jaime Padros og Mireille Caron aksjonærer i BioAuxilium Research. Dette endrer ikke forfatternes overholdelse av alle JoVE-retningslinjer for deling av data og materiale.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4P-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
References
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
- O'Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
- Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
- Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
- Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
- Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
- Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
- Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
- Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
- Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
- Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
- Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).
