Summary
I denne artikel beskrives metoden til mitokondrietidsfordærv billeddannelse af astrocytkulturer udstyret med MitoTimer biosensor og den resulterende multiparametriske analyse af mitokondriedynamik, mobilitet, morfologi, biogenese, redox-tilstand og omsætning.
Abstract
Mens meget opmærksomhed er blevet givet til mitokondrie ændringer på neuronalt niveau, viser de seneste beviser, at mitokondrie dynamik og funktion i astrocytter er impliceret i kognition. I denne artikel beskrives metoden til time-lapse imaging af astrocytkulturer udstyret med en mitokondriebiosensor: MitoTimer. MitoTimer er et kraftfuldt og unikt værktøj til at vurdere mitokondriedynamik, mobilitet, morfologi, biogenese og redox-tilstand. Her præsenteres de forskellige procedurer for kultur, billedopkøb og efterfølgende mitokondrieanalyse.
Introduction
Astrocytter er kritiske aktører i vedligeholdelsen af hjernen homøostase. De er måske mest kendt for at have betydelige strukturelle roller i hjernen, som en del af blod - hjerne barrieren1 og ved at støtte neuroner og synapser i hele hjernen2. Astrocyt støtte af neuroner er både strukturelle3 og metaboliske4,5, med astrocytter fremme neurogenese og synaptogenese samtidig give centrale metabolitter som laktat til aktive neuroner4,6,7. Ud over den rolle, strukturstøtte, astrocytter er aktive celler, der deltager i Ca2 + signalering og buffering (herunder spontan mitokondrie Ca2 + tilstrømning)8,9, K+ buffering10, og kan tilpasse sig og reagere på behovene i hjernen i tider med skade11,12 . Som sådanne dynamiske celler har astrocytter robuste energibehov, hvilket kræver et effektivt mitokondrienetværk. Disse mitokondrier har også en afgørende rolle i buffering overdreven reaktiv ilt arter (ROS)13. Ud over deres individuelle eller lokale roller energiproduktion og ROS buffering, mitokondrier fungere som et netværk14. I denne forstand opretholder de ligevægt mellem fissioning og fusion mitokondrier, der repræsenterer nye / reducerede mitokondrier og ældre / oxideret mitokondrier, henholdsvis15. Den samlede redox tilstand af en celle kan måles ved redox tilstand mitokondrie netværk. I patologi er dette et kritisk stykke information, der kan kaste lys over, hvilke celler der muligvis ikke fungerer optimalt.
I de senere år er mange sensorer blevet udviklet til at studere dynamikken og funktionerne i mitokondrier i celler. For eksempel anvendes sensorer, der måler energiudveksling (ATP), redox-tilstand (NADH /NAD+, ROS) og enzymatisk funktionalitet (cAMP, Ca2+, Zn2+) i øjeblikket i studiet af mitokondriefunktion16. Blandt dem tillader MitoTimer at følge ændringerne i mitokondriemorfologi (størrelse, form, overfladeareal), mobilitet (hastighed, forskydning) og dynamik (fusions- og fissionshændelser) samt den samlede mitokondrieomsætning og redox-tilstand. MitoTimer er en mutant rød fluorescerende protein, drFP58317, med et mitokondrie signal fra underenhed VIII af human cytochrome c oxidase18,19 at visualisere nyligt syntetiseret mitokondrier i grøn (488 nm) og oxideret mitokondrier i rødt (555 nm). Ved hjælp af den grønne (488 nm) og rød (555 nm) fluorescens ratio tillader samtidig evaluering af individuelle mitokondrier, deres morfologi analyse, fusion / fission begivenheder, og redox tilstand historie20,21. Denne unikke egenskab kan bruges til at undersøge mange videnskabelige spørgsmål vedrørende mitokondrier fysiologiske og patologiske roller og er derfor meget lovende for at afsløre de underliggende mekanismer i mitokondrie dynamik inden for mange forskellige celletyper.
