Summary
תכננו ובנינו מעבדה ניידת למדידת קצב הנשימה במיטוכונדריה מבודדת של חיות בר שנלכדו בשדות. כאן, אנו מתארים את העיצוב וההתאמה של מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת ואת פרוטוקולי המעבדה הקשורים.
Abstract
אנרגיה מיטוכונדריאלית היא נושא מרכזי בביוכימיה ובפיזיולוגיה של בעלי חיים, כאשר חוקרים משתמשים בנשימה מיטוכונדריאלית כמדד לחקר היכולת המטבולית. כדי להשיג את המדדים של נשימה מיטוכונדריאלית, יש להשתמש בדגימות ביולוגיות טריות, ויש להשלים את כל הליך המעבדה תוך כשעתיים. יתר על כן, חלקים מרובים של ציוד מיוחד נדרשים לבצע בדיקות מעבדה אלה. הדבר יוצר אתגר למדידת נשימה מיטוכונדריאלית ברקמות של חיות בר החיות הרחק ממעבדות פיזיולוגיות, שכן רקמות חיות אינן יכולות להישמר זמן רב לאחר האיסוף בשטח. יתר על כן, הובלת בעלי חיים למרחקים ארוכים גורמת ללחץ, אשר יכול לשנות את האנרגיה המיטוכונדריאלית.
כתב יד זה מציג את MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU), מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שניתן לקחת לשטח ולהשתמש בה באתר כדי למדוד את חילוף החומרים במיטוכונדריה ברקמות שנאספו מחיות בר. התכונות הבסיסיות של המעבדה הניידת והשיטות שלב אחר שלב למדידת שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מבודדים מוצגים. בנוסף, הנתונים שהוצגו מאמתים את ההצלחה של התאמת המעבדה הניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביצוע מדידות נשימה מיטוכונדריאלית. החידוש של המעבדה הניידת טמון ביכולת לנסוע לשדה ולבצע מדידות מיטוכונדריאליות על רקמות של בעלי חיים שנלכדו באתר.
Introduction
עד כה, מחקרים שנועדו למדוד אנרגיה מיטוכונדריאלית הוגבלו לחיות מעבדה או לבעלי חיים שנלכדו ליד מעבדות פיזיולוגיות מבוססות, מה שמנע ממדענים לבצע מחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים ברקמות שנאספו מבעלי חיים במהלך פעילויות כגון נדידה, צלילה ותרדמת חורף 1,2,3,4,5,6 . בעוד שחוקרים רבים מדדו בהצלחה את קצב חילוף החומרים הבסיסי והשיא ואת הוצאות האנרגיה היומיות של חיות בר7,8, יכולתם של החוקרים למדוד את ביצועי המיטוכונדריה נותרה מוגבלת (אך ראו 1,4,9). זאת, בין היתר, בשל הצורך ברקמה טרייה לבידוד מיטוכונדריה ובמתקן מעבדה לביצוע הבידודים בתוך כשעתיים מקבלת הרקמה הטרייה. לאחר בידוד המיטוכונדריה, יש להשלים גם את מדידות הנשימה המיטוכונדריאלית תוך ~1 שעות.
