Tidsupplösta Förster-resonansenergiöverföringsanalyser för mätning av endogena fosforylerade STAT-proteiner i humana celler

Summary

Tidsupplösta Förster-resonansenergiöverföringscellbaserade analysprotokoll beskrivs för enkel, specifik, känslig och robust kvantifiering av endogen fosforylerad signalgivare och aktivator av transkription (STAT) 1/3/4/5/6 proteiner i celllysat i ett 384-brunnsformat.

Abstract

Januskinas (JAK) / signalgivare och aktivator av transkription (STAT) signalväg spelar en avgörande roll för att förmedla cellulära svar på cytokiner och tillväxtfaktorer. STAT-proteiner aktiveras genom tyrosinfosforylering medierad huvudsakligen av JAKs. Den onormala aktiveringen av STAT-signalvägar är inblandad i många mänskliga sjukdomar, särskilt cancer och immunrelaterade tillstånd. Därför är förmågan att övervaka STAT-proteinfosforylering inom den ursprungliga cellsignalmiljön viktig för både akademisk och läkemedelsupptäcktsforskning. De traditionella analysformat som är tillgängliga för att kvantifiera fosforylerade STAT-proteiner inkluderar western blotting och den enzymbundna immunosorbentanalysen (ELISA). Dessa heterogena metoder är arbetsintensiva, låga genomströmningar och ofta inte tillförlitliga (specifika) vid västerländsk blotting. Homogena (ingen tvätt) metoder finns tillgängliga men förblir dyra.

Här tillhandahålls detaljerade protokoll för känslig, robust och kostnadseffektiv mätning i ett 384-brunnsformat av endogena nivåer av fosforylerad STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) och STAT6 (Y641) i celllysat från vidhäftande celler eller suspensionsceller med hjälp av den nya THUNDER-tidsupplösta Förster-resonansenergiöverföringsplattformen (TR-FRET). Arbetsflödet för cellanalysen är enkelt, snabbt och utformat för screening med hög genomströmning (HTS). Analysprotokollet är flexibelt, använder ett lågvolymprov (15 μL), kräver endast ett reagenstillsatssteg och kan anpassas till applikationer med låg genomströmning och hög genomströmning. Varje fosfo-STAT sandwichimmunanalys valideras under optimerade förhållanden med kända agonister och hämmare och genererar de förväntade farmakologiska och Z'-faktorvärdena. Eftersom TR-FRET-analyser är ratiometriska och inte kräver några tvättsteg, ger de mycket bättre reproducerbarhet än traditionella metoder. Tillsammans ger denna uppsättning analyser nya kostnadseffektiva verktyg för en mer omfattande analys av specifika fosforylerade STAT-proteiner efter cellbehandling och screening och karakterisering av specifika och selektiva modulatorer av JAK / STAT-signalvägen.

Introduction

JAK/STAT-signalvägen spelar en nyckelroll för att förmedla cellulära svar på olika cytokiner, interferoner, tillväxtfaktorer och relaterade ^molekyler1,2. Bindningen av dessa ligander till specifika cellytereceptorer resulterar i aktivering av JK, som i sin tur aktiverar STAT-proteiner genom fosforylering av specifika tyrosinrester. STAT fosforylering resulterar i deras dimerisering och translokation i kärnan, där de utövar sin effekt på transkriptionen av reglerade målgener. STAT-familjen består av sju medlemmar: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b och STAT6. Medlemmarna spelar en komplex och väsentlig roll i regleringen av fysiologiska cellprocesser, inklusive proliferation, differentiering, apoptos, angiogenes och immunsystemreglering. Den onormala aktiveringen av STAT-signalvägar är inblandad i många mänskliga sjukdomar, särskilt cancer och immunrelaterade ^{tillstånd3,4}. Därför är förmågan att bedöma STAT-proteinfosforylering inom den ursprungliga cellsignalmiljön viktig för både akademisk och läkemedelsupptäcktsforskning.

Hittills är de konventionella metoderna som används för att mäta intracellulära fosforylerade proteinnivåer, inklusive STATs, antikroppsbaserade och inkluderar western blotting, ELISA och fosfoflödescytometri. Dessa heterogena metoder är arbetsintensiva, tidskrävande, felbenägna, låga genomströmningar och ofta opålitliga (t.ex. specificitetsproblem) när det gäller western ^blotting5. Däremot kräver homogena analyser färre experimentella steg, använder mindre provvolymer och är mottagliga för HTS. Det finns fem homogena cellbaserade immunanalysplattformar kommersiellt tillgängliga som kan användas för att kvantitativt övervaka JAK-beroende fosforylering av STAT i celllysat: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen och Lumit. Var och en av dessa plattformar har sina fördelar och nackdelar.