Vi har for nylig udviklet en ny lentiviral vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, herefter kaldet LV-G1-MitoTimer) til at studere mitokondrier dynamik og funktioner specielt i astrocytter in vitro og in vivo22. LV-G1-MitoTimer bruger en afkortet version af glialflimmersyreprotein (GFAP) promotor gfaABC1D, med en B3 forstærker (gfaABC1D(B3), herefter kaldet G1) kombineret med den tidligere beskrevne miR124T neuronal detargeting system23. Det giver eksklusivt udtryk for mitokondriebiosensoren i astrocytter in vitro og in vivo22. Præsenteret her er de forskellige trin til at udføre en kultur af rotte hippocampal astrocytter og udstyre dem med LV-G1-MitoTimer biosensor, samt de forskellige mikroskopi trin til at følge adfærd astrocyt mitokondrier i flere på hinanden følgende timer / dage.
Protocol
Denne protokol er blevet udarbejdet med godkendelse fra et etisk udvalg (aftale VD3602, Lausanne, Schweiz) og følger europæiske retningslinjer for brug af dyr.
1. Rat hippocampal astrocyt primær kultur
- Ofre fem rotte hvalpe (Wistar IGS Rat) ved halshugning på postnatal dag 1-2.
- Fjern hjernen og opbevar den i en petriskål, der indeholder 5 mL frisk astrocyt medium (DMEM med GlutaMAX suppleret med 1% Penicillin/Streptomycin og 10% frisk Hesteserum).
- Isoler hippocampus. Dissociate i 5 mL af astrocytic medium med tre passager gennem en 21 G nål og tre passager gennem en 25 G nål.
- Overfør de dissocierede celler til et 15 mL centrifugerør og tæl i et hæmocytometer.
- Plade 20.000-25.000 celler/cm2 i multiwell retter (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) og opbevar dem ved 37 °C under en atmosfære, der indeholder 5% CO2 for resten af forsøget.
- Udskift mediet helt efter 3 dages in vitro (DIV3).
- Ved DIV8 tilsættes 0,6 pg p24 antigen pr. celle af lentiviral vektorkodning til mitokondriebiosensor MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22),fortyndet i fosfatbuffered saltvand (PBS + 0,01% BSA).
- Ved DIV9 vaskes der med forvarmet 1x steril PBS (37 °C) og tilsættes frisk astrocyt medium.
- Ved DIV11 skal du udføre 2 vaske med forvarmet 1x steril PBS (37 °C) og tilsættes frisk astrocyt medium uden phenol rød.
BEMÆRK: Valg af belægning afhænger af den påtænkte analyse. Som standardbelægning for astrocyt primær kultur anbefales det at bruge 0,2 mg/mL poly-D-lysin eller 8,7 μg/cm2 kældermembranmatrix (f.eks. Matrigel). For at visualisere astrocytternes mitokondriesystem er det vigtigt at arbejde på flade og strakte celler. I denne sammenhæng er kombinationen af kældermembranmatrix på IBIDI u-slides den mest egnede. Det er også afgørende ikke at arbejde med phenol rød, som er giftig for cellen under gentagen udsættelse for lys.
2. Langsigtet overvågning af mitokondriesystemet.
- Vurder det astrocytiske mitokondriesystem mindst 3-5 dage efter lentiviralinfektioner med LV-G1-MitoTimer (for at give et tilstrækkeligt fluorescensniveau i mitokondrier).
- Billede cellerne med et omvendt mikroskop styret af anskaffelses- og analysesoftwaren og et modul til fuld automatisering af erhvervelsen.
BEMÆRK: Se materialetabellen for at få oplysninger om den software og det modul, der anvendes i denne undersøgelse. - Sørg for, at mikroskopet er udstyret med en burinkubator (se Materialetabel)for at opretholde astrocytkulturen ved 5 % CO2 og 37 °C under hele forsøget.
- Fang fluorescensbilleder ved hjælp af sekventiel excitation ved 490 nm (for grøn kanal) og 550 nm (for rød kanal) med påvisning af grønne (500-540 nm for grøn kanal) og rød (550-600 nm for rød kanal) fluorescenssignaler.