קצבי נשימה מיטוכונדריאליים מבודדים מבוצעים בדרך כלל על ידי מדידת ריכוז החמצן במיכל אטום המחובר לאלקטרודת קלארק. התיאוריה מאחורי שיטה זו מבוססת על התצפית הבסיסית כי חמצן הוא מקבל האלקטרונים האחרון של נשימה מיטוכונדריאלית במהלך זרחן חמצוני. לכן, כאשר ריכוז החמצן יורד במהלך ניסוי, ההנחה היא כי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) מתרחש10. חמצן נצרך הוא פרוקסי עבור ATP המיוצר. חוקרים יכולים ליצור תנאי ניסוי ספציפיים באמצעות מצעים שונים וליזום נשימה מגורה אדנוזין דיפוספט (ADP) (מצב 3) על ידי הוספת כמויות קבועות מראש של ADP לחדר. בעקבות הזרחן של ADP אקסוגני ל-ATP, קצב צריכת החמצן יורד, ומגיעים למצב 4 וניתן למדוד אותו. יתר על כן, הוספת מעכבים ספציפיים מאפשרת לקבל מידע לגבי נשימה דולפת ונשימה לא מצומדת10. היחס בין מצב 3 למצב 4 קובע את יחס בקרת הנשימה (RCR), שהוא האינדיקטור לצימוד מיטוכונדריאלי כולל10,11. ערכים נמוכים יותר של RCR מצביעים על תפקוד לקוי כללי של המיטוכונדריה, בעוד שערכי RCR גבוהים יותר מצביעים על מידה רבה יותר של צימוד מיטוכונדריאלי10.
כאמור, איסוף החומר הביולוגי, בידוד המיטוכונדריה ומדידת קצב הנשימה חייבים להסתיים תוך שעתיים מקבלת הרקמה. כדי לבצע משימה זו מבלי להעביר בעלי חיים למרחקים גדולים למעבדות מבוססות, נבנתה מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שתילקח לאתרי שדה שבהם ניתן לאסוף נתונים אלה. רכב פנאי של ג'ייקו רדהוק משנת 2018 הוסב למעבדה ניידת לפיזיולוגיה מולקולרית ונקרא MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU) (איור 1A). רכב פנאי נבחר בגלל המקרר המובנה, המקפיא, מיכל אגירת המים והצנרת, חשמל המופעל על ידי סוללות 12 וולט, גנרטור גז, מיכל פרופאן ומערכת פילוס עצמי. יתר על כן, רכב הפנאי מספק את היכולת לשהות באתרים מרוחקים למשך הלילה לצורך איסוף נתונים. חזית הרכב לא שונתה והיא מספקת את מגורי הנסיעה והשינה (איור 1B). אביזרי חדר השינה שהותקנו בעבר (מיטה, טלוויזיה וארון) בחלק האחורי של הרכב והכיריים הוסרו.
מדפי נירוסטה בהתאמה אישית ומשטח קוורץ בהתאמה אישית הנתמך על ידי מסגרת אלומיניום 80/20 הותקנו במקום אביזרי השינה והכיריים (איור 1C). ספסלי המעבדה מספקים מספיק מקום לאיסוף נתונים (איור 1D). צריכת החשמל של כל פריט ציוד (כלומר, צנטריפוגות קירור, תאי נשימה מיטוכונדריאליים, קוראי צלחות, מחשבים, הומוגנייזרים, מאזניים, אולטרה-מקפיא נייד וציוד מעבדה כללי אחר) נלקחה בחשבון. כדי לתמוך בדרישות המתח והזרם הגדולות של הצנטריפוגה, שודרגה מערכת החשמל לזו של ציוד ברמת מטוסים. תא חיצוני בחלקו האחורי של הרכב הוסב למפרץ אחסון חנקן נוזלי, העומד בהנחיות משרד התחבורה האמריקאי לאחסון ושינוע חנקן נוזלי. יחידת אחסון זו נבנתה מפלדת אל-חלד ויש לה אוורור מתאים כדי למנוע דליפת גז חנקן מתפשט לתא הנוסעים ברכב.
כדי לאשר שהמעבדה הניידת יכולה לשמש במחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים, בודדו מיטוכונדריה, ונמדדו שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מעכברי בית פראיים (Mus musculus) שרירי השלד האחוריים. מכיוון ששריר Mus הוא אורגניזם מודל, שיעורי הנשימה המיטוכונדריאלית של מין זה מבוססים היטב12,13,14. למרות שמחקרים קודמים תיעדו בידוד מיטוכונדריאלי באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית15,16,17, סקירה קצרה של השיטות המשמשות בשיטות המעבדה הניידות לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית מתוארת להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הסעיפים הבאים מתארים את שיטות המעבדה במיטוכונדריה. כל נהלי הטיפול בבעלי חיים ואיסוף רקמות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אובורן (#2019-3582).