SureFire är baserad på självlysande syrekanaliseringsteknik, som använder givar- och acceptorpärlor belagda för att specifikt fånga ett par antikroppar, varav en är biotinylerad. I närvaro av fosforylerat protein för de två antikropparna donator- och acceptorspärlorna i närheten, vilket möjliggör generering av en kemiluminescerande ^signal6. Även om den är mångsidig och känslig är denna teknik dyr, påverkas av biotin i odlingsmediet, är mycket känslig för omgivningstemperatur och ljus och kräver en speciell läsare för detektion. HTRF och LANCE är båda baserade på TR-FRET-teknik som använder självlysande lantanidjonkomplex med lång livslängd (Europium- eller Terbiumkelater eller Europiumkryptat) som givarmolekyler och långröda fluoroforer som acceptormolekyler7. När två proteinspecifika antikroppar märkta med antingen givar- eller acceptormolekyler förs i närheten sker FRET, vilket orsakar en ökning av acceptorfluorescensen och en minskning av givarfluorescensen. Dessa långlivade fluorescerande signaler kan mätas på ett tidsupplöst och förhållandemetriskt sätt för att minska analysstörningar och öka datakvaliteten. Andra fördelar med TR-FRET är att den inte är ljuskänslig, tillåter upprepade avläsningar och uppvisar lång signalstabilitet. Medan TR-FRET implementeras i stor utsträckning i HTS på grund av dess mångsidighet, känslighet och höga robusthet, är alla kommersiella TR-FRET-baserade analysplattformar dyra, vilket hindrar dess breda antagande i akademiska och små industriella laboratorier. LanthaScreen-analysen använder också en TR-FRET-baserad avläsning men är beroende av en konstruerad U2OS-cellinje som stabilt uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) -STAT1-fusionsprotein kombinerat med en terbiummärkt fosfospecifik STAT1-antikropp8. Förutom att vara begränsad när det gäller val av signalproteiner, kräver denna metod att man köper dyra transfekterade cellinjer, vilket minskar dess tillämplighet och ökar möjligheten till experimentella artefakter. Lumit är en generisk bioluminescerande immunanalysplattform som använder sekundära antikroppar (anti-mus och anti-kanin) kemiskt märkta med de små och stora NanoBit-underenheterna av NanoLuc ^Luciferase9. Bindningen av två primära antikroppar till målproteinet ger de sekundära antikropparna i närheten för att bilda ett aktivt enzym som genererar en luminescenssignal. Medan luminescens i allmänhet är en känslig och robust avläsning, begränsar kravet på primära antikroppar som höjs i två olika arter valen för analysdesign. Dessutom kan användningen av sekundära antikroppar i komplexa provmatriser vara benägen att analysera interferens.

Således finns det fortfarande ett behov av en tillförlitlig, snabb men ändå prisvärd cellbaserad analysplattform för mätning av enskilda fosforylerade och totala STAT-proteiner på ett sätt som är kompatibelt med HTS. För att tillgodose detta behov utvecklades en ny cellbaserad immunanalysplattform med hög genomströmning baserad på en förbättrad TR-FRET-teknik (THUNDER) och utformad för att möjliggöra enkel, känslig, robust och kostnadseffektiv mätning av endogent uttryckta intracellulära proteiner (fosforylerade eller totala) i celllysater. Fördelarna med denna teknik härrör från kombinationen av ett givare / acceptor FRET-par som uppvisar exceptionell spektral kompatibilitet och TR-FRET-signal, noggrant validerade antikroppar och optimerade lysbuffertar. Dessa analyser är formaterade som sandwichimmunanalyser och använder ett enkelt, trestegs arbetsflöde (figur 1). Celler behandlas först för att modulera proteinfosforylering och lyseras sedan med den specifika lysbufferten som tillhandahålls i satsen. Det fosforylerade eller totala STAT-proteinet i celllysatet detekteras i ett enda reagenstillsats- och inkubationssteg med ett par fluoroformärkta antikroppar som känner igen distinkta epitoper på målproteinet (Figur 2). En antikropp är märkt med en Europiumkelatdonator (Eu-Ab1), medan den andra antikroppen är märkt med en långröd acceptorfluorofor (FR-Ab2). De två märkta antikropparna binder till proteinet i lösning, vilket ger de två etiketterna i närheten. Excitation av givaren Europiumkelat vid 320 eller 340 nm utlöser en FRET till acceptorn, som avger en långlivad TR-FRET-signal vid 665 nm proportionell mot koncentrationen av målprotein (fosforylerat eller totalt) i celllysatet.

Bild 1: Arbetsflöde för TR-FRET-analys. Arbetsflödet består av tre steg: cellbehandling, celllys och proteindetektion med TR-FRET. I analysprotokollet med två plattor överförs lysater till en vit 384-brunnsdetekteringsplatta, medan i enplattprotokollet utförs alla steg i samma vita 384-brunnsdetekteringsplatta (allt-i-ett-brunnsprotokoll). Oavsett vilket analysprotokoll som används utförs proteindetektion i samma totala volym (20 μL per brunn). Förkortning: TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: TR-FRET sandwich immunanalys princip. En antikropp är märkt med Europiumkelatdonatorn (Eu-Ab1) och den andra med den långröda lilla fluoroforacceptoren (FR-Ab2). De två märkta antikropparna binder specifikt till distinkta epitoper på målproteinet (fosforylerat eller totalt) i celllysatet, vilket leder de två fluoroforerna i närheten. Excitation av givaren Europiumkelat vid 320 eller 340 nm utlöser en FRET från givaren till acceptormolekylerna, som i sin tur avger en signal vid 665 nm. Denna signal är proportionell mot koncentrationen av protein i celllysatet. I avsaknad av det specifika målproteinet är donatorn och acceptorfluoroforerna för avlägsna från varandra för att FRET ska uppstå. Förkortningar: FRET = Förster resonansenergiöverföring; TR-FRET = tidsupplöst FRET; Ab = antikropp; FR = långröd; Eu - Europiumkelat; P = fosforylering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Här tillhandahålls detaljerade protokoll för mätning, i ett 384-brunnsformat, de intracellulära nivåerna av fosforylerad STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/ Y699) och STAT6 (Y641), tillsammans med totala STAT1, STAT3, STAT5 och STAT6, i celllysater från vidhäftande eller suspensionsceller med hjälp av THUNDER TR-FRET-plattformen. Dessa protokoll definierar steg för cellbehandling, lys och TR-FRET-baserad målproteindetektering med hjälp av antingen ett överföringsprotokoll med två plattor eller ett all-in-one-well-protokoll med en platta. Dessa cellbaserade analyser används för att bestämma den farmakologiska profilen för kända aktivatorer och hämmare av JAK/STAT-vägen. Robustheten och lämpligheten hos utvalda analyser för HTS demonstreras. Slutligen diskuteras viktiga experiment för analysoptimering, tillsammans med rekommendationer för felsökning av analyser.