- Vælg 5 astrocytter pr. brønd med et mitokondrienetværk, der udtrykker tilstrækkelige niveauer af LV-G1-MitoTimer ved hjælp af en forstørrelse på 40x. Pas på at vælge astrocytter så flade og store som muligt og ikke placeret i klynger af celler (for at arbejde på de enkelte celler).
- Gem koordinaterne for de 5 markerede celler i en xlm-fil (map.xlm). Denne map.xlm giver brugeren mulighed for at vende tilbage til de samme celler over tid.
- Hent billedsekvenser (1 billede/s i 60 s) ved hjælp af en forstørrelse på 150x (100x oliedypningsmål, 1,5 x mellemliggende forstørrelse) for hver koordinat.
- Gentag billedopsamling (1 billede/s for 60 s) for de samme astrocytter 6 timer, 12 timer og 24 timer efter behandlinger.
BEMÆRK: Brug et mikroskop udstyret med et hurtigt og effektivt autofokussystem. I denne sammenhæng blev hardwareløsningen kaldet Perfect Focus System (PFS) brugt. PFS bruger nær-infrarøde 870-nm LED- og CCD-linjesensorer til at bekæmpe aksiale fokusudsving i realtid under langsigtede billedbehandlinger.
3. Analyse af individuel mitokondriemorfologi og LV-G1-MitoTimer ratio
BEMÆRK: NIS General Analysis 3 (GA3) fra Nikon blev brugt til at automatisere morfometrisk analyse i denne undersøgelse.
- For hver billedsekvens (oprindelig plan, 6 h, 12 h, 24 h) skal du markere den første ramme for røde og grønne kanaler ved at klikke på ND-behandling > Vælg ramme.
- Flet de røde og grønne kanaler ved at vælge Konverteringer > Flet kanal.
- Hvis du vil rette billedskyggen, skal du vælge Forbehandling > Autoskyggekorrektion.
- Anvend Rolling Ball-algoritmen ved at vælge Forbehandling > Rolling Ball.
- Hvis du vil generere binære masker for hver mitokondrie, skal du vælge Segmentering > Threshold.
- Fjern objekter, der afkortes af kanten, ved at vælge Binær behandling > Berøring af kant.
- Hvis du vil måle overfladearealet, skal du vælge Måling > objektområde.
- Hvis du vil måle diameteren, skal du vælge Måling > Eq Diameter.
- Hvis du vil måle længden, skal du vælge Måling > Længde.
- Hvis du vil måle bredden, skal du vælge Måling > Bredde.
- Hvis du vil måle ruhed, skal du vælge Måling > Ruhed.
- Hvis du vil måle cirkularitet, skal du vælge Måling > Cirkularitet.
- Hvis du vil måle forlængelse, skal du vælge Måling > forlængelse.
- Opret en gruppe (højreklik) med ovenstående måling, og omdøb den til MorphoData.
- Mål den gennemsnitlige grønne intensitet ved at vælge Måling > Middelintensitet.
- Mål den gennemsnitlige røde intensitet ved at vælge Måling > Middelintensitet.
- Hvis du vil måle forholdet Rød/Grøn, skal du vælge Måling > forhold.
- Opret en gruppe (højreklik) med ovenstående måling, og omdøb den til RatioData.
- Eksporter tabellen til en CSV-fil ved at vælge Reference > tabel til CSV.
- Gem GA3-analysescriptet ved at vælge Gem som
BEMÆRK: En ikke-udtømmende liste over de kriterier , der anvendes i denne procedure , er sammenfattet i figur 1, tabel 1og tabel 2. Analysen GA3 script fil er tilgængelig i supplerende (supplerende Coding File 1 og Figur 2). De anvendte tærskler blev tilpasset til at individualisere så mange mitokondrier som muligt (undtagen store mitokondrienetværk, hvor det var muligt). Hvor det er muligt, er mitokondrienetværk enten individualiseret manuelt eller udelukket fra analyserne. På grund af intercellulær variabilitet udfører disse analyser på mindst 20-25 celler pr. tilstand (med mindst 50 mitokondrier efter celle).