1. תיאור המאגרים המשמשים לאיסוף נתונים
הערה: ניתן להכין מאגרים אלה במעבדה נייחת ולהעבירם למעבדה הניידת לפני הנסיעה בשטח (אלא אם צוין אחרת להלן).
- הכינו את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי של שרירי השלד עם אלבומין בסרום בקר (BSA), כפי שניתן לראות בטבלה 1.
- ממיסים כימיקלים במים שעברו דה-יוניזציה (~ 90% נפח) למעט BSA נטול חומצות שומן. הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
- התאם את התמיסה ל- pH של 7.5 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
- הוסיפו את ה-BSA נטול חומצות השומן והעלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
- הכינו את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי של שרירי השלד ללא BSA כפי שניתן לראות בטבלה 1.
- להמיס את הכימיקלים במים נטולי יונים, (~ 90% נפח). הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
- התאם את התמיסה ל- pH של 7.5 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
- העלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
- הכינו את חיץ מתלה שרירי השלד כפי שניתן לראות בטבלה 1.
- להמיס את הכימיקלים במים נטולי יונים, (~ 90% נפח). הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
- התאם את התמיסה ל- pH של 7.4 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
- העלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
- הכינו את חיץ הנשימה של שרירי השלד כפי שניתן לראות בטבלה 2.
- ממיסים את הכימיקלים במים שעברו דה-יוניזציה (~ 90% נפח) למעט BSA נטול חומצות שומן. מחממים את החיץ עד לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- התאם את התמיסה ל- pH של 7.0 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 37 ° C.
- הוסיפו את ה-BSA נטול חומצות השומן והעלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
- הכינו את מצעי הנשימה כפי שניתן לראות בטבלה 2.
- ודא כי מצעים אלה נעשים טריים ביום איסוף הנתונים ב 100 mM Tris-HCl, pH 7.4. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
הערה: הערכים שסופקו הם ליצור תמיסה מרוכזת מספיק כדי שהמצע ייקלט מספיק על ידי המיטוכונדריה. הריכוזים הסופיים של המצע הם 2 מ"מ פירובט, 2 מ"מ מלאט, 10 מ"מ גלוטמט ו-5 מ"מ סוקצינאט.
- ודא כי מצעים אלה נעשים טריים ביום איסוף הנתונים ב 100 mM Tris-HCl, pH 7.4. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
2. ביצוע בידוד מיטוכונדריאלי (איור 2)
הערה: בידוד מיטוכונדריאלי ומדידות נשימה מיטוכונדריאלית מבוצעים באזור ספסל המעבדה של המעבדה הניידת, וכל התמיסות צריכות להישמר בטמפרטורה של 4°C אלא אם כן צוין אחרת.
- להחנות את המעבדה הניידת על קרקע שטוחה. הפעל את הגנרטור ויישר את הרכב. הרחב את השקופית והגדר את הציוד.
- הפשירו את כמויות המאגרים הרצויות.
הערה: באופן כללי, 30 מ"ל של חיץ בידוד שרירי השלד ו -10 מ"ל של חיץ בידוד שרירי השלד ללא BSA נדרשים לכל שריר. - הגדר וכייל את תאי הנשימה המיטוכונדריאליים לטמפרטורה הרצויה של הניסויים וללחץ הברומטרי הנוכחי בהתאם להוראות היצרן. ראה טבלת החומרים עבור תאים ספציפיים המשמשים בניסויים.
- הרדימו את בעל החיים באמצעות עריפת ראש.
