Summary
Nous avons conçu et construit un laboratoire mobile pour mesurer les taux de respiration dans les mitochondries isolées d’animaux sauvages capturés sur le terrain. Nous décrivons ici la conception et l’aménagement d’un laboratoire mitochondrial mobile et les protocoles de laboratoire associés.
Abstract
L’énergétique mitochondriale est un thème central de la biochimie et de la physiologie animales, les chercheurs utilisant la respiration mitochondriale comme mesure pour étudier la capacité métabolique. Pour obtenir les mesures de la respiration mitochondriale, des échantillons biologiques frais doivent être utilisés et l’ensemble de la procédure de laboratoire doit être terminée dans un délai d’environ 2 heures. De plus, plusieurs pièces d’équipement spécialisé sont nécessaires pour effectuer ces tests de laboratoire. Cela crée un défi pour la mesure de la respiration mitochondriale dans les tissus d’animaux sauvages vivant loin des laboratoires de physiologie, car les tissus vivants ne peuvent pas être conservés très longtemps après le prélèvement sur le terrain. De plus, le transport d’animaux vivants sur de longues distances induit un stress, qui peut altérer l’énergétique mitochondriale.
Ce manuscrit présente le MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU), un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale qui peut être emmené sur le terrain et utilisé sur place pour mesurer le métabolisme mitochondrial dans des tissus prélevés sur des animaux sauvages. Les caractéristiques de base du laboratoire mobile et les méthodes étape par étape pour mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont présentées. De plus, les données présentées valident le succès de l’équipement du laboratoire mobile de physiologie mitochondriale et de la réalisation de mesures de la respiration mitochondriale. La nouveauté du laboratoire mobile réside dans la possibilité de se rendre sur le terrain et d’effectuer des mesures mitochondriales sur les tissus d’animaux capturés sur place.
Introduction
À ce jour, les études conçues pour mesurer l’énergie mitochondriale ont été limitées aux animaux de laboratoire ou aux animaux capturés à proximité de laboratoires de physiologie établis, ce qui a empêché les scientifiques d’effectuer des études bioénergétiques mitochondriales dans des tissus prélevés sur des animaux au cours d’activités telles que la migration, la plongée et l’hibernation 1,2,3,4,5,6 . Bien que de nombreux chercheurs aient réussi à mesurer les taux métaboliques de base et de pointe et les dépenses énergétiques quotidiennes des animaux sauvages7,8, la capacité des chercheurs à mesurer la performance des mitochondries est restée limitée (mais voir 1,4,9). Cela est dû en partie au besoin de tissus frais pour isoler les mitochondries et d’une installation de laboratoire pour effectuer les isolements dans les 2 heures environ suivant l’obtention du tissu frais. Une fois les mitochondries isolées, les mesures de la respiration mitochondriale doivent également être effectuées dans un délai de ~1 h.
Les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont généralement effectuées en mesurant la concentration d’oxygène dans un récipient scellé connecté à une électrode Clark. La théorie qui sous-tend cette méthode est fondée sur l’observation fondamentale que l’oxygène est le dernier accepteur d’électrons de la respiration mitochondriale pendant la phosphorylation oxydative. Par conséquent, lorsque la concentration d’oxygène diminue au cours d’une expérience, on suppose que la production d’adénosine triphosphate (ATP) se produit10. L’oxygène consommé est un indicateur de l’ATP produit. Les chercheurs peuvent créer des conditions expérimentales spécifiques en utilisant différents substrats et initier une respiration stimulée par l’adénosine diphosphate (ADP) (état 3) en ajoutant des quantités prédéterminées d’ADP dans la chambre. Suite à la phosphorylation de l’ADP exogène en ATP, le taux de consommation d’oxygène diminue, et l’état 4 est atteint et peut être mesuré. De plus, l’ajout d’inhibiteurs spécifiques permet d’obtenir des informations sur la respiration par fuite et la respiration non couplée10. Le rapport entre l’état 3 et l’état 4 détermine le rapport de contrôle respiratoire (RCR), qui est l’indicateur du couplage mitochondrial global10,11. Des valeurs plus faibles de RCR indiquent un dysfonctionnement mitochondrial global, tandis que des valeurs de RCR plus élevées suggèrent une plus grande étendue de couplage mitochondrial10.