4. Analyse af mitokondrie motilitet
BEMÆRK: På grund af den høje kompleksitet af mitokondriebevægelser foretrækkes manuel motilitetsanalyse. Her blev Nikons NIS Element-system brugt til manuelt at spore mitokondrier.
- Åbn sporingsmodulet i NIS, vælg Vis > Analyse > Tracking.
- Klik på Definer nyt investeringsafkast.
- Med værktøjet automatisk registreringskal du vælge 25-50 mitokondrier på det første billede af billedsekvensen.
- Klik på Spor automatisk aktiverede INVESTERINGSAFKAST Analyze.
- Hvis det er nødvendigt, skal du slette de forkerte INVESTERINGSAFKASTspor.
- Eksporter tabellen til en CSV-fil.
BEMÆRK: En ikke-udtømmende liste over de kriterier , der anvendes i denne procedure , er sammenfattet i figur 1 og tabel 3. En sporingsanalyse giver generelt en sti, der viser bevægelserne i midten af hvert sporet objekt. De forskellige sporingsindstillinger skal angives i sporingsindstillingen. Favor udvælgelsen af isolerede mitokondrier, der er tilstrækkeligt fjernt fra hinanden for at lette sporing. Behold kun de objekter, der konsekvent kunne spores over hele sekvensen. Fortsæt på samme måde for at fjerne outliers på grund af sporing af dårlig kvalitet. Derfor er det sæt objekter, der analyseres i dette afsnit, forskelligt fra det, der analyseres til statiske morfologiske analyser og vil generelt være mindre.
5. Datatransformation, normalisering og statistisk analyse
BEMÆRK: Hovedsageligt på grund af den høje heterogenitet af mitokondrier har data, der genereres, ofte en ikke-normal fordeling.
- Log-transformer målingerne manuelt før behandling.
- For hver analyse og tidsramme normaliseres de resulterende data manuelt ved hjælp af dem, der er opnået ved referenceerhvervelsen.
- Derudover overveje en anden / dobbelt normalisering til en kontrol tilstand, for eksempel for at vurdere effekten af en behandling.
- Udfør derefter statistisk analyse ved hjælp af en tovejsmatchet ANOVA. Her blev GraphPad Prism V8 brugt.
Representative Results
Primær kultur af astrocytter inficeret med LV-G1-MitoTimer udstillet typiske mitokondrie netværk. Før behandlingen viste astrocytter, der udtrykte LV-G1-MitoTimer, den heterogene mitokondriestørrelse og forskellige grønne/røde fluorescensintensiteter (Figur 3, Figur 4og Video 1). Mitokondriesystemet af astrocytkulturer, der udtrykker LV-G1-MitoTimer, blev overvåget før og efter inkubation med H202 (10 μM). De forskellige mitokondriefunktioner, der er beskrevet ovenfor, blev beregnet over 12 timer (hver 3 timer) og normaliseret (celle for celle) til deres oprindelige tilstand. På morfologisk niveau (figur 3B)begynder virkningerne af H2O2 at være synlige ved ca. 6 timer. Faktisk var mitokondrier fragmenteret (fald i længde, overfladeareal og forlængelsesfaktor). Denne fragmentering er endnu mere indlysende 12 timer efter behandlingen. Bemærk at diametre, bredder og sfæriskhed ikke blev reduceret. Med hensyn til redox-tilstand og -omsætning (figur 3C),3 timer efter H2O2-behandling steg andelen af grøn mitokondrier i astrocytter (som følge af en hurtig stigning i mitokondriebiogenese). Ved 6 timer vendte det grønne/røde forhold tilbage til baselineniveauer, men antallet af rent røde mitokondrier steg betydeligt fra basalniveauer. Efter 12 timer var konsekvenserne af den oxidative behandling af H2O2 synlige og resulterede i en betydelig stigning i forholdet og antallet af røde punktering. Med hensyn til dynamikken og mobiliteten (figur 3D),3 timer efter behandlingen blev alle kriterierne forbigående forhøjet. På længere sigt (12 timer) bevægede mitokondrier sig langsommere og over kortere afstande.
