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Neuroscience

Le modèle de rat 6-hydroxydopamine de la maladie de Parkinson

Published: October 27, 2021 doi: 10.3791/62923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Summary

Le modèle de la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) est utilisé depuis des décennies pour faire progresser la compréhension de la maladie de Parkinson. Dans ce protocole, nous montrons comment effectuer des lésions nigrostriatales unilatérales chez le rat en injectant du 6-OHDA dans le faisceau médian du cerveau antérieur, évaluer les déficits moteurs et prédire les lésions à l’aide du test de pas.

Abstract

Les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson (MP) - bradykinésie, akinésie et tremblement au repos - sont des conséquences de la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNc) et du déficit striatal dopaminergique. Les modèles animaux ont été largement utilisés pour simuler la pathologie humaine en laboratoire. Les rongeurs sont les modèles animaux les plus utilisés pour la MP en raison de leur facilité de manipulation et d’entretien. De plus, l’anatomie et les mécanismes moléculaires, cellulaires et pharmacologiques de la MP sont similaires chez les rongeurs et les humains. L’infusion de la neurotoxine, la 6-hydroxydopamine (6-OHDA), dans un faisceau médian du cerveau antérieur (MFB) de rats reproduit la destruction sévère des neurones dopaminergiques et simule les symptômes de la MP. Ce protocole montre comment effectuer la micro-injection unilatérale de 6-OHDA dans le MFB dans un modèle de de rat et montre les déficits moteurs induits par le 6-OHDA et les lésions dopaminergiques prédites à travers le test pas à pas. Le 6-OHDA provoque une altération significative du nombre d’étapes effectuées avec le membre antérieur controlatéral.

Introduction

Les principales caractéristiques neuropathologiques de la MP sont la neurodégénérescence progressive chronique des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNc) et la présence de corps de Lewy contenant α-synucléine1. Comme les neurones dopaminergiques SNc projettent leurs axones dans le striatum par la voie nigrostriatale, la neurodégénérescence des neurones dans SNc entraîne un déficit dopaminergique dans le striatum2. L’absence de dopamine dans le striatum provoque un déséquilibre dans les activités des voies de contrôle moteur direct et indirect, responsable des principaux symptômes moteurs de la MP: akinésie (mouvement lent), bradykinésie (difficulté à commencer les mouvements), raideur musculaire et tremblements au repos3,4,5.

Comme les mécanismes moléculaires et physiologiques impliqués dans l’apparition de la MP ne sont pas encore entièrement compris, les principaux traitements actuellement disponibles cherchent à soulager les symptômes moteurs par le biais de pharmacothérapies, de stimulations cérébrales profondes6,7, de thérapies génétiques8 et de greffes de cellules9. Par conséquent, la recherche préclinique est fondamentale pour élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la MP et découvrir de nouvelles méthodologies pour le diagnostic précoce et de nouvelles thérapies pour prévenir ou arrêter la dégénérescence des neurones affectés par PD10.

Les modèles animaux ont été largement utilisés pour simuler la pathologie humaine en laboratoire, contribuant à l’avancement de la médecine et de la science11,12,13,14. Cependant, il est essentiel de souligner que le choix correct du modèle animal est fondamental pour le succès de l’étude. Par conséquent, le modèle animal doit être validé sous trois aspects principaux: i) la validité faciale, dans laquelle le modèle animal doit présenter les caractéristiques de la pathologie humaine; ii) la validité constructive, dans laquelle le modèle animal doit avoir une base théorique solide; et iii) la validité prédictive, dans laquelle les modèles animaux doivent répondre aux traitements de la même manière que le traitement clinique.

Actuellement, plusieurs animaux sont utilisés comme modèles animaux pour la MP. Les principaux groupes comprennent les mammifères, tels que les rongeurs, les primates, les minipigs, les chiens et les chats, et d’autres groupes tels que la drosophile et le poisson-zèbre. Les rongeurs sont le modèle animal le plus classique pour la MP et le plus utilisé en raison de leur facilité de manipulation et d’entretien. De plus, l’anatomie et les mécanismes moléculaires, cellulaires et pharmacologiques de la MP sont similaires chez les rongeurs et les humains15.

Une revue publiée par Kin et ses collègues en 2019 a analysé les principales méthodologies de modèle animal utilisées pour la MP dans les années 2000 et a révélé que le modèle animal le plus utilisé impliquait des neurotoxines telles que la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Les deux neurotoxines provoquent un dérèglement mitochondrial dans les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale, entraînant la mort cellulaire16. Un autre modèle largement utilisé implique une manipulation génétique par mutation dans des gènes spécifiques impliqués dans l’apparition de la MP, provoquant une dérégulation mitochondriale17. Les modèles de neurotoxines sont couramment utilisés pour évaluer et comparer les thérapies, tandis que les modèles génétiques sont utilisés pour étudier le développement de thérapies préventives et de PD15 idiopathique.

