Los protocolos de ensayo basados en células de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo se describen para la cuantificación simple, específica, sensible y robusta del transductor de señal fosforilada endógena y el activador de la transcripción (STAT) 1/3/4/5/6 proteínas en lisados celulares en un formato de 384 pocillos.
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Artículo de método
Ensayos de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo para la medición de proteínas STAT fosforiladas endógenas en células humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
La vía de señalización de la quinasa Janus (JAK)/transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) desempeña un papel crucial en la mediación de las respuestas celulares a las citoquinas y los factores de crecimiento. Las proteínas STAT son activadas por fosforilación de tirosina mediada principalmente por JAK. La activación anormal de las vías de señalización STAT está implicada en muchas enfermedades humanas, especialmente el cáncer y las afecciones relacionadas con el sistema inmunológico. Por lo tanto, la capacidad de monitorear la fosforilación de la proteína STAT dentro del entorno de señalización celular nativa es importante tanto para la investigación académica como para la investigación de descubrimiento de fármacos. Los formatos de ensayo tradicionales disponibles para cuantificar las proteínas STAT fosforiladas incluyen western blotting y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Estos métodos heterogéneos son intensivos en mano de obra, de bajo rendimiento y, a menudo, no confiables (específicos) en el caso de Western Blotting. Los métodos homogéneos (sin lavado) están disponibles, pero siguen siendo caros.
Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la medición sensible, robusta y rentable en un formato de 384 pocillos de niveles endógenos de STAT1 fosforilado (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) y STAT6 (Y641) en lisados celulares de células adherentes o de suspensión utilizando la nueva plataforma de transferencia de energía de resonancia de Förster resuelta en el tiempo (TR-FRET) THUNDER. El flujo de trabajo para el ensayo celular es simple, rápido y está diseñado para el cribado de alto rendimiento (HTS). El protocolo de ensayo es flexible, utiliza una muestra de bajo volumen (15 μL), requiere solo un paso de adición de reactivos y se puede adaptar a aplicaciones de bajo rendimiento y alto rendimiento. Cada inmunoensayo sándwich fosfo-STAT se valida en condiciones optimizadas con agonistas e inhibidores conocidos y genera los valores esperados de farmacología y factor Z'. Como los ensayos TR-FRET son ratiométricos y no requieren pasos de lavado, proporcionan una reproducibilidad mucho mejor que los enfoques tradicionales. Juntos, este conjunto de ensayos proporciona nuevas herramientas rentables para un análisis más completo de proteínas STAT fosforiladas específicas después del tratamiento celular y la detección y caracterización de moduladores específicos y selectivos de la vía de señalización JAK / STAT.
Introducción
La vía de señalización JAK/STAT juega un papel clave en la mediación de las respuestas celulares a diversas citoquinas, interferones, factores de crecimiento y moléculas relacionadas1,2. La unión de estos ligandos a receptores específicos de la superficie celular da como resultado la activación de los JAK, que a su vez activan las proteínas STAT por fosforilación de residuos específicos de tirosina. La fosforilación STAT da como resultado su dimerización y translocación en el núcleo, donde ejercen su efecto sobre la transcripción de genes diana regulados. La familia STAT consta de siete miembros: STAT1, STAT2,....
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Protocolo
1. Cultivo celular
- Mantener las células en una incubadora humidificada de 37 °C/5% de CO2 y cultivarlas con DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (células HeLa y A431) o RPMI suplementado con 15% de FBS (células U266B1). Cultive las células hasta que alcancen el 70-80% de confluencia, luego tripsinícelas y páselas o utilícelas para los ensayos.
NOTA: Los medios de cultivo contenían rojo fenol. No se realizó inanición sérica para ninguna línea celular antes de realizar los ensayos.
2. Titulación del estimulador o inhibidor utilizando el protocolo de ensayo de dos placas con células adherentes
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Resultados
Cada ensayo THUNDER TR-FRET se validó farmacológicamente mediante el tratamiento de células adherentes (HeLa o A431) o de suspensión (U266B1) con activadores o inhibidores específicos de la vía JAK/STAT y luego midiendo los niveles de STATs fosforilados y totales específicos, cuando corresponda. Los ensayos se realizaron en formato de 384 pocillos utilizando el protocolo de transferencia de dos placas y las condiciones de ensayo preoptimizadas. La Figura 3, la Figura 4
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Discusión
En comparación con los métodos convencionales para el análisis de fosfoproteínas, como el western blotting y los métodos basados en ELISA, el flujo de trabajo para un ensayo celular THUNDER TR-FRET es simple y rápido, utiliza una muestra de bajo volumen (15 μL), está diseñado para HTS en un formato de 384 pocillos y es altamente susceptible de automatización. El protocolo de ensayo es flexible y se puede adaptar fácilmente a aplicaciones de rendimiento medio y alto. Los ensayos se pueden ejecutar utilizando un protocolo .......
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Divulgaciones
Intereses contrapuestos: Jaime Padros, Mireille Caron y Geneviève Chatel son empleados de BioAuxilium Research, que fabrica los kits de ensayo THUNDER TR-FRET utilizados en este estudio. Además, Jaime Padros y Mireille Caron son accionistas de BioAuxilium Research. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de JoVE sobre el intercambio de datos y materiales.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microplaca de 96 pocillos, transparente, de fondo plano, poliestireno, tratado con cultivo de tejidos, estéril | Corning | 3595 | Esta es la placa para el cultivo de células cuando se utiliza el protocolo de ensayo de dos placas. Se pueden utilizar otras placas de cultivo celular de 96 pocillos |
| Microplaca de 384 pocillos, blanca, de bajo volumen | PerkinElmer | 6007290 | Esta es la placa para la detección de TR-FRET cuando se utilizan los protocolos de ensayo de dos o una placa. Se pueden utilizar otras placas blancas de 384 pocillos de bajo volumen |
| Línea celular A431 | ATCC | CRL-1555 | |
| Sello de microplaca adhesiva | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET es compatible con un medio de cultivo que contiene rojo fenol |
| Lector de placas multietiqueta EnVision Xcite | PerkinElmer | 2104-0020A | Los ensayos se pueden realizar en una variedad de lectores de placas equipados con la opción TR-FRET |
| Clorhidrato de erlotinib | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon Matraces tratados para cultivo de tejidos | Fisher | 13-680-65 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| Línea celular HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| Inhibidor de JAK 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Agitador de placas orbital | Muchas opciones disponibles | No aplicable | |
| EGF humano recombinante | PeproTech | AF-100-15 | |
| IFN&alfa humano recombinante; 2b | ProSpec | CYT-460 | |
| IL-4 humana recombinante | R& D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medio (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET es compatible con el medio de cultivo que contiene rojo fenol |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Kit de ensayo de señalización celular | BioAuxilium | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Kit de ensayo de señalización celular STAT3 total Investigación | BioAuxilium | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) Kit de ensayo de señalización celular TR-FRET | KIT-STAT4P-500 | ||
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Kit de ensayo de señalización celular TR-FRET STAT5 total | KIT-STAT5PT-500 | ||
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Kit de ensayo de señalización celular STAT6 TR-FRET total | KIT-STAT6PT-500 | ||
| Tripsina/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 línea celular | ATCC | TIB-196 | |
| Agua ultrapura | NA | NA | Utilice agua de grado Milli-Q (18 MΩ. cm) para diluir el tampón de lisis y el tampón de detección |
Referencias
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
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Reimpresiones y permisos