Comme indiqué précédemment, le prélèvement de matériel biologique, l’isolement mitochondrial et la mesure de la fréquence respiratoire doivent être effectués dans les 2 heures suivant l’obtention du tissu. Pour accomplir cette tâche sans transporter les animaux sur de grandes distances vers des laboratoires établis, un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale a été construit pour être transporté sur le terrain où ces données peuvent être recueillies. Un véhicule récréatif Jayco Redhawk 2018 a été converti en laboratoire mobile de physiologie moléculaire et nommé MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU) (figure 1A). Un véhicule récréatif a été choisi en raison du réfrigérateur, du congélateur, du réservoir de stockage d’eau et de la plomberie intégrés, de l’électricité alimentée par des batteries de 12 volts, de la génératrice de gaz, du réservoir de propane et du système d’autonivellement. De plus, le véhicule récréatif permet de passer la nuit sur des sites éloignés pour recueillir des données. L’avant du véhicule n’a pas été modifié et sert de poste de conduite et de couchage (figure 1B). Les commodités de la chambre à coucher (lit, téléviseur et armoire) précédemment installées à l’arrière du véhicule et sur la cuisinière ont été retirées.
Des étagères en acier inoxydable sur mesure et un comptoir en quartz sur mesure soutenu par un cadre en aluminium 80/20 ont été installés à la place des commodités de la chambre et de la cuisinière (figure 1C). Les paillasses de laboratoire offrent un espace suffisant pour la collecte de données (figure 1D). La consommation d’énergie de chaque pièce d’équipement (c’est-à-dire la centrifugeuse réfrigérée, les chambres de respiration mitochondriale, les lecteurs de plaques, les ordinateurs, les homogénéisateurs, les balances, l’ultra-congélateur portatif et d’autres fournitures de laboratoire générales) a été prise en considération. Pour répondre aux exigences élevées de tension et de courant de la centrifugeuse, le système électrique a été mis à niveau pour devenir un équipement de qualité aéronautique. Un compartiment externe à l’arrière du véhicule a été converti en baie de stockage d’azote liquide, ce qui répond aux directives du ministère des Transports des États-Unis pour le stockage et le transport de l’azote liquide. Cette unité de stockage a été construite en acier inoxydable et dispose d’une ventilation appropriée pour empêcher toute fuite d’azote gazeux en expansion dans l’habitacle du véhicule.
Pour confirmer que le laboratoire mobile peut être utilisé dans des études bioénergétiques mitochondriales, les mitochondries ont été isolées et les taux de respiration mitochondriale des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris domestiques sauvages (Mus musculus) ont été mesurés. Parce que Mus musculus est un organisme modèle, les taux de respiration mitochondriale de cette espèce sont bien établis12,13,14. Bien que des études antérieures aient documenté l’isolement mitochondrial par centrifugation différentielle15,16,17, un bref aperçu des méthodes utilisées dans les méthodes mobiles de laboratoire de physiologie mitochondriale est décrit ci-dessous.
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Protocol
Les sections suivantes décrivent les méthodes de laboratoire mitochondriales. Toutes les procédures de manipulation des animaux et de prélèvement de tissus ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’Auburn (#2019-3582).
1. Description des tampons utilisés pour la collecte des données
REMARQUE : Ces tampons peuvent être préparés dans un laboratoire fixe et déplacés vers le laboratoire mobile avant l’excursion sur le terrain (sauf indication contraire ci-dessous).
- Préparer le tampon d’isolement mitochondrial du muscle squelettique avec de l’albumine sérique bovine (BSA), comme indiqué dans le tableau 1.
- Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90 % en volume), à l’exception du BSA sans acides gras. Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
- Ajustez la solution à un pH de 7,5 tout en maintenant la température à 4 °C.
- Ajoutez le BSA sans acides gras et augmentez le volume à 100%. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez le tampon d’isolement mitochondrial du muscle squelettique sans BSA, comme indiqué dans le tableau 1.
- Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% du volume). Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
- Ajustez la solution à un pH de 7,5 tout en maintenant la température à 4 °C.