הערה: המחקר הנוכחי השתמש בעריפת ראש לצורך המתת חסד. גזים מסוימים, כגון פחמן דו חמצני ואיזופלורן, משפיעים על תפקוד המיטוכונדריה18,19,20; השפעות אלה יש לשקול בעת בחירת השיטה הטובה ביותר של המתת חסד עבור כל מחקר. השיטה שיש לבצע עבור כל מחקר תיקבע על פי השאלה המדעית שתישאל. - הבלו על שרירי השלד, חותכים במהירות שומן ורקמת חיבור, שוקלים ומניחים את השריר במאגר בידוד שרירי השלד עם BSA (לפחות 1/10 w/v) (למשל, 1 גרם שריר השלד עד 10 מ"ל חיץ).
- טוחנים את שריר השלד עם מספריים על קרח.
- מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל באמצעות קצה צינור חתוך של 5 מ"ל. הומוגניזציה עם להב (ראה טבלת החומרים) בהספק של 50% למשך 5 שניות. מוסיפים פרוטאז (5 מ"ג/גרם שריר רטוב) ומעכלים במשך 7 דקות, מערבבים את התמיסה כל 30 שניות. סיים את התגובה על-ידי הוספת נפח שווה של מאגר בידוד עם BSA.
- צנטריפוגה הומוגנט ב 500 × גרם במשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט דרך בד גבינה דו-שכבתי באמצעות קצה פיפט חתוך של 5 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל. צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 3,500 × גרם במשך 10 דקות כדי לזרז גלולה מיטוכונדריאלית חומה.
- יוצקים החוצה את שארית הסופרנאטנט. הוסף את אותו נפח של חיץ בידוד עם BSA לצינור הצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית עם מגרד גמיש (שוטר) על ידי עבודה עדינה של הגלולה המיטוכונדריאלית מדפנות צינור הצנטריפוגה. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 דקות.
- יוצקים החוצה את שארית הסופרנאטנט. הוסף את אותו נפח של חיץ בידוד ללא BSA לצינור הצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית על ידי עבודה עדינה של גלולת המיטוכונדריה מדפנות צינור הצנטריפוגה עם שוטר נקי. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 דקות.
- דקרו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית בחיץ מתלה על ידי עבודה עדינה של הגלולה המיטוכונדריאלית מדפנות צינור הצנטריפוגה עם שוטר נקי.
הערה: נפח חיץ המתלים יהיה תלוי בגודל כדורית המיטוכונדריה. - מעבירים את המיטוכונדריה המרחפים להומוגנייזר Dounce עם קצה פיפט חתוך של 1 מ"ל. באמצעות הומוגנייזר Dounce, בזהירות הומוגניזציה של המתלים עם 4-5 מעברים.
- הניחו את המתלה המיטוכונדריאלי בצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח 2 מ"ל באמצעות קצה צינור 1 מ"ל חתוך נוסף.
3. מדידות נשימה מיטוכונדריאלית (איור 3)
- קומפלקס I מצעים
- הוסף 945 μL של חיץ נשימה לחדר. ודא שהמערבל מסתובב, ושטמפרטורת החיץ נשמרת על 37°C. התחל את ההקלטה של איסוף הנתונים.
- לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר של המיטוכונדריה והניחו את המכסה על החדר. בתוכנה, לציין כי מיטוכונדריה נוספו לחדר.
- הוסף 10 μL של 1 M גלוטמט, 10 μL של 200 mM malate, ו 10 μL של 200 mM pyruvate לתא עם מזרקים בודדים ולחכות עד האות מתייצב. בתוכנה, ציין כי נוספו מצעים.
הערה: מצעים אלה משמשים בדרך כלל למדידת נשימה מונעת פחמימות. לשילובים אחרים של מצעים שישמשו למדידת נשימה מונעת שומן, ראו21. - הוסף 5 μL של ADP עם מזרק נפרד ולבחון את צריכת החמצן המהירה (מצב 3). בתוכנה, ציין כי ADP נוסף.
הערה: בעקבות הזרחן של ADP נוסף, קצב צריכת החמצן יהיה מישורי למצב 4. - לאחר 4 דקות של איסוף נתונים במצב 4, סיים את ההקלטה. שמור את קובץ הנתונים.