Protocol

1. Cellodling

1. Behåll celler i en fuktad 37 ° C / 5% _{CO2-inkubator} och kultur med antingen DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) (HeLa- och A431-celler) eller RPMI kompletterat med 15% FBS (U266B1-celler). Odla cellerna tills de når 70-80% sammanflöde, försök sedanpsinisera dem och passera eller använd dem för analyserna.
   OBS: Kulturmedia innehöll fenolrött. Ingen serumsvält utfördes för någon cellinje innan analyserna genomfördes.

2. Stimulator- eller hämmartitrering med användning av tvåplattanalysprotokollet med vidhäftande celler

OBS: Denna procedur beskriver hur man bestämmer stimulator- eller hämmarpotenser genom att generera en koncentrations-responskurva från en utspädningsserie av testföreningen.

1. Cell sådd
   1. Dispensera 50 μL celler vid den föroptimerade densiteten (40 000 HeLa-celler/brunn för både STAT3 och STAT6; 75 000 A431-celler/brunn för STAT5) till en 96-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta i lämpligt odlingsmedium. Inkubera över natten vid 37 ° C / 5% _CO2.
      OBS: Optimal celldensitet och odling inkubationstid måste bestämmas.
2. Utspädningar av testföreningar
   1. Förbered mellanliggande 2x utspädningsserier av testföreningar genom seriell utspädning av föreningar (halvstocksintervallutspädningar) över 12 brunnar av en polypropen 96-brunnsplatta till serumfritt medium.
      OBS: Det rekommenderas att genomföra en 12-punkts halvloggintervallkoncentrationsresponskurva i minst två exemplar för en exakt uppskattning av _EC50 eller _IC50.
   2. Alternativt, för hydrofoba, dimetylsulfoxid (DMSO)-lösliga testföreningar, utför de initiala utspädningarna i 100% DMSO och späd sedan den sammansatta utspädningsserien till serumfritt medium.
      OBS: Analystoleransen mot DMSO måste fastställas innan en testföreningstitrering genomförs i DMSO-fordon. Det är viktigt att hålla lika lösningsmedelskoncentrationer mellan behandlade och obehandlade celler. Vid testning av seriella utspädningar av föreningar bör lösningsmedelskoncentrationerna dessutom alltid förbli konstanta i hela utspädningsserien.
3. Cellbehandling
   1. För cellstimulering, tillsätt 50 μL serumfritt medium ensamt (obehandlade celler) eller innehållande stimulatorn (2x).
   2. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen rumstemperatur (RT) eller 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min vid RT för STAT3; epidermal tillväxtfaktor (EGF)/10 min vid RT för STAT5; interleukin (IL)-4/20 min vid RT för STAT6). Fortsätt sedan till avsnitt 2.4.
      OBS: Optimal inkubationstemperatur måste bestämmas.
   3. För cellhämning, tillsätt 25 μL serumfritt medium ensamt (obehandlade celler) eller innehållande hämmaren (4x).
   4. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen RT eller 37 °C (JAK-hämmare 1/30 min vid RT för STAT3 och STAT6; Erlotinib/15 min vid RT för STAT5).
   5. Tillsätt 25 μL serumfritt medium ensamt (obehandlade celler) eller innehållande stimulatorn (4x) vid _EC80.
   6. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen RT eller 37 °C (samma villkor som för steg 2.3.2).
4. Celllys
   1. Förbered satsens specifika 1x kompletterade lysisbuffert enligt tillverkarens anvisningar.
      OBS: Det är obligatoriskt att komplettera 1x Lysis Buffer med 100x fosfatashämmare Cocktail utspädd till en slutlig koncentration av 1x. Den 1x kompletterade lysbufferten innehåller 1 mM natriumfluorid, 2 mM natriumortovanadat och 2 mM beta-glycerofosfat. Andra fosfatashämmare krävs inte och bör undvikas. Lysisbuffertar och andra fosfatashämmare än de som ingår i satsen rekommenderas inte eftersom de kan innehålla ingredienser som kan störa mätningen.
   2. Ta försiktigt bort och kassera cellodlingsmediet genom att aspirera supernatanten.
   3. Tillsätt omedelbart 50 μL 1x kompletterad lysbuffert.
      OBS: Lysis buffertvolym (25-50 μL) kan optimeras.
   4. Inkubera i 30 min vid RT under skakning (orbital plattskakare inställd på 400 rpm; måttlig omrörning).
      OBS: Lysis inkubationstid (30-60 min) kan optimeras. Lysater kan användas omedelbart för målproteindetektering eller frysas vid -80 ° C.
5. TR-FRET-detektering
   1. Förbered 4x Antibody Detection Mix i 1x Detection Buffer som anges av tillverkaren.
   2. I detta överföringssteg pipetterar du försiktigt 15 μL celllysat från 96-brunnsodlingsplattan till en brunn av en vit, lågvolym 384-brunns mikroplatta.
   3. Tillsätt 15 μL av positive control lysate och 15 μL av 1x lysbuffert (negativ kontroll) för att separera analysbrunnar.
   4. Tillsätt 5 μL 4x antikroppsdetektionsblandning (antingen Eu-Ab1/FR-Ab2 för detektion av fosfoproteinet eller Eu-Ab3/FR-Ab4 för detektion av det totala proteinet) till var och en av analysbrunnarna.
   5. Täck plattan med en plattförseglare och inkubera i 1 timme fram till över natten vid RT, beroende på analysen (se motsvarande tekniska datablad).
      OBS: Optimal lästid måste optimeras för varje analys och cellinje. Plattan kan läsas flera gånger utan negativ effekt på analysprestandan.
   6. Ta bort den självhäftande plattförseglingen och läs av plattan på en TR-FRET-kompatibel mikroplattläsare.
      OBS: Filterbaserade fluorometrar rekommenderas, även om vissa monokromatorinstrument kan användas. Kontrollera att lämplig optisk modul (filter och spegel) för TR-FRET är installerad. Använd en excitationsvåglängd på 320 eller 340 nm för att excitera Europiumkelatet. Läs analyser vid både 615 nm (eller 620 nm) och 665 nm för att detektera både utsläppet från givaren Europium respektive acceptorfluoroforen. Instrumentinställningarna beror på den specifika läsaren. Data som presenteras här erhölls med hjälp av lampbaserad excitation, 90 μs fördröjning, 300 μs integrationstid och 100 blixtar per brunn. Fosfo-STAT4-analysen lästes emellertid med laser excitation för att generera högre signal-till-bakgrundsförhållanden (S / B).