La neurotoxine MPTP a été découverte pour causer le parkinsonisme au milieu des années 1980 après que sept patients ont utilisé la substance et présenté des symptômes graves de MP. En plus des symptômes, les patients ont répondu au traitement par L-DOPA, ce qui a amené les chercheurs à lier la molécule directement à la MP. Après la publication du cas en 1986, plusieurs chercheurs ont commencé à utiliser le MPTP dans la recherche préclinique sur la MP18. Les chercheurs ont découvert qu’étant une molécule lipophile, le MPTP peut traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et être converti en MPP + 19. Cette substance toxique s’accumule à l’intérieur des neurones et endommage le complexe 1 de la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant la mort des neurones dopaminergiques20.

Le modèle de neurotoxine 6-OHDA a été utilisé pour la première fois pour induire la dégénérescence des neurones monoamines de la voie nigrostriatale en 196821. Le modèle 6-OHDA est couramment utilisé pour provoquer une neurodégénérescence dans la voie nigrostriatale car il s’agit d’un analogue de la dopamine et toxique pour les cellules contenant des catécholamines. Après que le 6-OHDA pénètre dans le cerveau, il peut être absorbé par le transporteur de dopamine (DAT) dans les neurones dopaminergiques, entraînant une dégénérescence de la voie nigrostriatale22. Étant donné que le 6-OHDA ne pénètre pas dans le BHE, il doit être administré directement par injection stéréotaxique intracérébrale23. Un inhibiteur de la recapture de la noradrénaline est souvent associé à une microinjection de 6-OHDA pour préserver les fibres noradrénergiques et fournir une dégénérescence plus sélective des neurones dopaminergiques24.

Une fois que le DAT a absorbé le 6-OHDA, il s’accumulera dans le cytosol des neurones, produisant des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et entraînant la mort cellulaire15. Trois modèles de lésions différentes de 6-OHDA sont fréquemment utilisés: i) lésions du SNc25,26; ii) lésions du striatum27,28; iii) lésions du MFB29,30. Les lésions causées dans le striatum entraînent une dégénérescence lente et rétrograde des neurones dopaminergiques dans le SNpc. En revanche, les lésions causées dans le SNpc et le MFB entraînent une dégénérescence rapide et totale des neurones, entraînant des symptômes parkinsoniens plus avancés31.

L’injection unilatérale ou bilatérale de 6-OHDA peut provoquer une neurodégénérescence dans les neurones dopaminergiques. 6-OHDA ne cause pas toujours de graves dommages aux neurones; parfois, l’injection entraîne des dommages partiels, qui sont également utilisés pour simuler les premiers stades de PD32. L’injection unilatérale est plus couramment utilisée en raison de la capacité du modèle à évaluer les déficits moteurs de l’animal et à prédire la perte cellulaire grâce à des tests tels que la rotation induite par l’amphétamine / apomorphine et le test par étapes29. Les injections bilatérales sont les plus utilisées pour évaluer la mémoire spatiale et la reconnaissance33.

Le test de rotation induit par l’amphétamine / apomorphine est un test comportemental couramment utilisé pour prédire la perte cellulaire dans la voie nigrostriatale. Il est défini comme un processus dans lequel l’administration répétée d’agonistes de la dopamine conduit à une intensification du comportement de rotation chez les animaux présentant des lésions 6-OHDA34. Le comportement de rotation consiste à quantifier la rotation ipsilatérale induite par les amphétamines ou les virages controlatéraux induits par l’apomorphine chez les rongeurs sectionnés unilatéralement. Le comportement de rotation induit par les médicaments a été critiqué parce que la rotation ne correspond pas aux symptômes de la MP chez l’homme et peut être affectée par des variables telles que la tolérance, la sensibilisation et l’amorçage 35.

L’amorçage est l’un des facteurs les plus critiques dans ces tests comportementaux. Certains cas ont été rapportés dans lesquels une dose unique de L-DOPA a conduit à une défaillance des comportements de rotation36. En outre, un autre facteur critique lié à l’application combinée du test induit par les amphétamines et du test induit par l’apomorphine pour une utilisation parallèle est qu’ils mesurent différents paramètres en raison de différents mécanismes d’action, reflétant l’inactivation de différents mécanismes et voies de signalisation. De plus, le test induit par les amphétamines est plus précis pour mesurer les lésions nigrostriatales supérieures à 50-60%, tandis que le test induit par l’apomorphine est plus précis pour les lésions supérieures à 80%37.

Le test pas à pas est apparu comme un test comportemental qui indique les déficits liés à la dégénérescence des neurones dopaminergiques et aux effets thérapeutiques. Il permet l’analyse de l’akinésie causée par une lésion 6-OHDA dans les neurones dopaminergiques sans procédure induite par un médicament. De plus, le test est bien établi et couramment utilisé depuis 1995, date à laquelle il a été décrit pour la première fois par Olsson et al.35. En 1999, Chang et al.38 ont également analysé et comparé la performance des rats dans le test de pas avec le niveau de dégénérescence causée par le 6-OHDA et ont constaté que les animaux qui ont obtenu de moins bons résultats dans le test de pas avaient également une dégénérescence plus significative des neurones dopaminergiques.