- מצעים מורכבים II
- הוסף 963 μL של חיץ הנשימה לחדר. ודא שהמערבל מסתובב, ושטמפרטורת החיץ נשמרת על 37°C. התחל את ההקלטה של איסוף הנתונים.
- לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר מיטוכונדריה והניחו את המכסה על החדר. בתוכנה, לציין כי מיטוכונדריה נוספו לתמיסה.
- הוסף 2 μL של 4 מיקרוגרם / μL רוטנון ואחריו 10 μL של 500 mM succinate לתא באמצעות מזרקים נפרדים והמתן עד שהאות יתייצב. בתוכנה, ציין כי נוספו מצעים.
- הוסף 5 μL של ADP באמצעות מזרק נפרד ולבחון את צריכת החמצן המהירה (מצב 3). בתוכנה, ציין כי ADP נוסף.
הערה: בעקבות הזרחן של ADP נוסף, קצב צריכת החמצן יהיה מישורי למצב 4. - לאחר 4 דקות של איסוף נתונים במצב 4, סיים את ההקלטה. שמור את קובץ הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתב היד הנוכחי חקר את הנשימה המיטוכונדריאלית של Mus musculus שמקורו בטבע (n = 7, זכר = 5, נקבה = 2; גיל = 1.30 ± 0.2 שנים) במעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית (איור 1). כדי למדוד נשימה מיטוכונדריאלית של שרירי השלד, כל הגפה האחורית, כלומר שריר אירובי ואנאירובי, שימשה לבידוד מיטוכונדריאלי (איור 2). דוגמאות לנתוני נשימה מיטוכונדריאלית גולמיים מוצגות באיור 3. איור 3A ואיור 3B מייצגים נשימה מיטוכונדריאלית מורכבת המונעת על-ידי I. המדרון התלול שנצפה באיור 3A מייצג את קצב הנשימה המרבי הגבוה. זהו הערך המשמש לניתוח נתונים נוסף. הבידוד המוצלח של המיטוכונדריה משריר השלד של הגפה האחורית נצפה על-ידי פנייה חדה וייצוב שיפוע חדש, שקובע את מצב 4 (איור 3B).
נתונים אלה יכולים להתפרש גם כתפקוד גבוה של המיטוכונדריה עקב הפנייה החדה לקביעת מצב 4. דפוס דומה ניתן לראות עבור נשימה מיטוכונדריאלית מורכבת המונעת על ידי II (איור 3C ואיור 3D). איור 3E,F מדגים תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, בין אם בגלל פיזיולוגיה של המיטוכונדריה או בגלל נשימה מיטוכונדריאלית לא מוצלחת. איור 3E מראה את הצימוד של המיטוכונדריה לנשימה מיטוכונדריאלית מורכבת מונעת I, כפי שניתן לראות בפנייה למצב 4. אולם איור 3F מדגים נשימה מיטוכונדריאלית לא מצומדת קומפלקס II, כפי שמודגם על-ידי קו שטוח לאחר הוספת ADP, וללא "סיבוב" כדי לייצר נתוני מצב 4. נתונים אלה עשויים להצביע על בעיות אפשריות במהלך בידוד מיטוכונדריאלי, אשר יידונו להלן.
הערכים המספריים של מצב 3, מצב 4 ו-RCR עבור קומפלקס I ו-II של החיות האלה נמצאים באיור 4. נתונים אלה נקבעו על-ידי מדידת 30 שניות של המדרון התלול ביותר לאחר הוספת ADP כדי לקבוע את מצב 3 (איור 3A,C) ומדידת השיפוע לאחר ה"סיבוב" במשך דקה אחת כדי למדוד את מצב 4 (איור 3B,D). ברגע שערכים אלה התקבלו, הנתונים נורמלו לתכולת חלבון (באמצעות בדיקת ברדפורד22). באמצעות הערכים המנורמלים, RCR חושב על-ידי חלוקת ערך המצב המנורמל 3 בערך המצב המנורמל 4.