- Augmentez le volume à 100 %. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez le tampon de remise en suspension des muscles squelettiques comme indiqué dans le tableau 1.
- Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% du volume). Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
- Ajustez la solution à un pH de 7,4 tout en maintenant la température à 4 °C.
- Augmentez le volume à 100 %. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez le tampon de respiration des muscles squelettiques comme indiqué dans le tableau 2.
- Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% en volume) à l’exception du BSA sans acides gras. Chauffez le tampon jusqu’à ce que la température atteigne 37 °C.
- Ajustez la solution à un pH de 7,0 tout en maintenant la température à 37 °C.
- Ajoutez le BSA sans acides gras et augmentez le volume à 100%. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez les substrats respiratoires comme indiqué dans le tableau 2.
- S’assurer que ces substrats sont frais le jour de la collecte des données dans 100 mM de Tris-HCl, pH 7,4. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
REMARQUE : Les valeurs fournies sont pour obtenir une solution suffisamment concentrée pour qu’un substrat suffisant soit absorbé par les mitochondries. Les concentrations finales des substrats sont de 2 mM de pyruvate, 2 mM de malate, 10 mM de glutamate et 5 mM de succinate.
- S’assurer que ces substrats sont frais le jour de la collecte des données dans 100 mM de Tris-HCl, pH 7,4. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
2. Réalisation de l’isolement mitochondrial (Figure 2)
REMARQUE : L’isolement mitochondrial et les mesures de la respiration mitochondriale sont effectués dans la zone de la paillasse du laboratoire mobile, et toutes les solutions doivent être conservées à 4 °C, sauf indication contraire.
- Garez le laboratoire mobile sur un terrain plat. Allumez le générateur et mettez le véhicule à niveau. Déployez la glissière et installez l’équipement.
- Décongeler les quantités désirées de tampons.
REMARQUE : En règle générale, 30 mL de tampon d’isolement des muscles squelettiques et 10 mL de tampon d’isolation des muscles squelettiques sans BSA sont nécessaires par muscle. - Installez et calibrez les chambres de respiration mitochondriale à la température souhaitée des expériences et à la pression barométrique actuelle selon les instructions du fabricant. Voir le tableau des matériaux pour les chambres spécifiques utilisées dans les expériences.
- Euthanasier l’animal par décapitation.
REMARQUE : La présente étude a utilisé la décapitation pour l’euthanasie. Certains gaz, tels que le dioxyde de carbone et l’isoflurane, affectent la fonction mitochondriale18,19,20 ; Ces effets doivent être pris en compte lors du choix de la meilleure méthode d’euthanasie pour chaque étude. La méthode à appliquer pour chaque étude sera déterminée par la question scientifique posée. - Exciser le muscle squelettique, couper rapidement la graisse et le tissu conjonctif, peser et placer le muscle dans un tampon d’isolement du muscle squelettique avec du BSA (au moins 1/10 p/v) (par exemple, 1 g de muscle squelettique pour 10 mL de tampon).
- Hachez le muscle squelettique avec des ciseaux sur de la glace.
- Transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 5 ml. Homogénéisez-le à l’aide d’une lame (voir le tableau des matériaux) à 50% de puissance pendant 5 s. Ajouter la protéase (5 mg/g de muscle humide) et digérer pendant 7 min, en mélangeant la solution toutes les 30 s. Terminez la réaction en ajoutant un volume égal de tampon d’isolement avec BSA.
- Centrifuger l’homogénat à 500 × g pendant 10 min. Transvaser le surnageant à travers une étamine à double couche à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 5 ml dans un tube à centrifuger propre de 50 ml. Centrifuger le surnageant à 3 500 × g pendant 10 min pour précipiter une pastille mitochondriale brune.
- Versez le surnageant restant. Ajoutez le même volume de tampon d’isolement avec BSA dans le tube de centrifugation. Remettez en suspension la pastille mitochondriale à l’aide d’un grattoir flexible (policier) en faisant glisser doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger. Centrifuger à 3 500 × g pendant 10 min.
- Versez le surnageant restant. Ajoutez le même volume de tampon d’isolement sans BSA dans le tube de centrifugation. Remettez la pastille mitochondriale en suspension en la faisant sortir doucement des parois du tube de centrifugation avec un policier propre. Centrifuger à 3 500 × g pendant 10 min.
- Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille mitochondriale dans un tampon de remise en suspension en travaillant doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger avec un policier propre.
REMARQUE : Le volume du tampon de remise en suspension dépendra de la taille de la pastille de mitochondries. - Transférez les mitochondries remises en suspension dans un homogénéisateur Dounce à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 mL. À l’aide de l’homogénéisateur Dounce, homogénéisez soigneusement la suspension en 4 à 5 passages.
- Placer la suspension mitochondriale dans un tube de microcentrifugation étiqueté de 2 mL à l’aide d’un autre embout de pipette coupé de 1 mL.
3. Mesures de la respiration mitochondriale (Figure 3)
- Substrats complexes I
- Ajouter 945 μL de tampon respiratoire dans la chambre. Assurez-vous que l’agitateur tourne et que la température tampon est maintenue à 37 °C. Lancez l’enregistrement de la collecte de données.
- Une fois que la concentration d’oxygène s’est stabilisée, ajoutez 20 μL de mitochondries et placez le couvercle sur la chambre. Dans le logiciel, indiquez que des mitochondries ont été ajoutées à la chambre.
- Ajouter 10 μL de glutamate 1 M, 10 μL de malate 200 mM et 10 μL de pyruvate 200 mM dans la chambre avec des seringues individuelles et attendre que le signal se stabilise. Dans le logiciel, indiquez que des substrats ont été ajoutés.
REMARQUE : Ces substrats sont généralement utilisés pour mesurer la respiration induite par les glucides. Pour d’autres combinaisons de substrats à utiliser pour mesurer la respiration induite par les graisses, voir21. - Ajouter 5 μL d’ADP à l’aide d’une seringue séparée et observer la consommation rapide d’oxygène (état 3). Dans le logiciel, indiquez qu’ADP a été ajouté.
REMARQUE : Après la phosphorylation de l’ADP ajouté, le taux de consommation d’oxygène plafonnera à l’état 4. - Après 4 min de collecte des données de l’état 4, terminez l’enregistrement. Enregistrez le fichier de données.
- Substrats complexes II
- Ajouter 963 μL de tampon respiratoire dans la chambre. Assurez-vous que l’agitateur tourne et que la température tampon est maintenue à 37 °C. Lancez l’enregistrement de la collecte de données.
- Une fois la concentration d’oxygène stabilisée, ajoutez 20 μL de mitochondries et placez le couvercle sur la chambre. Dans le logiciel, indiquez que des mitochondries ont été ajoutées à la solution.
- Ajouter 2 μL de roténone à 4 μg/μL puis 10 μL de succinate à 500 mM dans la chambre à l’aide de seringues séparées et attendre que le signal se stabilise. Dans le logiciel, indiquez que des substrats ont été ajoutés.
- Ajouter 5 μL d’ADP à l’aide d’une seringue séparée et observer la consommation rapide d’oxygène (état 3). Dans le logiciel, indiquez qu’ADP a été ajouté.
REMARQUE : Après la phosphorylation de l’ADP ajouté, le taux de consommation d’oxygène plafonnera à l’état 4. - Après 4 min de collecte des données de l’état 4, terminez l’enregistrement. Enregistrez le fichier de données.
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Representative Results
Le présent manuscrit a étudié la respiration mitochondriale de Mus musculus d’origine sauvage (n = 7, mâle = 5, femelle = 2 ; âge = 1,30 ± 0,2 ans) dans un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale (Figure 1). Pour mesurer la respiration mitochondriale des muscles squelettiques, l’ensemble du membre postérieur, donc les muscles aérobies et anaérobies, a été utilisé pour l’isolement mitochondrial (Figure 2). Des exemples de données brutes sur la respiration mitochondriale sont présentés à la figure 3. La figure 3A et la figure 3B représentent la respiration mitochondriale complexe induite par l’I. La pente raide observée sur la figure 3A représente la fréquence respiratoire maximale élevée. Il s’agit de la valeur utilisée pour une analyse ultérieure des données. L’isolement réussi des mitochondries du muscle squelettique du membre postérieur est observé par le virage serré et la stabilisation d’une nouvelle pente, qui détermine l’état 4 (Figure 3B).