Le test pas à pas est une excellente méthode pour prédire les dommages nigrostriataux dopaminergiques graves chez les rats sectionnés au 6-OHDA. Les preuves suggèrent que des déficits moteurs apparaissent dans le membre antérieur controlatéral de la perfusion de 6-OHDA pendant le test de pas lorsque le degré de perte dopaminergique dans SNc est de >90%39. Cet article décrit les protocoles, les méthodologies et les matériaux utilisés pour effectuer une chirurgie stéréotaxique pour l’infusion unilatérale de 6-OHDA dans le MFB de rats et comment prédire les lésions dopaminergiques causées par la toxine à travers le test d’étape.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont suivi les principes éthiques du Conseil national pour le contrôle de l’expérimentation animale (CONCEA) et la loi Arouca (loi 11.794/2008) et ont été approuvées par le comité d’éthique local (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5).

1. Préparation de médicaments

  1. Anesthésie avec kétamine/xylazine
    REMARQUE: La dose de kétamine utilisée est de 70 mg / kg et la dose de xylazine est de 10 mg / kg.
    1. Pour préparer 1 mL d’anesthésique à l’aide d’une solution de kétamine 100 mg/mL et d’une solution de xylazine 20 mg/mL, mélanger 0,35 mL de solution de kétamine, 0,25 mL de solution de xylazine et 0,4 mL de solution saline stérile à 0,9 %. Administrer la solution anesthésique à un volume final de 2 mL/kg.
      REMARQUE: La kétamine avec la xylazine peut produire une sédation pendant 60-80 min. Si l’animal a encore des réflexes (p. ex., tangage de la patte arrière et/ou réflexe de clignement des yeux), administrer 10 % de plus de la dose individuelle.
  2. Imipramine
    REMARQUE: La dose individuelle d’imipramine utilisée est de 20 mg / kg.
    1. Pour préparer 1 mL de solution d’imipramine à 20 mg/mL, mélanger 20 mg d’imipramine et 1 mL de solution saline stérile à 0,9 %. Administrer la solution d’imipramine à un volume final de 1 mL/kg.
  3. Méloxicam
    REMARQUE: La dose individuelle de méloxicam utilisée est de 1 mg / kg.
    1. Pour préparer 1 mL de solution de méloxicam 1 mg/mL, mélanger 0,05 mL de méloxicam à 2 % et 0,95 mL de solution saline stérile à 0,9 %. Administrer la solution de méloxicam à un volume final de 1 mL/kg une fois par jour pendant deux jours.
  4. Acide ascorbique 0,1%
    1. Pour préparer 1 mL d’acide ascorbique à 0,1 %, mélanger 1 mg d’acide ascorbique et 1 mL de solution saline stérile à 0,9 %.
  5. 6-hydroxydopamine (6-OHDA)
    REMARQUE: 6-OHDA est une neurotoxine utilisée pour détruire sélectivement les neurones dopaminergiques et noradrénergiques dans le cerveau. Évitez tout contact direct avec la peau et les muqueuses des yeux, du nez et de la bouche. Lorsque vous manipulez le 6-OHDA, portez des gants en double nitrile, un manteau de laboratoire, une blouse jetable, une protection oculaire et un masque chirurgical ou un écran facial. Le volume total de perfusion de la toxine est de 4 μL/animal, et la quantité individuelle est de 10 μg de 6-OHDA/animal.
    1. Pour préparer 1 mL de 6-OHDA à une concentration finale de 2,5 mg/mL, mélanger 2,5 mg de 6-OHDA et 1 mL de solution saline à 0,9 % contenant 0,1 % d’acide ascorbique (décrit ci-dessus).
      REMARQUE: 6-OHDA est sensible à la lumière et se dégrade plus rapidement lorsqu’il est exposé à une lumière vive. Il doit être manipulé correctement et stocké dans un environnement protégé de la lumière. Si la couleur de la solution est rougeâtre, jetez-la.
  6. Chlorhydrate de lidocaïne (2 %)
    1. Préparer une solution de lidocaïne à 2% pour une application locale sur l’animal.
      REMARQUE: La dose maximale qui peut être appliquée est de 7 mg / kg.
  7. Suspension poly-antibiotique
    REMARQUE: La suspension poly-antibiotique avec des streptomycines et des pénicillines (voir le tableau des matériaux) doit être préparée au moment de l’application avec tout le volume de diluant, dont l’ampoule accompagne le flacon avec la poudre.
    1. Retirez le disque métallique sur le bouchon en caoutchouc. Désinfectez le bouchon en caoutchouc avec de l’alcool.
    2. À l’aide d’une seringue avec une aiguille de 23 G, injecter le diluant dans le flacon. Retirez l’aiguille et secouez vigoureusement le flacon jusqu’à ce que la suspension soit entièrement homogénéisée. Injectez un peu d’air dans le flacon et retirez le volume de suspension souhaité.
    3. Administrer une injection intramusculaire profonde, en tirant le piston avant d’injecter le médicament pour s’assurer qu’aucun vaisseau sanguin n’est atteint.
      REMARQUE: Le volume final de suspension à appliquer est de 0,5 mL/kg.