3. Stimulator- eller hämmartitrering med användning av tvåplattanalysprotokollet med suspensionsceller

1. Utspädning av testföreningar
   1. Förbered mellanliggande 2x utspädningsserier av testföreningar enligt beskrivningen i steg 2.2.1 och 2.2.2.
2. Cellsädning och behandling
   1. Dispensera 20 μL celler vid den föroptimerade densiteten (200 000 U266B1-celler/brunn för STAT1; 400 000 U266B1-celler/brunn för STAT4) till en 96-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta i lämpligt odlingsmedium. Fortsätt direkt till cellbehandling eller inkubera 2-4 timmar vid 37 ° C, 5% _CO2.
      OBS: Detta steg måste optimeras för olika celltyper.
   2. För cellstimulering, tillsätt 20 μL serumfritt medium ensamt (obehandlade celler) eller innehållande stimulatorn (2x).
   3. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen RT eller 37 °C (IFNα2b/15 min vid RT för STAT1. IFNα2b/25 min vid 37 °C för STAT4). Fortsätt sedan till avsnitt 3.3.
      OBS: Optimal inkubationstemperatur måste bestämmas.
   4. För cellhämning, tillsätt 10 μL serumfritt medium ensamt (obehandlade celler) eller innehållande hämmaren (4x).
   5. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen RT eller 37 °C (JAK-hämmare 1/30 min vid RT för STAT1 och STAT4).
   6. Tillsätt 10 μL enbart serumfritt medium (obehandlade celler) eller innehållande stimulatorn (4x) vid _EC80.
   7. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen RT eller 37 °C (samma villkor som för steg 3.2.3).
3. Celllys
   1. Förbered satsens specifika 5x kompletterade lysisbuffert enligt tillverkarens anvisningar.
      OBS: Det är obligatoriskt att komplettera 5x Lysis Buffer med 100x fosfatashämmare Cocktail utspädd till en slutlig koncentration av 5x. 5x kompletterad lysisbuffert innehåller 5 mM natriumfluorid, 10 mM natriumortovanadat och 10 mM beta-glycerofosfat. Andra fosfatashämmare krävs inte och bör undvikas.
   2. Tillsätt 10 μL 5x kompletterad lysbuffert.
   3. Inkubera i 30 min vid RT under skakning (orbital plattskakare inställd på 400 rpm; måttlig omrörning).
      OBS: Lysis inkubationstid (30-60 min) kan optimeras. Lysater kan användas omedelbart för målproteindetektering eller frysas vid -80 ° C.
4. TR-FRET-detektering
   1. Efter celllys, utför TR-FRET-detektionssteget enligt beskrivningen i avsnitt 2.5 för 2-plattanalysprotokollet för vidhäftande celler.