Figur 1: Astrocytkultur udtrykker LV-G1-MitoTimer biosensor. (A) Confocal fotografier af astrocytter udtrykker LV-G1-MitoTimer. (B) Udvælgelse af konfokale fotografier af reduceret (grøn) afbalanceret (orange) og oxideret (rød) mitokondrier med forskellige niveauer af fragmentering. (C) Oversigt over de forskellige kriterier, der er tilgængelige for analyse i et astrocyt, der udtrykker LV-G1-MitoTimer. Skalastang: (A) Øverste panel: 50 μm, nederste panel: 10 μm, (B) 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mitokondrie morfologi og ratio analyse. (A) GA3 script oversigt til analyse af individuelle mitokondrie morfologi og forholdet. (B) Indledende fotografier af en astrocyt udtrykker LV-G1-MitoTimer analyseret med GA3 script. (C) Eksempel på binære masker der er genereret for mitokondriesystemet af astrocytter. Skalastang: 10 μm (B-C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkningerne af H2O2 på astrocytternes mitokondriesystem. (A) Fotografier af astrocytter, der udtrykker LV-G1-MitoTimer 1 time før og 6 timer, 24 timer efter behandling med PBS (CTRL) og 10 μM af H2O2. (B) Radardiagrammer over mitokondriemorfologi, (C) redox-tilstand og -omsætning og(D)mobilitetskriterier, der vurderes på astrocytter under baseline og 3 h, 6 timer og 12 timer efter H2O2-behandling. SA: Overfladeareal; D: Diameter; L: Længde; W: Bredde; R: Rundhed; S: Sfæriskhed; EF: Forlængelsesfaktor (=L/W); G/R: Individuelt rødt/grønt forhold; Gpuncta: Procentdel af grøn punktta mitokondrier; Rpuncta: Procentdel af rød punktta mitokondrier; Dis: Forskydning; Tr: Sporlængde; SP og SpV: Hastighed og hastighed varians; Str: Glathed. Skalastang: 20 μm (A) og 2,5 μm (indsat). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fotografier af astrocytter, der udtrykker LV-G1-MitoTimer og viser et homogent og afbalanceret mitokondrienetværk under baseline. Skalalinje: 20 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Effekt af H2O2 behandling på mitokondrie system af dyrkede astrocytter. Astrocytisk mitokondrier før H2O2-behandling (baseline) samt 6 timer og 24 timer efter H2O2-behandling sammenlignet med ikke-behandlet kontrolcelle. Klik her for at downloade denne fil.
| Morfologikriterier | Interval | Bemærkninger | ||
| Overfladeareal (SA) | 0,5–4 μm2 | Disse kriterier informerer om de fragmenterede aflange træk ved mitokondrier. De udvikler sig generelt i samme retning. Fragmenteret mitokondrier vil have nedsat overfladeareal, diameter, længde og forlængelse faktor, mens rundhed, sfæralitet, og bredde kan være uændret eller øget. | ||
| Diameter (D) | 0,5–1,5 μm | |||
| Længde (L) | 0,5–5 μm | |||
| Bredde (W) | 0,5–2 μm | |||
| Rundhed (R) | 0–1 | |||
| Sfæriskhed (S) | 0–1 | |||
| Forlængelsesfaktor (EF = L/W) | 1–10 | |||
Tabel 1: Oversigt over udvalgte parametre for mitokondriemorfologi.
| Redox-statslige kriterier | Interval | Bemærkninger | ||
| Individuelt forhold (G/R) | 0–10 | Forholdet angiver resultatet af redox-tilstanden. Det informerer om den generelle tilstand og alder af mitokondrier i cellen. Det er vigtigt at antage, at dette forhold er balancen mellem biogenese og nedbrydning af mitokondrier og fission / fusion af oxideret mitokondrier med nedsat mitokondrier. Derfor kan evalueringen af antallet af grønne og røde punkteringer kraftigt hjælpe med at fortolke resultaterne. Grøn punktta mitokondrier bestemmes, når intensiteten af grøn er 10 gange så høj som rød. Rød punktta mitokondrier bestemmes, når intensiteten af rød er 10 gange større end den grønne. Den redox tilstand af en astrocyt er gennemsnittet af alle mitokondrier nøgletal af denne celle. | ||
| Procentdel af grøn punktta mitokondrier (Gpunktta) | 0%–100% | |||
| Procentdel af rød punktta mitokondrier (Rpunktta) | 0%–100% | |||
Tabel 2: Oversigt over udvalgte parametre for mitokondrie redox-tilstand.