2. Préparation des matériaux

REMARQUE: Suivez toujours les instructions fournies avec la fiche de données de sécurité lorsque vous manipulez des produits chimiques.

  1. Appareil stéréotaxique
    1. Placez l’appareil stéréotaxique sur un banc stable et propre avec un éclairage approprié pour effectuer la chirurgie. Désinfectez l’appareil avec de l’éthanol à 70%.
    2. Vérifiez si les barres d’oreille et d’incisive de l’appareil sont correctement alignées. Placez une couverture thermique à l’endroit où l’animal sera placé pendant la chirurgie pour rester au chaud pendant la procédure. Surveillez la température de l’animal avec une sonde rectale précise.
      REMARQUE: La couverture thermique doit être à 37,5 ° C afin que l’animal maintienne une température corporelle de 37 ° C.
  2. Système de micro-perfusion
    1. Remplissez (70-80%) une seringue Hamilton (50 μL ou selon vos envies) attachée à un microtubage en polyéthylène de qualité médicale et une aiguille avec de l’eau distillée double (ddH2O) et vérifiez les fuites dans le système.
    2. Tirez l’air à travers le système de sorte qu’une seule bulle d’air sépare le ddH2O dans la seringue de la solution 6-OHDA dans le microtube.
      REMARQUE: Cette procédure évite de contaminer la seringue Hamilton avec du 6-OHDA et permet l’utilisation de plusieurs rats le même jour expérimental.
    3. Placez la seringue Hamilton sur la pompe à perfusion de manière à ce qu’elle soit fermement fixée et que le piston de la seringue soit parallèle au cadre qui se déplacera pour la pousser. Réglez la pompe à perfusion à une vitesse de 0,5 μL/min afin que l’application totale de 4 μL de 6-OHDA dure 8 min. Testez le système de perfusion en confirmant qu’il n’y a pas de fuites et que la perfusion se produit selon le temps et le volume définis précédemment.
    4. Fixez l’aiguille de perfusion attachée au microtube à l’appareil à l’extrémité du bras stéréotaxique et vérifiez que l’aiguille est positionnée à un angle de 180 ° par rapport à la surface. Assurez-vous que l’aiguille est droite et non pliée.
      REMARQUE: Vérifiez attentivement toutes les procédures décrites, car si l’un des éléments du système de perfusion ne fonctionne pas correctement, cela peut compromettre le succès de la chirurgie.
  3. Suture
    1. Utilisez une suture stérile en nylon non résorbable avec une aiguille circulaire 3/8 pour suturer l’incision après la chirurgie.
  4. Site de récupération postchirurgical
    1. Placez une boîte de logement propre et stérilisée où les animaux peuvent être surveillés jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis (réactifs au toucher et à la manipulation). Mettez une couverture thermique dans la boîte pour la thermorégulation.
      REMARQUE: Comme la thermorégulation est importante, incluez une source de chaleur supplémentaire pour maintenir la température corporelle si nécessaire.

3. Intervention chirurgicale

NOTE: Dans ce protocole, les rats Sprague-Dawley mâles adultes (200-250 g) ont été gardés dans des conditions contrôlées de température (22 ± 2 ° C), d’échange d’air (15-20 échanges / heure) et de cycles clair-obscurité (12 h / 12 h), regroupés dans des boîtes avec 3 ou 4 animaux, avec libre accès à la nourriture et à l’eau.