איור 1: AU MitoMobile, מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית. (A) החלק החיצוני של AU MitoMobile. (B) החלק הפנימי של הרכב המסתכל על החלק הקדמי שבו לא בוצעו שינויים. (ג) החלק האחורי של הרכב המציג את התקנת הספסלים, תאי האחסון והצנטריפוגה. (ד) הגדרת הציוד במהלך איסוף הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך בידוד מיטוכונדריאלי ומדידת נשימה בשרירי השלד. (1) הרקמה מנותחת מהחיה ומונחת בחיץ שבו היא (2) טחונה, הומוגנית, מטופלת בפרוטאז ונתונה לצנטריפוגה עד לקבלת הגלולה המיטוכונדריאלית. (3) גלולת המיטוכונדריה מושהית מחדש, ומתקבלים נתוני נשימה. (4) ניתן להשתמש בנתוני צריכת חמצן כדי לחשב מצב 3, מצב 4 ו-RCR. קיצור: RCR = יחס שליטה נשימתית. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידות נשימה מיטוכונדריאלית עם מצעים מורכבים I ו-II מורכבים. צריכת חמצן עם מצעים מורכבים I, הדגשת ניתוח המדרון של מצב 3 (A) ומצב 4 (B). צריכת חמצן עם מצעים מורכבים II, הדגשת ניתוח המדרון של מצב 3 (C) ומצב 4 (D). ניתן לראות נשימה מיטוכונדריאלית תת-אופטימלית בנשימה מורכבת מונעת I (E) ובנשימה מורכבת מונעת II (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נתונים שנאספו על עכברי בית (Mus musculus) ב-AU MitoMobile. בידוד מיטוכונדריאלי ונשימה בוצעו באמצעות ההליך המתואר כאן. פירובט, מלאט וגלוטמט שימשו לקביעת שיעורי נשימה מורכבים מסוג I. סוקצינאט ורוטנון שימשו למדידת קצבי נשימה מורכבים מסוג II. (A) קומפלקס I מצב 3 מדידות, (B) קומפלקס I מצב 4 מדידות, (C) קומפלקס I RCR, (D) קומפלקס II מצב 3 מדידות, (E) קומפלקס II מצב 4 מדידות, ו-(F) קומפלקס II RCR. קיצור: RCR = יחס שליטה נשימתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| חיץ בידוד מיטוכונדריה לשרירי השלד | ||
| מגיב | עם BSA, ריכוז (mM) | ללא BSA, ריכוז (mM) |
| KCl | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| טריס-בייס | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| BSA ללא חומצות שומן | 0.15% | - |
| חיץ מתלה מיטוכונדריה מבודד לשרירי השלד | ||
| מגיב | ריכוז (mM) | |
| מניטול | 220 | |
| סוכרוז | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA | 1 | |
טבלה 1: מאגרי בידוד מיטוכונדריה (עם ובלי BSA) וחיץ מתלה מיטוכונדריה מבודד לשרירי השלד.
| חיץ נשימה | |
| מגיב | ריכוז (mM) |
| KCl | 100 |
| MOPS | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| גלוקוז | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA | 1 |
| BSA ללא חומצות שומן | 0.20% |
| מצעי נשימה | |
| מגיב | ריכוז (mM) |
| פירובט | 200 |
| מלאטה | 200 |
| סוקצינאט | 500 |
| ADP | 100 |
| גלוטמט | 1000 |
טבלה 2: חיץ נשימה ומצעים.