Ces données peuvent également être interprétées comme le fait que les mitochondries fonctionnent haut en raison du virage serré pour établir l’état 4. Un schéma similaire peut être observé pour la respiration mitochondriale complexe induite par II (Figure 3C et Figure 3D). Les figures 3E, F montrent un mauvais fonctionnement des mitochondries, soit en raison de la physiologie mitochondriale, soit d’une respiration mitochondriale infructueuse. La figure 3E montre le couplage des mitochondries pour la respiration mitochondriale complexe induite par l’I, comme le montre le passage à l’état 4. Cependant, la figure 3F montre la respiration mitochondriale non couplée du complexe II, comme le démontre une ligne plate après l’ajout d’ADP, et aucun « tour » pour produire des données sur l’état 4. Ces données suggèrent d’éventuels problèmes lors de l’isolement mitochondrial, qui sont discutés ci-dessous.
Les valeurs numériques de l’état 3, de l’état 4 et du RCR pour les complexes I et II de ces animaux se trouvent à la figure 4. Ces données ont été déterminées en mesurant 30 s de la pente la plus raide après l’ajout de l’ADP pour déterminer l’état 3 (figure 3A, C) et en mesurant la pente après le « virage » pendant 1 min pour mesurer l’état 4 (figure 3B, D). Une fois ces valeurs obtenues, les données ont été normalisées en fonction de la teneur en protéines (test de Bradford22). À l’aide des valeurs normalisées, le RCR a été calculé en divisant la valeur de l’état normalisé 3 par la valeur de l’état normalisé 4.
Figure 1 : La MitoMobile de l’UA, un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale. (A) L’extérieur de l’UA MitoMobile. (B) L’intérieur du véhicule regardant l’avant où aucun changement n’a été apporté. (C) L’arrière du véhicule montrant l’installation des bancs, des compartiments de rangement et de la centrifugeuse. (D) La configuration de l’équipement pendant la collecte des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Isolement mitochondrial et procédure de mesure de la respiration dans le muscle squelettique. (1) Le tissu est disséqué de l’animal et placé dans un tampon où il est (2) haché, homogénéisé, traité avec de la protéase et soumis à une centrifugation jusqu’à l’obtention de la pastille mitochondriale. (3) La pastille de mitochondries est remise en suspension et des données respiratoires sont obtenues. (4) Les données de consommation d’oxygène peuvent être utilisées pour calculer l’état 3, l’état 4 et le RCR. Abréviation : RCR = rapport de contrôle respiratoire. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mesures de la respiration mitochondriale avec des substrats complexes I et II. Consommation d’oxygène avec des substrats complexes I, mettant en évidence l’analyse de pente de l’état 3 (A) et de l’état 4 (B). Consommation d’oxygène avec des substrats complexes II, mettant en évidence l’analyse de pente de l’état 3 (C) et de l’état 4 (D). Une respiration mitochondriale sous-optimale peut être observée dans la respiration complexe dirigée par I (E) et la respiration complexe dirigée par II (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Données recueillies sur des souris domestiques (Mus musculus) dans la MitoMobile de l’UA. L’isolement mitochondrial et la respiration ont été effectués à l’aide de la procédure décrite ici. Le pyruvate, le malate et le glutamate ont été utilisés pour déterminer les taux de respiration du complexe I. Le succinate et la roténone ont été utilisés pour mesurer les fréquences respiratoires du complexe II. (A) Mesures de l’état 3 du complexe I, (B) mesures de l’état 4 du complexe I, (C) RCR du complexe I, (D) mesures de l’état 3 du complexe II, (E) mesures de l’état 4 du complexe II et (F) RCR du complexe II. Abréviation : RCR = rapport de contrôle respiratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Tampon d’isolement des mitochondries pour le muscle squelettique | ||
| Réactif | avec BSA, concentration (mM) | sans BSA, concentration (mM) |
| Kcl | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| Tris-Base | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA (en anglais seulement) | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| BSA sans acides gras | 0.15% | - |
| Tampon de resuspension mitochondriale isolé pour muscle squelettique | ||
| Réactif | Concentration (mM) | |
| Mannitol | 220 | |
| Saccharose | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA (en anglais seulement) | 1 | |
Tableau 1 : Tampons d’isolement des mitochondries (avec et sans BSA) et tampon de remise en suspension des mitochondries isolés pour le muscle squelettique.