  1. Pesez les animaux pour surveiller les changements de poids dans les jours suivant la chirurgie. Calculer la dose de médicaments à administrer.
  2. Administrer l’imipramine par voie intrapéritonéale 30 minutes avant la chirurgie (~10-15 min avant l’administration de l’anesthésie), à l’aide d’une aiguille de 27 G et d’une seringue de 1 mL.
    REMARQUE: L’imipramine bloquera le transporteur de noradrénaline (NAT) et empêchera l’absorption de 6-OHDA par les neurones noradrénergiques, rendant la lésion plus sélective pour les neurones dopaminergiques40.
  3. Après 10-15 min d’administration d’imipramine, administrer l’anesthésie intrapéritonéale de kétamine/xylazine à l’aide d’une aiguille de 27 G et d’une seringue de 1 mL. Attendez que l’animal soit complètement anesthésié. Vérifiez que l’animal est sous anesthésie profonde lorsqu’il ne réagit pas au pincement de la patte arrière et ne présente pas de réflexe de clignement des yeux.
  4. Rasez la fourrure du rat dans la région de la tête où l’incision aura lieu.
  5. Positionnez le rat dans l’appareil stéréotaxique.
    1. Placez la tête au-dessus de la barre d’incisive et fixez la barre à 3,3 mm sous la ligne interaurale.
    2. Positionnez les barres d’oreille, un côté à la fois. Positionnez la barre d’incisive et les barres d’oreille de manière à ce que le haut du crâne soit droit et parallèle à la surface.
    3. Ajustez la pince de nez et vérifiez que la tête est ferme et ne bouge pas d’un côté ou de l’autre.
  6. Appliquez une pommade ophtalmique stérile sur les yeux du rat pour empêcher les cornées de se dessécher.
  7. Appliquer la povidone-iode sur la zone à inciser pour désinfecter le site.
  8. Appliquer la lidocaïne locale pour l’analgésie de la région d’incision; ne dépassent pas 7 mg/kg.
  9. Administrer le méloxicam par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 27 G et d’une seringue de 1 mL.
    REMARQUE: Le méloxicam est un analgésique anti-inflammatoire non stéroïdien qui aidera l’animal à récupérer après la chirurgie.
  10. Administrer la suspension polybiologique par voie intramusculaire à l’aide d’une aiguille de 23 G et d’une seringue de 1 mL.
    REMARQUE: La suspension poly-antibiotique est administrée comme traitement prophylactique pour éviter d’éventuelles infections bactériennes dans la récupération postopératoire.
  11. Vérifiez que l’animal est dans un état d’anesthésie profonde en vérifiant les réflexes de clignement des yeux ou les réflexes des membres postérieurs en pinçant la patte postérieure avec une pince à épiler.
  12. Avec un scalpel, faites une incision d’environ 1,5 cm dans la région où la microinjection se produira.
    REMARQUE: Des techniques stériles sont appliquées à partir de ce point jusqu’à la fermeture de la plaie.
  13. Nettoyez la région du crâne avec des cotons-tiges et des cotons-tiges jusqu’à ce que le Bregma et le Lambda puissent être vus. Marquez le Bregma et le Lambda avec un stylo fin stérilisé.
  14. Vérifiez que les coordonnées dorsales-ventrales (DV) de Bregma et Lambda sont similaires. S’ils sont différents, réajustez le rat dans l’appareil stéréotaxique car la tête du rat n’est pas correctement positionnée.
  15. Notez les coordonnées antéropostérieures (AP) et médiolatérales (ML) du Bregma.
  16. Déplacez-vous vers les coordonnées AP et ML du MFB droit selon 41: AP: -4,3 mm, ML: 1,6 mm de Bregma.
  17. Marquez la région de la trépanation avec un stylo fin stérilisé.
  18. Avec une perceuse stérilisée, percez lentement le crâne de l’animal, en prenant soin de ne pas blesser la dure-mère.
  19. Placez l’aiguille de micro-injection sur la dure-mère et notez les coordonnées DV. Prenez une aiguille fine et rompez doucement la dure-mère. Insérez l’aiguille à la coordonnée DV (8,3 mm ventral) du MFB, où la micro-injection aura lieu.
  20. Faites fonctionner la pompe à micro-injection pour libérer la solution 6-OHDA dans le MFB. Lorsque la microinjection est terminée, vérifiez la seringue Hamilton pour voir si 4 μL de 6-OHDA ont été injectés.
    REMARQUE: La microinjection devrait durer 8 min.
  21. Après l’administration du 6-OHDA, attendez 10 minutes avant de retirer l’aiguille pour éviter le reflux du médicament. Retirez lentement l’aiguille de micro-injection du cerveau de l’animal.
  22. Désinfectez à nouveau la région d’incision avec de la povidone-iode.
  23. Suturez la zone d’incision avec ~ 3-4 nœuds chirurgicaux.
    REMARQUE: Le nœud ne doit pas être trop fort ou trop lâche.
  24. Retirez le rat de l’appareil stéréotaxique et placez-le dans une boîte propre pour la récupérer sur la couverture thermique jusqu’à ce que l’animal se soit complètement remis de l’anesthésie. Observez l’animal toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé de l’anesthésie.

4. Procédures postopératoires

  1. Surveillez le poids des animaux au cours des quatre prochains jours après la chirurgie. Traitez-les avec du méloxicam par voie sous-cutanée une fois par jour pendant deux jours après la chirurgie, en ajustant la dose pour le poids de chaque jour.
    REMARQUE: Tous les animaux doivent être évalués pour le besoin d’analgésiques le troisième jour après la chirurgie.
  2. Vérifiez les incisions quotidiennement pendant au moins quatre jours pour vous assurer qu’elles ne sont pas infectées. Recherchez la chaleur, l’enflure, la douleur, l’écoulement et la rougeur jusqu’à ce que les incisions guérissent.
  3. Vérifiez l’appétit et la consommation d’eau en surveillant le poids corporel de l’animal. Donnez des aliments humides pour encourager les animaux à manger. Observez l’état général du corps, l’attitude et la mobilité quotidiennement pendant au moins quatre jours après la chirurgie. Retirez les sutures 7 à 10 jours après la chirurgie.
    REMARQUE : Les animaux doivent être euthanasiés si les paramètres définis dans les procédures éthiques sont atteints.