| Mobilitetskriterier | Interval | Bemærkninger | ||
| Forskydning (Dis) | 0–10 μm | Tilsammen informerer disse funktioner netværkets generelle motilitetsdynamik. Stationær mitokondrier viser kort forskydning &sporlængde med lav hastighed. På den anden side kan oscillatorpartikler differentieres med en forskel mellem sporlængden og forskydningen (hvilket resulterer i lav ligehed) og en øget hastighed sammenlignet med statisk. | ||
| Sporlængde (Tr) | 0–10 μm | |||
| Hastigheds- og hastighedsafvigelse (Sp og SpV) | 0–1,5 μm/s ± 0,2 μm/s | |||
| Rethed | 0–1 | |||
| (Str = forskydning/sporlængde) | ||||
Tabel 3: Oversigt over udvalgte parametre for mitokondriemobilitet.
Supplerende Coding File 1: GA3 script fil til analyse af individuelle mitokondrie morfologi. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Her foreslås en ny metode til langsgående at følge dynamikken og omsætningen i mitokondriesystemet i en kultiveret astrocyt. I modsætning til en time-lapse tilgang på en fast gruppe af celler eller en individuel celle ad gangen (oftest brugt i litteraturen)24,25, forskere kan følge udviklingen af mitokondrie system i løbet af flere dage på de samme individuelle celler. I modsætning til enkelt godt levende billeddannelse, hvor høje niveauer af lyseksponering er påkrævet, og udvælgelsen af mange individuelle celler er mindre mulig, den foreslåede metode udnytter dette mikroskop evne til at afbilde flere forskellige celler i forskellige områder af en brønd og til at komme tilbage til de samme celler på forskellige tidspunkter for at re-billede dem. Takket være normalisering til en baseline udført for hvert målt kriterium på hver interessecelle tager det mitokondriesystemets kompleksitet i betragtning og undersøger effekten af behandlingen på hver celle i forhold til sit eget baselinebillede. Mikroskopets evne til autonomt at udføre denne type billeddannelse på op til 16 brønde ad gangen (billeddannelse 5 celler pr. Brønd) gør det muligt at tage behørigt hensyn til heterogeniteten af mitokondriesystemet under analysen uden den eksperimentelle variabilitet, der følger med billeddannelse på forskellige dage.
Kvaliteten af de kulturer, niveauet af virusinfektioner, der udtrykker LV-G1-MitoTimer biosensor, typen af mikroskop og mål, og udvælgelsen af egnede celler er kritiske variabler, der skal forblive så konsekvent som muligt i denne protokol. Celletæthederne, vektortypen og de virale titere kan tilpasses efter spørgsmålet. Selvom tidligere arbejde viser, at udtrykket LV-G1-MitoTimer ikke har skadelige konsekvenser for mitokondriefunktionen og dynamik21,22,26,27, er det vigtigt at kontrollere, at koncentrationen ikke er giftig for cellerne (for eksempel kontrol af det samlede antal celler i kontrol godt). Da der anvendes et enkelt fokalplan, skal astrocytter være: (1) så fladt som muligt, (2) isoleret fra andre mærkede celler (for at forenkle analysen i tilfælde af forskydning i fadet) og (3) med høje fluorescensniveauer. Da celler i kultur kan være meget varierende i morfologi, kan mitokondriesystemet være meget heterogent. I denne sammenhæng kompenserer analyse af INVESTERINGSAFKAST (og ikke hele cellen) for nogle problematiske områder, såsom de perinukleare områder, og reducerer variationen. Det er vigtigt at gøre baseline på relativt lignende celler og prøve så mange celler som muligt. Derfor er højindhold erhvervelse og analyse mikroskoper ideelt egnet. Under denne langsgående overvågning er det også vigtigt ikke at overeksponere cellerne i lyset for at undgå biosensor blegning.