4. Stimulatortitrering med användning av analysprotokollet med en platta med vidhäftande celler eller suspensionsceller

1. Utspädning av testföreningar
   1. Förbered mellanliggande utspädningsserier av testföreningar vid 3x genom seriell utspädning av föreningar (halvstocksintervallutspädningar) över 12 brunnar av en polypropen 96-brunnsplatta till serumfritt medium.
2. Cellsädning och behandling
   1. Dispensera 8 μL celler vid den föroptimerade densiteten (160 000 U266B1-celler/brunn för STAT4; 80 000 HeLa-celler/brunn för STAT6), i lämpligt serumfritt odlingsmedium, till en vit 384-brunnsanalysplatta med låg volym. Fortsätt direkt till cellbehandling eller inkubera 2-4 timmar vid 37 ° C, 5% _CO2.
      OBS: Kravet på en cellodlingsinkubationsperiod före behandling måste bestämmas för olika celltyper.
   2. För cellstimulering, tillsätt 4 μL serumfritt medium ensamt (obehandlade celler) eller innehållande stimulatorn (3x).
   3. Inkubera för den föroptimerade tiden vid antingen rumstemperatur eller 37 °C (IFNα2b/25 min vid 37 °C för STAT4). IL-4/20 min vid 37 °C för STAT6). Fortsätt sedan till avsnitt 4.3.
3. Celllys
   1. Förbered satsens specifika 5x kompletterade lysisbuffert enligt tillverkarens anvisningar.
      OBS: Det är obligatoriskt att komplettera 5x Lysis Buffer med 100x fosfatashämmare Cocktail utspädd till en slutlig koncentration av 5x.
   2. Tillsätt 3 μL 5x kompletterad lysbuffert.
   3. Inkubera i 30 min vid RT under skakning (orbital plate shaker vid 400 rpm).
      OBS: Lysis inkubationstid (30-60 min) kan optimeras. Lysater kan användas omedelbart eller frysas vid 80 °C.
4. TR-FRET-detektering
   1. Tillsätt 15 μL positivt kontrolllysat (outspätt) och 15 μL 1x kompletterad lysbuffert (negativ kontroll) för att separera analysbrunnar.
   2. Tillsätt 5 μL 4x antikroppsdetektionsblandning (antingen Eu-Ab1/FR-Ab2 för fosfoproteinet eller Eu-Ab3-/FR-Ab4 för det totala proteinet) framställd i 1x detektionsbuffert till var och en av analysbrunnarna.
   3. Täck plattan med en plattförseglare och inkubera i 1 timme fram till över natten vid RT, beroende på analysen.
      OBS: Optimal lästid måste optimeras för varje analys och cellinje. Plattan kan läsas flera gånger utan negativ effekt på analysprestandan.
   4. Ta bort den självhäftande plattförseglingen. Läs plattan på en TR-FRET-kompatibel mikroplattläsare.

5. Analys av data

1. Beräkna TR-FRET-förhållandet för varje brunn med följande formel (1):
   (1)
   OBS: Eftersom TR-FRET-signalen läses i ett tidsupplöst läge är bakgrundssubtraktion vanligtvis inte nödvändig. Om bakgrundssubtraktion utförs, använd de cellfria brunnarna som innehåller 1x Kompletterad Lysis Buffer (negativ kontroll) för bakgrundssubtraktion. Bestäm det genomsnittliga TR-FRET-förhållandet från de cellfria brunnarna och subtrahera sedan detta värde från TR-FRET-förhållandet för varje brunn.
2. För koncentrations-responskurvor, analysera data enligt en icke-linjär regression med hjälp av den logistiska ekvationen med 4 parametrar (sigmoidal dos-responskurva med variabel lutning) och en 1/^Y2 dataviktning för att generera _EC50 - eller _IC50-värden .
3. För Z-faktorexperimentet, analysera data enligt följande formel (2)¹⁰
   (2)
   Där μ och σ medelvärdena och standardavvikelserna för positiv kontroll (p; stimulerade celler) respektive negativ kontroll (n; obehandlade celler).

Representative Results

Varje THUNDER TR-FRET-analys validerades farmakologiskt genom att behandla vidhäftande (HeLa eller A431) eller suspensionsceller (U266B1) med JAK/STAT-vägspecifika aktivatorer eller hämmare och sedan mäta nivåerna av specifika fosforylerade och totala STATs, i förekommande fall. Analyser utfördes i 384-brunnsformat med användning av överföringsprotokollet med två plattor och föroptimerade analysförhållanden. Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 och figur 7 sammanfattar representativa koncentrations-responskurvor som erhållits för alla STAT-analyser. Sammantaget visade alla stimulator- och hämmarkoncentrations-responskurvor för fosfo-STAT-analyserna robusta TR-FRET-signaler, breda dynamiska områden, låg variationskoefficient mellan brunnarna (vanligtvis ≤5%) och acceptabla S / B-förhållanden. De _EC50 - och _IC50-värden som rapporteras här ligger inom intervallet för förväntade värden.