5. Test de pas à pas

  1. Formation
    REMARQUE: Les animaux doivent être dressés pendant trois jours avant le test. Selon le protocole décrit ci-dessous, l’entraînement doit avoir lieu deux fois par jour, une fois le matin et une fois l’après-midi, ou avec un intervalle d’au moins 2 heures entre les séances. Suivez l’heure à l’aide d’une minuterie.
    1. Jour 1
      1. Lors de la première séance, manipulez le rat en le tenant dans des gants pendant environ 1 à 2 minutes pour permettre au rat de se familiariser avec le manipulateur / expérimentateur.
      2. Lors de la deuxième séance, alternez entre tenir le rat pendant 20 s et le placer sur la table du protocole pendant 20 s. Répétez cette étape d’entraînement pendant 3 minutes pour familiariser le rat avec la configuration expérimentale du test de pas.
    2. Jour 2
      1. Lors de la première séance, placez les deux pattes antérieures du rat sur la table du protocole en tenant ses pattes postérieures et son dos d’une seule main. Inclinez le rat vers le bas la tête la première à un angle de 45° par rapport à la surface plane de la table de protocole. Déplacez-vous horizontalement sur la table d’un bout à l’autre, permettant au rat de marcher sur la table avec les deux pattes (couvrir 90 cm en 4 s). Tenez le rat dans des gants pendant 10 s, en lui permettant de se reposer; répétez ce schéma pendant 3 min.
      2. Lors de la deuxième séance, placez une patte avant du rat sur la table de protocole en tenant l’autre patte avant en arrière d’une main et tenez le dos et les pattes postérieures du rat de l’autre main (voir étape 5.1.2.1). Déplacez-vous horizontalement sur la table d’un bout à l’autre en 4 s, permettant au rat de marcher avec sa patte libre. Tenez le rat dans des gants pendant 10 s, ce qui lui permet de se reposer, et répétez avec une autre patte avant, suivie de la période de repos. Répétez ce schéma, en alternant entre les deux pattes antérieures, et reposez-vous pendant 3 min.
      3. Répétez l’étape d’entraînement 3 fois pendant 1 min chacune.
    3. Jour 3
      1. Au cours de la première séance, suivez la procédure décrite à l’étape 5.1.2.2 pour une patte avant. Répétez avec une autre patte avant, suivie de la période de repos. Répétez ce schéma, en alternant entre les deux pattes antérieures, et reposez-vous pendant 3 min.
      2. Au cours de la deuxième session, suivez la procédure décrite à l’étape 5.1.2.2.
  2. Test
    REMARQUE: Le test d’étape est effectué avant la chirurgie, 2 et 4 semaines après la chirurgie stéréotaxique, pour évaluer l’akinésie du membre antérieur controlatéral et la blessure possible causée par le 6-OHDA.
    1. Tenez le rat à un angle de 45° par rapport à la surface, en immobilisant ses membres postérieurs et en ne laissant reposer qu’un seul des membres antérieurs sur la plate-forme, comme expliqué ci-dessus, pour le jour 3 de l’entraînement.
    2. Faites glisser le rat vers l’avant sur une distance de 90 cm en 4 s, la patte droite ou gauche reposant sur la surface.
    3. Prenez des notes et quantifiez le nombre de pas d’ajustement en coup droit effectués avec chaque patte dans chaque direction.

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Representative Results

Évaluation des lésions dopaminergiques
Le test par étapes permet d’évaluer l’akinésie du membre antérieur controlatéral à la lésion et de sélectionner des animaux présentant une lésion possible de la voie nigrostriatale induite par perfusion de 6-OHDA (Figure 1). La comparaison de la performance du test de pas du membre antérieur controlatéral avant la chirurgie et 2 semaines et 4 semaines après la chirurgie a révélé une interaction (F2,74 = 93,63; p < 0,0001; ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles) entre le temps (pré, 2 et 4 semaines après la chirurgie) et le traitement (opéré simulé et 6-OHDA-lésionné). Le test post-hoc de Bonferroni a montré une diminution significative du nombre d’étapes controlatérales à la lésion chez les animaux recevant du 6-OHDA dans la MFB droite par rapport aux animaux opérés simulés à la deuxième et à la quatrième semaine après la chirurgie (p < 0,0001) (Figure 1). Les résultats étaient cohérents avec ceux des études précédentes35.

Il est important de noter que lorsque la lésion dopaminergique n’est pas complète, les résultats du test pas à pas n’atteindront pas le degré de succès des résultats présentés dans cette étude. Une étude précédemment publiée a effectué le test pas à pas et l’immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (TH) avec des animaux présentant une lésion dopaminergique partielle après avoir effectué une intervention chirurgicale pour la micro-injection de 6-OHDA en suivant le même protocole utilisé dans cette étude. Leur découverte d’un déficit partiel dans le test de pas (4-8 étapes) est le résultat d’une lésion dopaminergique partielle d’environ 60% des neurones39.