Denne billedbehandlingsmetode er ikke uden dens kompleksitet, og i hele protokollen er der flere noter, der tager højde for fejlfinding udført under tidligere tests med mikroskopet. For eksempel afhænger valget af anvendte pladebelægning af den tilsigtede analyse, men anbefalinger til de mest egnede valg til astrocyt primære kulturer er medtaget. Derudover skal billedopsamling udføres på mindst 5 celler pr. tilstand på grund af intercellulær variabilitet. Mere specifikt vil nogle celler, der er valgt ved baseline imaging, dø, nogle vil flytte ud af rammen af det tildelte billedopsamlingsområde, og nogle vil ændre deres morfologi, hvilket gør mitokondrier meget vanskelige at individualisere i analyse. Imaging mange celler fra begyndelsen øge sandsynligheden for en stor nok stikprøve størrelse af celler til at analysere i slutningen af eksperimentet. Ud over de mere komplekse aspekter af denne billeddannelse teknik, der er nogle direkte begrænsninger for så vidt angår, hvem der kan drage fordel af denne type billeddannelse og analyse. For at drage fuld fordel af automatiseringen af billedopsamlingen skal det anvendte mikroskop have et autofokussystem, der kan håndtere hastigheden af tidsintervaller mellem billeder (dvs. hver 3 s i denne protokol) og kan konsekvent fokusere på den pågældende celle, før hvert billede tages. Derudover uden JOBS-softwaren, som automatiserer hele billedopsamlingsprocessen, bliver denne metode besværlig og potentielt umulig afhængigt af antallet af celler, der afbildes, da det ville kræve manuelt at finde og billedbehandle hver celle igen på det rette tidspunkt. Endelig er denne billeddannelsesmetode ikke immun over for spørgsmålet om fotobleaching. Af denne grund, som med enhver langsigtet erhvervelsesmetode, er det vigtigt at vælge fluorescerende markører, der er mindre modtagelige for fotobleaching og at skræddersy billedopkøb for at undgå dette problem så meget som muligt.
Denne teknik adskiller sig fra andre, der i øjeblikket anvendes på en afgørende måde. I modsætning til andre time-lapse undersøgelser, kræver denne teknik ikke billeddannelse på samme position i brønden hele tiden, heller ikke kræver manuel bevægelse af pladen til billedet andre områder. Dette giver forskerne mulighed for at afbilde mange celler under mange forhold i en 24 timers tidsramme. Derfor giver evnen til at udføre denne billeddannelse og analyse på mange celler i hver brønd de samme befolkningsoplysninger, man ville få ved bredt at studere en stor gruppe celler, samtidig med at der gives specifikke foranstaltninger fra hver celle afbildet. Mens nogle særlige forhold til denne metode måske ikke gælder for andre billedopsamlingsmetoder (skitseret ovenfor), opvejer fordelene komplikationerne med den type analyse, der er mulig efter erhvervelsen. Denne teknik gør det muligt for forskere at se de nøjagtige konsekvenser af forskellige behandlinger på mitokondriesystemet, og dermed på de dyrkede astrocytter.
Derudover er denne metode meget tilpasses til mange forskellige videnskabelige spørgsmål vedrørende mitokondrie adfærd og roller i specifikke sammenhænge. Her omhandler den skitserede protokol specifikt med kultiverede astrocytter. Men mange andre celletyper kan bruges, og de behandlinger, der kan testes, er kun begrænset af de spørgsmål, der undersøges. Denne type billeddannelse har potentiale til at fremme den kollektive viden og forståelse af mitokondrie adfærd, de underliggende mekanismer, der fører til mitokondrie dysfunktion, og virkningerne af mange patologier på den medfødte dynamik til stede i forskellige typer af celler.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af et Synapsis Foundation stipendium tildelt KR og Lausanne University Hospital (CHUV). Forfatterne takker Nikon for deres hjælp, især J. Gannevat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
References
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
- Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
- MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
- Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
- Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
- Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
- Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
- Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
- de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
- Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
- Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
- Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
- Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
- Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
- Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
- Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
- Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).