Behandling av celler med JAK-aktivatorerna IFNα2b (fosfo-STAT1, fosfo-STAT3 och fosfo-STAT4), IL-4 (fosfo-STAT6) och EGF (fosfo-STAT5) visade den förväntade koncentrationsberoende ökningen av STAT-fosforylering vid specifika tyrosinrester, medan motsvarande totala STAT-proteiner (STAT1, STAT3, STAT5 och STAT6) förblev stabila (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 och figur 7 , Panel A). Signalminskningen (mindre än 20%) observerad för total STAT5 med ökande STAT5-fosforylering förväntas och beror på steriskt hinder, där fosforylering av STAT5 hindrar bindningen av en av de två anti-totala STAT5-antikropparna till dess respektive antigen. _{EC50-värdena} låg i det subnanomolära intervallet för IFNα2b och IL-4 (0,083 till 0,47 nM) och i det låga nanomolära intervallet för EGF (12 nM). Dessa värden är i överensstämmelse med publicerade ^data6,11.

För att bekräfta att signalen inducerad av aktivatorerna medierades genom aktivering av endogena receptorer, förbehandlades cellerna med ökande koncentrationer av antingen JAK-hämmare 1 (en pan JAK-hämmare) eller Erlotinib (en EGFR-tyrosinkinashämmare) före submaximal stimulering (_EC80) med STAT-aktivatorerna. Som förväntat hämmade både JAK-hämmare 1 och Erlotinib motsvarande fosfo-STAT-nivåer på ett koncentrationsberoende sätt, med _IC50-värden som sträckte sig mellan det låga nanomolära och det höga nanomolära intervallet för JAK-hämmare 1 (29-759 nM) och i det låga nanomolära intervallet för Erlotinib (10 nM) (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 och figur 7, Panel B). _{IC50-värdena} överensstämmer med publicerade ^data11,12,13. Som var fallet för stimuleringsexperiment påverkades inte nivåerna av motsvarande totala STAT av någon av behandlingarna. Sammantaget visar dessa resultat specificiteten hos varje analys för dess endogena mål-STAT-protein (fosforylerat eller totalt) och deras förmåga att profilera aktivatorer eller hämmare som uppvisar en rad potenser.

Analyser där hela arbetsflödet (cellbehandling, lys och proteindetektion) utförs i en enda brunn på en 384-brunnsplatta utan överföringssteg är mer lämpade för HTS. Följaktligen utfördes fosfo-STAT4- och fosfo-STAT6-analyserna med användning av enplattprotokollet. Representativa data som erhållits under optimerade förhållanden sammanfattas i figur 8 och figur 9. Stimulering av antingen fosforylerad STAT4 med IFNα2b i en suspensionscellinje (U266B1; Figur 8) eller fosforylerad STAT6 med IL-4 i en vidhäftande cellinje (HeLa; Figur 9) erhölls med acceptabla S/B-förhållanden och _EC50-värden som överensstämde med dem som erhölls med hjälp av tvåplatteprotokollet. Dessa data visar att fosfo-STAT-analyserna framgångsrikt kan anpassas från ett överföringsprotokoll med två plattor till ett all-in-one-well-protokoll med en platta.

Z'-faktorn används ofta i HTS-samhället för utvärdering av lämpligheten och robustheten hos en analys för ^HTS10. För att ytterligare validera fosfo-STAT-analyserna genomfördes preliminära Z'-faktorstudier manuellt med hjälp av tvåplatteprotokollet. För att bedöma analysstabiliteten lästes plattorna efter både en 4-timmars inkubation och en inkubation över natten. Resultat erhållna för fosfo-STAT1- och fosfo-STAT3-analyserna, med användning av en suspensionscellinje (U266B1) respektive en vidhäftande cellinje (HeLa), sammanfattas i figur 10. Beräknade Z′-faktorvärden var 0,85 för fosfo-STAT1 och 0,79 för fosfo-STAT3. Efter inkubation över natten förblev Z'-faktorvärdena stabila (0,83 för fosfo-STAT1 och 0,78 för fosfo-STAT3). Liknande Z'-faktorvärden erhölls för de andra fosfo-STAT-analyserna (STAT4: 0,79; STAT5: 0,78; STAT6: 0,63). En cellbaserad analys med en Z'-faktor ≥ 0,40 anses lämplig för ^HTS15. Följaktligen visar dessa resultat robustheten hos dessa fosfo-STAT-analyser för HTS-applikationer.