Figure 1
Figure 1 : Évaluation de l’essai d’étape controlatéral avant et après la chirurgie pour perfusion unilatérale de 6-OHDA ou d’un véhicule dans le MFB droit. Les données montrent que les animaux recevant du 6-OHDA ont présenté une diminution significative du nombre d’étapes avec le membre antérieur controlatéral à la lésion aux deuxième et quatrième semaines après la chirurgie (****p < 0,0001 vs simulacre post-chirurgie; ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, Bonferroni post-hoc). Données exprimées en moyenne ± erreur-type de la moyenne. Le véhicule est une solution saline à 0,9 % contenant 0,1 % d’acide ascorbique. Les résultats sont basés sur 14 animaux du groupe simulé et 25 animaux du groupe 6-OHDA. Abréviations : P = chirurgie. 2 = deux semaines après la chirurgie. 4 = quatre semaines après la chirurgie; 6-OHDA = 6-hydroxydopamine; MFB = faisceau médian du cerveau antérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La comparaison de la performance du test de préchirurgie du ganglion antérieur ipsilatéral et 2 semaines et 4 semaines après la chirurgie n’a révélé aucune interaction (F2,74 = 0,4492; p = 0,6399; ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles) entre le temps (pré, 2 et 4 semaines après la chirurgie) et le traitement (opéré simulé et 6-OHDA-lésionné). Le test post-hoc de Bonferroni n’a montré aucune différence significative dans le nombre d’étapes ipsilatérales à la lésion chez les animaux recevant du 6-OHDA dans la bonne MFB par rapport aux animaux simulés (Figure 2).

Figure 2
Figure 2 : Évaluation du test ipsilatéral de pas avant et après la chirurgie pour perfusion unilatérale de 6-OHDA ou de véhicule dans la MFB droite. Les données montrent que les animaux recevant du 6-OHDA n’ont pas diminué de manière significative le nombre de pas avec le membre antérieur ipsilatéral à la lésion aux deuxième et quatrième semaines après la chirurgie (p > 0,05 vs post-chirurgie simulée; mesures répétées bidirectionnelles ANOVA, Bonferroni post-hoc). Données exprimées en moyenne ± erreur-type de la moyenne. Le véhicule est une solution saline à 0,9 % contenant 0,1 % d’acide ascorbique. Les résultats sont basés sur 14 animaux du groupe simulé et 25 animaux du groupe 6-OHDA. Abréviations : P = chirurgie. 2 = deux semaines après la chirurgie. 4 = quatre semaines après la chirurgie; 6-OHDA = 6-hydroxydopamine; MFB = faisceau médian du cerveau antérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Conformément aux études antérieures sur des animaux présentant des lésions de 6-OHDA42, l’analyse histologique (Figure 3) comparant la TH du striatum des deux hémisphères permet une évaluation fiable du déficit en DA dans le striatum. Par conséquent, ce protocole comportemental peut être utilisé en combinaison avec des méthodes immunohistochimiques dans des études impliquant des modèles expérimentaux de MP.

Figure 3
Figure 3 : Images représentatives du marquage TH dans le modèle expérimental 6-OHDA de, y compris le striatum antérieur et la substantia nigra compacta. L’image panoramique montre l’extension de la lésion, et les zooms en médaillon représentent l’innervation des corps cellulaires immunocolorés. (A) Image de la section coronale striatale montrant une lésion partielle induite par le 6-OHDA dans l’hémisphère droit. (B) Image de la substantia nigra et de la section coronale de l’aire tegmentale ventrale du même animal montrant également l’extension de la lésion. (C) Image de la section coronale striatale montrant une lésion induite complète par le 6-OHDA dans l’hémisphère droit. (D) Image de la substantia nigra et de la section coronale de l’aire tegmentale ventrale du même animal montrant également l’extension de la lésion. Barre d’échelle = 1,3 mm en vue panoramique et 65 μm en zooms en médaillon. Abréviations : 6-OHDA = 6-hydroxydopamine ; TH = tyrosine hydroxylase; = maladie de Parkinson; NL = non lésionné; L = lésion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cet article décrit un protocole de chirurgie pour la microinfusion unilatérale de 6-OHDA dans la MFB, capable de provoquer des lésions robustes dans les neurones de la voie nigrostriatale et de générer une akinésie chez l’animal. Le protocole d’exécution du test pas à pas, un test facile à appliquer et non invasif qui peut être utilisé pour prouver le succès des lésions et évaluer l’akinésie des membres antérieurs, est également décrit. Comme présenté dans les résultats représentatifs, les animaux recevant du 6-OHDA ont montré une réduction du nombre d’étapes d’ajustement controlatérales à la blessure, ce qui signifie que les animaux blessés au 6-OHDA présentent une forte akinésie à partir de 2 semaines après la chirurgie de perfusion. L’akinésie - au centre de plusieurs traitements de la maladie - est l’un des principaux symptômes moteurs de la MP. Le développement de l’akinésie dans un modèle animal est important pour les études précliniques de la MP. De plus, ces résultats ressemblent à ceux rapportés par Chang et al.37, qui ont confirmé que les animaux présentant un nombre inférieur d’étapes avaient un pourcentage plus élevé de mort des neurones dopaminergiques par immunohistochimie. Par conséquent, les animaux qui ont présenté un nombre inférieur d’étapes d’ajustement controlatéral sont plus susceptibles d’avoir une lésion dopaminergique.

L’évaluation du succès de la chirurgie et des lésions peut également être confirmée par d’autres tests comportementaux tels que la rotation induite par l’amphétamine / apomorphine43, le test de balancement corporel élevé (EBST), le test de couloir, le test de cylindre, les techniques de marquage tissulaire telles que l’immunohistochimie TH, ou même la quantification de la dopamine dans le striatum par HPLC42. D’autres méthodologies diffèrent par la dose injectée de 6-OHDA et l’intervalle de temps postopératoire pour l’évaluation comportementale. Une revue récente43 résume les articles les plus récents utilisant cette méthodologie et la différence de dose, de tests comportementaux et d’intervalle postopératoire entre eux. Le modèle de MP induit par le 6-OHDA n’imite pas tous les processus pathologiques liés à la maladie, tels que l’accumulation de corps de Lewy, mais simule la mort des neurones dopaminergiques de la voie striatale-nigrale. Cela permet l’étude de nouvelles thérapies pour les symptômes de la maladie, ce qui pourrait conduire à une amélioration de la qualité de vie des patients touchés par cette maladie.

Bien qu’il s’agisse du modèle le plus utilisé, le modèle 6-OHDA a ses limites comme tous les modèles actuels. Le modèle a l’inconvénient de ne pas représenter pleinement les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathologie de la maladie, tels que l’accumulation de protéines d’alfa-synucléine et la formation de corps de Lewy. Le modèle simule la mort des neurones dopaminergiques de la voie nigrostriatale, correspondant à un stade avancé de la maladie et conduisant à l’apparition de symptômes moteurs uniquement. Cela le rend impropre à l’étude de son développement naturel15,32. Le modèle 6-OHDA décrit dans cet article est généralement caractérisé par de faibles taux de mortalité. La récupération postchirurgicale est cruciale pour prévenir les taux de mortalité élevés dus à l’union d’une procédure invasive et de la lésion neurodégénérative44. Il est possible de réduire la mortalité en prenant des précautions supplémentaires pendant la période de récupération postopératoire avec supplémentation nutritionnelle, réhydratation et contrôle externe de la température45. Il a été démontré que la combinaison de ces mesures réduit, voire élimine considérablement le taux de mortalité30,46. Une cause fréquente de décès est l’insertion de l’aiguille à la mauvaise coordonnée dans le cerveau. Il est crucial de vérifier soigneusement les coordonnées lors de cette intervention chirurgicale délicate. Cela évitera d’endommager d’autres structures cérébrales (par exemple, l’hypothalamus) par l’aiguille, ce qui peut nuire aux actions alimentaires et de consommation de l’animal, entraînant la malnutrition et la déshydratation47.

Enfin, il est essentiel de souligner que bien que le protocole d’anesthésie kétamine-xylazine soit bien établi et utilisé dans les expériences sur les rongeurs48, certaines preuves suggèrent que la combinaison de ces anesthésiques peut être insuffisante pendant une longue période de chirurgie. De plus, la sensibilité à la kétamine-xylazine peut varier selon les différentes souches de souris et de rats49,50. Une alternative peut être d’induire l’anesthésie par inhalation d’isoflurane. Une étude a démontré une perte plus rapide du réflexe de redressement avec l’anesthésie induite par l’isoflurane qu’avec la kétamine-xylazine. De plus, 60% des rats anesthésiés avec de la kétamine-xylazine ont présenté des réflexes consécutifs de pincement des orteils pendant l’intervention chirurgicale, même avec une supplémentation en dose. En revanche, les animaux anesthésiés à l’isoflurane présentaient des cas isolés de réflexes de pincement de la queue qui disparaissaient après réglage du volume51.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP, subvention 2017/00003-0). Nous sommes reconnaissants pour la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES). Nous remercions le Dr Anthony R. West, le Dr Heinz Steiner et le Dr Kuei Y. Tseng pour leur soutien et leur mentorat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OHDA Sigma Aldrich H4381 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel
_6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid Sigma Aldrich 795437 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid=
Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD
RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09
_kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO
6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL Hamilton 80539 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine Alfa Aeser J63723 https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump Insight EFF-311 https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino) Ourofino https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic Zoetis https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus Insight EFF-331 https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan) Ceva https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN

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Neurosciences numéro 176
Le modèle de rat 6-hydroxydopamine de la maladie de Parkinson
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Guimarães, R. P., Ribeiro, D. L., dos Santos, K. B., Godoy, L. D., Corrêa, M. R., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62923, doi:10.3791/62923 (2021).

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