| מדינה 3 | מדינה 4 | RCR | מחקר | מצעים |
| 368.3±80.4 | 69.9±25.0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 מ"מ פירובט, 2 מ"מ מלאט |
| 241.8±22.5 | 26.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 מ"מ פירובט, 2 מ"מ מלאט |
| 285.7±36.5 | 81.9±2.9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 מ"מ סוקצינאט, 4 מיקרומטר רוטנון |
| 493.4±105.4 | 61.3±9.6 | 8.2±2.2 | מחקר נוכחי | 2mM פירובט, 2mM מלאט, 10 mM גלוטמט |
| 559.5±74.9 | 165.2±18.5 | 3.4±0.2 | מחקר נוכחי | 5 מ"מ סוקצינאט, 4 מיקרוגרם/מיקרוליטר רוטנון |
טבלה 3: ערכים השוואתיים של מצב 3, מצב 4 ו- RCR. קיצור: RCR = יחס שליטה נשימתית. ערכי מצב 3 ו-4 מוצגים בערכי nmoles O2/mg protein/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המעבדה הניידת לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה מאפשרת לחוקרים לבודד מיטוכונדריה ולמדוד את קצב הנשימה המיטוכונדריאלית תוך שעתיים מאיסוף הרקמה באתרי שדה מרוחקים. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך שמדידות של נשימה מיטוכונדריאלית שנעשו ב- AU MitoMobile דומות למדידות שנעשו במעבדת מחקר באוניברסיטה. באופן ספציפי, הערכים עבור מצב 3, מצב 4 ו- RCR עבור Mus musculus שמקורו בטבע המוצגים כאן דומים לתוצאות שפורסמו בעבר מאותה מעבדה ואחרות (טבלה 3)12,23. עם זאת, יש לציין כי בשל זני עכברים שונים ושיטות בהן נעשה שימוש, לא ניתן לבצע השוואה ישירה של מחקרים אלה. תוצאות אלה מדגימות הוכחת היתכנות למדידת נשימה מיטוכונדריאלית במעבדה ניידת זו לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית.
כל הכימיקלים והחומרים הדרושים לבידוד מיטוכונדריה ולנשימה ניתנים לשינוע ולאחסון בתוך המעבדה הניידת, מה שמאפשר גישה נוחה בעת הקמה וביצוע ניסויים. בנוסף, מיטוכונדריה מבודדים שנאספו במעבדה מיטוכונדריאלית ניידת מספקים דגימה ייחודית לביצוע מדידות ביוכימיות אחרות כגון פליטת מיני חמצן תגובתי. חשוב לציין, מיטוכונדריה קפואה יכולה להיות מועברת למעבדה נייחת לצורך מדידות ביוכימיות נוספות (למשל, פעילויות אנזימי שרשרת הובלת אלקטרונים בודדים). יש לציין כי בידוד מיטוכונדריה באמצעות התמיינות צנטריפוגה אינו השיטה היחידה למדידת נשימה מיטוכונדריאלית. מעבדות אחרות ביצעו מדידות מוצלחות של נשימה מיטוכונדריאלית עם סיבים חדירים. למרות שכתב היד הנוכחי אינו מתאר שיטה זו (לפרטים נוספים על סיבים חדירים, ראו 24,25,26,27,28), חשוב לקוראים לציין כי מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית יכולה להכיל גם את החומרים הדרושים להליך זה. אנא ראה ביקורות אחרות על נקודות החוזק והחולשה של כל אחת מהשיטות הללו25,29,30.
מספר מעבדות המבצעות מחקר ביואנרגטי מיטוכונדריאלי פרסמו המלצות לפתרון בעיות שהקוראים עשויים למצוא מועילות15,17. עבור כל פרויקט ניסיוני יחיד, יש ליצור אצווה אחת של מאגרים כדי לאסוף את כל הנתונים. שימוש במאגרים המיוצרים בימים שונים יוצר הזדמנות לגיוון בתמיסות כדי להשפיע על מדידות הנשימה במיטוכונדריה. נזק לקרום המיטוכונדריאלי החיצוני יתרחש במהלך תהליך הבידוד; עם זאת, ביצוע נכון של שיטת הבידוד באמצעות אימון מעבדה יכול למזער את הנזק שיתרחש באופן טבעי בהליך זה29,31. במהלך תהליך הבידוד, מיטוכונדריה שאינם מתפקדים או פגומים יתר על המידה מסומנים על ידי גלולה מיטוכונדריאלית לבנה רכה ולא על ידי גלולה חומה קומפקטית. מיטוכונדריה לא פונקציונליים או פגומים יכולים להיגרם על ידי סל"ד מוגזם במהלך הומוגניזציה של הלהב, הומוגניזציה במשך זמן רב מדי, הוספת פרוטאז או עיכול במשך זמן רב מדי, או משיכות רבות מדי בשימוש במהלך ההשעיה הסופית של המיטוכונדריה.