Figur 3: Detektion av fosfo-STAT1 (Y701) modulering i U266B1-celler. Celler (200 000 celler/brunn) sådda i en odlingsplatta med 96 brunnar behandlades med ökande koncentrationer av antingen (A) IFNα2b i 15 min vid RT eller (B) JAK-hämmare 1 i 30 min vid RT, därefter med 1 nM (_EC80) ifnα2b i 15 min vid RT. Efter lys överfördes lysater till en lågvolym 384-brunn vit platta, följt av tillsatsen av antikroppsdetektionsblandningen. Plattan inkuberades i 4 timmar vid RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IFN = interferon; RT = rumstemperatur; JAK = Januskinas; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Detektion av fosfo-STAT3 (Y705) och total STAT3-modulering i HeLa-celler. Celler (40 000 celler/brunn) odlade över natten i en odlingsplatta med 96 brunnar behandlades med ökande koncentrationer av antingen (A) IFNα2b i 20 min vid RT eller (B) JAK-hämmare 1 i 30 min vid RT och sedan med 1,5 nM IFNα2b i 20 min vid RT. Efter avlägsnande och lys av media överfördes lysater till en vit platta med låg volym 384 brunnar, följt av tillsatsen av antikroppsdetektionsblandningen. Plattan inkuberades i 4 timmar vid RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IFN = interferon; RT = rumstemperatur; JAK = Januskinas; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Detektion av fosfo-STAT4 (Y693) modulering i U266B1-celler. Celler (400 000 celler/brunn) sådda i en odlingsplatta med 96 brunnar behandlades med ökande koncentrationer av antingen (A) IFNα2b i 25 min vid 37 °C eller (B) JAK-hämmare 1 i 30 min vid RT, därefter med 1 nM IFNα2b i 25 min vid 37 °C. Efter avlägsnande och lys av media överfördes lysater till en vit platta med låg volym 384 brunnar, följt av tillsatsen av antikroppsdetektionsblandningen. Plattan inkuberades över natten på RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IFN = interferon; RT = rumstemperatur; JAK = Januskinas; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Detektion av fosfo-STAT5 (Y694/Y699) och total STAT5-modulering i A431-celler. Celler (75 000 celler/brunnar) odlade över natten i en odlingsplatta med 96 brunnar behandlades med ökande koncentrationer av antingen (A) EGF i 10 min vid RT eller (B) Erlotinib i 15 min vid RT, därefter med 73 nM EGF i 10 min vid RT. Efter avlägsnande och lys av media överfördes lysater till en vit platta med låg volym 384 brunnar, följt av tillsatsen av antikroppsdetektionsblandningen. Plattan inkuberades över natten på RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; EGF = epidermal tillväxtfaktor, RT = rumstemperatur; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Detektion av fosfo-STAT6 (Y641) och total STAT6-modulering i HeLa-celler. Celler (40 000 celler/brunn) odlade över natten i en odlingsplatta med 96 brunnar behandlades med ökande koncentrationer av antingen (A) IL-4 i 20 min vid RT eller (B) JAK-hämmare 1 i 30 min vid RT, sedan med 0,5 nM IL4 i 20 min vid RT. Efter avlägsnande och lys av media överfördes lysater till en vit platta med låg volym 384 brunnar, följt av tillsatsen av antikroppsdetektionsblandningen. Plattan inkuberades i 4 timmar vid RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IL = interleukin; JAK = Januskinas; RT = rumstemperatur; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: Detektion av fosfo-STAT4 (Y693) stimulering i U266B1-celler med enplatteprotokollet. Celler (160 000 celler/brunn) sådda i en låg volym 384-brunns vit platta behandlades omedelbart med ökande koncentrationer av IFNα2b i 25 minuter vid 37 °C. Efter lys tillsattes antikroppsdetektionsblandningen direkt till lysatet. Plattan inkuberades över natten vid RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare med hjälp av en blixtlampa eller laserutplåning. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IFN = interferon; RT = rumstemperatur; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 9: Detektion av fosfo-STAT6 (Y641) stimulering i HeLa-celler med enplatteprotokollet. Celler (80 000 celler/brunn) sådda i en lågvolym 384-brunns vit platta behandlades omedelbart med ökande koncentrationer av IL-4 i 20 minuter vid RT. Efter lys tillsattes antikroppsdetektionsblandningen direkt till lysatet. Plattan inkuberades 4 timmar vid RT och lästes sedan på en TR-FRET-kompatibel läsare. Data visas som medelvärdet av tredubbla brunnar per analyspunkt. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Vissa felstaplar är mindre än symbolstorleken. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IL = interleukin; RT = rumstemperatur; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S / B = signal / bakgrundsförhållande. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 10: Intraplate variability study of the phospho-STAT1 (Y701) and phospho-STAT3 (Y705) assays. (A) Phospho-STAT1 assay: suspensionsceller (200 000 U266B1-celler/brunn) behandlades antingen med 10 nM IFNα2b i 15 min eller serumfritt medium ensamt (låga kontroller). (B) Fosfo-STAT3-analys: vidhäftande celler (20 000 HeLa-celler/brunn) behandlades antingen med 5 nM IFNα2b i 20 minuter eller med enbart serumfritt medium. För båda analyserna avlästes TR-FRET-signalen efter 4 timmars inkubation. Förkortningar: STAT = signalgivare och aktivator för transkription; IFN = interferon; TR-FRET = tidsupplöst Förster-resonansenergiöverföring; S/B = signal/bakgrundsförhållande; CV = variationskoefficient. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Jämfört med konventionella metoder för fosfoproteinanalys såsom western blotting och ELISA-baserade metoder är arbetsflödet för en THUNDER TR-FRET-cellulär analys enkel och snabb, använder ett lågvolymprov (15 μL), är utformat för HTS i ett 384-brunnsformat och är mycket mottagligt för automatisering. Analysprotokollet är flexibelt och kan enkelt anpassas till både medel- och högflödesapplikationer. Analyser kan köras med antingen ett överföringsprotokoll med två plattor eller ett protokoll med en 384-brunnsplatta. I överföringsprotokollet med två plattor sås, behandlas och lyseras celler i en cellodlingsplatta, och lysater överförs därefter till en separat vit detektionsplatta (halvområde 96-brunn eller 384-brunnsplatta) för analys. I ett plattprotokoll med en 384 brunn utförs hela arbetsflödet i samma brunn, vilket eliminerar behovet av ett vätskeöverföringssteg. Analyserna kunde enkelt anpassas till 1536-brunnsformatet genom att minska volymen proportionellt. Oavsett analysprotokollet finns det bara tre reagenslösningar att förbereda och inga tvättsteg, och analyserna kan köras enligt ett "endast tilläggsprotokoll", vilket kräver minimal praktisk tid.