| Tampon respiratoire | |
| Réactif | Concentration (mM) |
| Kcl | 100 |
| VADROUILLES | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Glucose | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA (en anglais seulement) | 1 |
| BSA sans acides gras | 0.20% |
| Substrats respiratoires | |
| Réactif | Concentration (mM) |
| Pyruvate | 200 |
| Malate | 200 |
| Succinate | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamate | 1000 |
Tableau 2 : Tampon respiratoire et substrats.
| État 3 | État 4 | RCR (en anglais seulement) | Étudier | Substrats |
| 368,3±80,4 | 68,9±25,0 | 5,8±1,6 | 12 | 2 mM de pyruvate, 2 mM de malate |
| 241,8±22,5 | 28,9±3,2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM de pyruvate, 2 mM de malate |
| 285,7±36,5 | 81,9±2,9 | 3,5±1,0 | 23 | 10 mM de succinate, 4 μM de roténone |
| 493,4±105,4 | 61,3±9,6 | 8.2±2.2 | Étude en cours | 2 mM de pyruvate, 2 mM de malate, 10 mM de glutamate |
| 559,5±74,9 | 165,2±18,5 | 3,4±0,2 | Étude en cours | 5 mM de succinate, 4 μg/μL de roténone |
Tableau 3 : Valeurs comparatives de l’état 3, de l’état 4 et du RCR. Abréviation : RCR = rapport de contrôle respiratoire. Les valeurs de l’état 3 et de l’état 4 sont indiquées en nmoles O2/mg de protéines/min.
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Discussion
Le laboratoire mobile de physiologie mitochondriale permet aux chercheurs d’isoler les mitochondries et de mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales dans les 2 heures suivant le prélèvement de tissus sur des sites de terrain éloignés. Les résultats présentés ici suggèrent que les mesures de la respiration mitochondriale effectuées dans l’UA MitoMobile sont comparables aux mesures effectuées dans un laboratoire de recherche universitaire. Plus précisément, les valeurs pour l’état 3, l’état 4 et le RCR pour Mus musculus d’origine sauvage présentées ici sont comparables aux résultats publiés précédemment par le même laboratoire et d’autres (tableau 3)12,23. Cependant, il convient de noter qu’en raison des différentes souches de souris et des méthodes utilisées, une comparaison directe de ces études ne peut être faite. Ces résultats démontrent une preuve de concept pour la mesure de la respiration mitochondriale dans ce laboratoire mobile de physiologie mitochondriale.
Tous les produits chimiques et matériaux nécessaires à l’isolement des mitochondries et à la respiration peuvent être transportés et stockés dans le laboratoire mobile, ce qui facilite l’accès lors de la mise en place et de la réalisation d’expériences. De plus, des mitochondries isolées recueillies dans un laboratoire mitochondrial mobile fournissent un échantillon unique pour effectuer d’autres mesures biochimiques telles que l’émission d’espèces réactives de l’oxygène. Il est important de noter que les mitochondries congelées peuvent être transportées vers un laboratoire fixe pour des mesures biochimiques supplémentaires (par exemple, les activités enzymatiques individuelles de la chaîne de transport d’électrons). Notamment, l’isolement des mitochondries par différenciation par centrifugation n’est pas la seule méthode pour mesurer la respiration mitochondriale. D’autres laboratoires ont effectué avec succès des mesures de la respiration mitochondriale avec des fibres perméabilisées. Bien que le manuscrit actuel ne décrive pas cette méthode (pour plus de détails sur les fibres perméabilisées, voir 24,25,26,27,28), il est important pour les lecteurs de noter qu’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pourrait également abriter le matériel nécessaire à cette procédure. Veuillez consulter d’autres critiques sur les forces et les faiblesses de chacune de ces méthodes25,29,30.
Plusieurs laboratoires effectuant des recherches en bioénergétique mitochondriale ont publié des recommandations de dépannage que les lecteurs peuvent trouver utiles15,17. Pour tout projet expérimental, un seul lot de tampons doit être constitué pour collecter toutes les données. L’utilisation de tampons fabriqués à des jours différents crée la possibilité de faire varier les solutions pour avoir un impact sur les mesures de la respiration mitochondriale. Des dommages à la membrane mitochondriale externe se produiront pendant le processus d’isolement ; Cependant, l’exécution correcte de la méthode d’isolement par le biais d’une formation en laboratoire peut minimiser les dommages qui se produiront naturellement avec cette procédure29,31. Pendant le processus d’isolement, les mitochondries non fonctionnelles ou trop endommagées sont indiquées par une pastille mitochondriale blanche et duveteuse plutôt que par une pastille brune compacte. Les mitochondries non fonctionnelles ou endommagées peuvent être causées par un régime excessif lors de l’homogénéisation des lames, une homogénéisation trop longue, l’ajout d’une trop grande quantité de protéase ou une digestion trop longue, ou un trop grand nombre de coups utilisés lors de la remise en suspension finale des mitochondries.
De plus, le choix du muscle à isoler et de la quantité de muscle utilisée affectera le rendement mitochondrial. Par exemple, chez un animal ayant une densité mitochondriale plus élevée, comme un oiseau21, plus de mitochondries seront précipitées par rapport à un mélange de types de fibres musculaires squelettiques provenant d’un membre postérieur d’un rat. Cela modifiera également la quantité de tissu nécessaire pour réussir l’isolement. Plus la densité mitochondriale dans un tissu est élevée, plus la quantité de tissu nécessaire pour réussir l’isolement est faible. Les chercheurs doivent également tenir compte du volume de solution de mannitol-saccharose ajouté aux mitochondries isolées finales. Une pastille mitochondriale plus dense aura besoin d’une dilution plus élevée, tandis qu’une pastille mitochondriale moins dense aura besoin d’une dilution plus faible. L’étendue de la dilution dépendra de l’animal, de la nature oxydative du muscle squelettique isolé et de la densité de la pastille mitochondriale.
Il peut être difficile de disposer d’une alimentation électrique suffisante pour prendre en charge tout l’équipement nécessaire à la collecte de données dans un laboratoire mobile. Notamment, la centrifugeuse réfrigérée consomme un courant élevé pendant le fonctionnement (en particulier pendant les phases initiales de refroidissement). Par conséquent, des considérations particulières doivent être prises pour s’assurer que la puissance électrique du véhicule correspond à la demande électrique de l’équipement nécessaire pour fonctionner simultanément. Une recommandation qui pourrait résoudre cette limitation est l’ajout de sources d’énergie supplémentaires (p. ex., des batteries supplémentaires, des génératrices supplémentaires). Notamment, la méthode de mesure de la respiration mitochondriale avec des fibres perméabilisées ne nécessite pas l’utilisation d’une centrifugeuse réfrigérée et pourrait également fournir une solution à la source d’énergie limitée. Les conditions environnementales et la qualité des routes doivent également être prises en compte dans l’utilisation d’un laboratoire mobile. Le laboratoire mobile de physiologie mitochondriale dont il est question ici a été conduit avec succès sur des routes inter-États par temps clair. Les chemins de terre avec des conditions météorologiques difficiles présenteront une plus grande difficulté à conduire le véhicule à l’endroit d’intérêt. Bien que l’isolement mitochondrial ne soit pas une méthode nouvelle, son utilisation dans un laboratoire mobile offre un moyen unique de quantifier l’énergie mitochondriale chez les animaux libres. Cela peut être essentiel pour élucider les différences entre les animaux de laboratoire et les animaux sauvages32,33,34. De plus, le laboratoire mobile de physiologie mitochondriale permet aux chercheurs d’étudier les contraintes énergétiques et les extrêmes énergétiques que l’on trouve chez les animaux dans le monde naturel.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Mark Nelms et John Tennant du département de génie électrique et informatique du Samuel Ginn College of Engineering de l’Université d’Auburn pour leur aide dans l’équipement structurel et électrique de l’AU MitoMobile. De plus, les auteurs reconnaissent le financement pour équiper l’UA MitoMobile et la recherche d’une subvention de l’Université d’Auburn pour les prix présidentiels pour la recherche interdisciplinaire (PAIR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
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