יתר על כן, הבחירה איזה שריר לבודד וכמה שריר משמש ישפיע על תפוקת המיטוכונדריה. לדוגמה, בבעל חיים עם צפיפות מיטוכונדריאלית גבוהה יותר, כמו ציפור21, יותר מיטוכונדריה יואצו בהשוואה לתערובת של סוגי סיבי שריר השלד מגפה אחורית של חולדה. זה גם ישנה את כמות הרקמה הדרושה לבידוד מוצלח. ככל שצפיפות המיטוכונדריה ברקמה גדולה יותר, כך כמות הרקמה הדרושה לבידוד מוצלח נמוכה יותר. החוקרים צריכים גם לשקול את נפח תמיסת מניטול-סוכרוז שנוספה למיטוכונדריה המבודדת הסופית. כדורית מיטוכונדריאלית צפופה יותר תזדקק לדילול גבוה יותר, בעוד שכדורית מיטוכונדריאלית צפופה פחות תזדקק לדילול נמוך יותר. מידת הדילול תהיה תלויה בבעל החיים, באופי החמצוני של שריר השלד המבודד, ובמידת הצפיפות של הגלולה המיטוכונדריאלית.
הספק חשמלי מספיק כדי לתמוך בכל הציוד הדרוש לאיסוף נתונים במעבדה ניידת יכול להיות מאתגר. יש לציין כי הצנטריפוגה בקירור שואבת זרם גבוה במהלך הפעולה (במיוחד בשלבים הראשונים של הקירור). לכן, יש לשקול במיוחד כי התפוקה החשמלית של הרכב תואמת את הביקוש החשמלי של הציוד הדרוש להפעלה בו זמנית. המלצה שיכולה לפתור מגבלה זו היא הוספת מקורות חשמל נוספים (למשל, סוללות נוספות, גנרטורים נוספים). יש לציין כי השיטה למדידת נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות סיבים חדירים אינה דורשת שימוש בצנטריפוגה מקוררת ויכולה גם לספק פתרון למקור הכוח המוגבל. יש לקחת בחשבון גם את תנאי הסביבה ואיכות הכביש בשימוש במעבדה ניידת. המעבדה הניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שנדונה כאן נהגה בהצלחה בכבישים בין-מדינתיים עם מזג אוויר בהיר. דרכי עפר עם מזג אוויר קשה יציגו קושי גדול יותר בהסעת הרכב למקום המעניין. למרות שבידוד מיטוכונדריאלי אינו שיטה חדשנית, השימוש בו במעבדה ניידת מספק דרך ייחודית לכמת אנרגטיקה מיטוכונדריאלית בבעלי חיים חופשיים. זה יכול להיות קריטי בהבהרת ההבדלים בין חיות מעבדה לחיות בר32,33,34. בנוסף, המעבדה הניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית מאפשרת לחוקרים לחקור אילוצים אנרגטיים וקיצוניות אנרגטית הנמצאים בקרב בעלי חיים בעולם הטבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
המחברים מודים למארק נלמס וג'ון טננט מהמחלקה להנדסת חשמל ומחשבים במכללת סמואל גין להנדסה באוניברסיטת אובורן על עזרתם בציוד המבני והחשמלי של AU MitoMobile. בנוסף, המחברים מודים על המימון להלבשת AU MitoMobile ומחקר ממענק הפרסים הנשיאותיים של אוניברסיטת אובורן למחקר בינתחומי (PAIR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