Ett kritiskt steg i utförandet av en cellbaserad analys är optimering av cellodling och ^{behandlingsförhållanden16}. Både cellnummer och behandlingsförhållanden kräver noggrann optimering innan en analys körs, eftersom dessa nyckelparametrar ofta varierar för varje cellinje och varje fosfoprotein. Optimeringen av dessa parametrar gör det möjligt att maximera analysfönstret, uppnå en optimal prestanda med ett högt S / B-förhållande och låg variationskoefficient mellan brunnarna och säkerställa resultatens robusthet och reproducerbarhet. Cellantal, serumsvält (i förekommande fall) och stimulerings- eller hämningstid (vid antingen rumstemperatur eller 37 °C) bör optimeras för varje cellinje och målprotein. För höga eller för låga celltal kan negativt påverka moduleringen av intracellulära signalvägar. Cellsädesdensiteter på 40 000-80 000 celler / brunn för vidhäftande celler eller 100 000-200 000 celler / brunn för suspensionsceller är allmänt acceptabla för de flesta cellinjer. Observera att den optimala tiden för stimulering och hämning kan variera mycket mellan cellinjer och målproteiner, från några minuter till flera timmar. Som sådan rekommenderas en tidskursstudie starkt för att bestämma de optimala inkubationstiderna för stimulering och hämning, helst vid både rumstemperatur och 37 ° C, eftersom inkubationstemperaturen påverkar kinetiken för målproteinstimulering.

Felsökning av en cellbaserad analys kan vara svårt och tidskrävande på grund av de många steg som är involverade i arbetsflödet (cellodling, cellbehandling, lys och proteindetektering). Dessa analyssatser inkluderar ett positivt kontrolllysat. Det rekommenderas att använda dessa positiva kontrolllysater och negativ kontroll (1x kompletterad Lysis Buffer ensam) i varje experiment. Användningen av korrekta kontroller underlättar felsökning, eftersom problem då snabbt kan hänföras till antingen detektionssteget (felaktig reagensberedning och / eller analysutförande) eller kvaliteten på de lysater som används i experimentet. Det senare beror i allmänhet på användningen av suboptimala cellulära förhållanden.

En ytterligare fördel med denna plattform är tillgången till en serie optimerade lysbuffertar med olika strängheter. Detta möjliggör generering av mer eller mindre heterogena lysater från partiell subcellulär fraktionering. Detta är användbart eftersom signalproteiner finns i olika intracellulära fack, och vissa, som STAT-proteiner, pendlar mellan fack (t.ex. mellan cytoplasman och kärnan). Observera att fosforylerad och total STAT1 använder lysbuffert 1 eftersom de inte kan detekteras väl med lysbufferten 2 som används för de andra STAT-proteinerna. Däremot förlitar sig andra homogena metoder på en enda "universell" lysbuffert, som genererar ett mer komplext prov som kan skapa icke-specifika interaktioner med antikropparna. Användningen av olika lysbuffertar kan emellertid utesluta analys av flera signalproteiner från ett enda lysatprov. Ändå kan man fortfarande testa lysater genererade med olika lysbuffertar samtidigt på en enda platta för parallell väganalys.

Sammanfattningsvis erbjuder de metoder som presenteras här baserade på denna homogena TR-FRET-cellulära immunanalysplattform ett alternativ med hög genomströmning för övervakning av JAK/STAT-signalering via detektion och kvantifiering av endogena fosforylerade STAT1/3/4/5/6-proteiner, tillsammans med totala STAT1/3/5/6, i celllysat. Dessa analyser ger nya verktyg för en mer omfattande analys av specifika STAT-proteiner efter cellbehandling och screening och karakterisering av specifika och selektiva modulatorer av JAK/STAT-signalvägarna. Med tanke på dess enkelhet, specificitet, känslighet, reproducerbarhet och kostnadseffektivitet representerar denna nya analysplattform ett attraktivt alternativ till traditionella immunanalyser, både i en akademisk miljö och i industriella laboratorier för HTS-applikationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile	Corning	3595	This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used
384-well microplate, white, low-volume	PerkinElmer	6007290	This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used
A431 cell line	ATCC	CRL-1555
Adhesive microplate seal	PerkinElmer	6050185
DMSO	Fisher	D159-4
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Wisent	319-005-CL	THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
EnVision Xcite Multilabel plate reader	PerkinElmer	2104-0020A	The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option
Erlotinib hydrochloride	Sigma	CDS022564
Falcon tissue culture treated flasks	Fisher	13-680-65
Fetal bovine serum (FBS)	Wisent	098-150
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
JAK Inhibitor 1	Cayman Chemical	15146
Orbital plate shaker	Many options available	Not applicable
Recombinant human EGF	PeproTech	AF-100-15
Recombinant human IFNα2b	ProSpec	CYT-460
Recombinant human IL-4	R&D Systems	204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Wisent	350-007-CL	THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0.05%	Wisent	325-542-CL
U266B1 cell line	ATCC	TIB-196
Ultrapure water	NA	NA	Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer