Summary
Dit artikel beschrijft de methode voor mitochondriale time-lapse beeldvorming van astrocytenculturen uitgerust met MitoTimer biosensor en de resulterende multiparametrische analyse van mitochondriale dynamica, mobiliteit, morfologie, biogenese, redoxtoestand en omzet.
Abstract
Hoewel er veel aandacht is besteed aan mitochondriale veranderingen op neuronaal niveau, toont recent bewijs aan dat mitochondriale dynamiek en functie in astrocyten betrokken zijn bij cognitie. Dit artikel beschrijft de methode voor time-lapse beeldvorming van astrocytenculturen uitgerust met een mitochondriale biosensor: MitoTimer. MitoTimer is een krachtig en uniek hulpmiddel om mitochondriale dynamica, mobiliteit, morfologie, biogenese en redoxtoestand te beoordelen. Hier worden de verschillende procedures voor cultuur, beeldacquisities en daaropvolgende mitochondriale analyse gepresenteerd.
Introduction
Astrocyten zijn cruciale spelers in het onderhoud van de homeostase van de hersenen. Ze zijn misschien het meest bekend om belangrijke structurele rollen in de hersenen, als onderdeel van de bloed-hersenbarrière1 en door het ondersteunen van neuronen en synapsen in de hersenen2. Astrocytenondersteuning van neuronen is zowel structureel3 als metabolisch4,5,met astrocyten die neurogenese en synaptogenese bevorderen en tegelijkertijd belangrijke metabolieten zoals lactaat leveren aan actieve neuronen4,6,7. Naast de rol van structurele ondersteuning, zijn astrocyten actieve cellen die deelnemen aan Ca2 + signalering en buffering (inclusief spontane mitochondriale Ca2 + instroom)8,9, K+ buffering10, en kunnen zich aanpassen en reageren op de behoeften van de hersenen in tijden van letsel11,12 . Omdat het zulke dynamische cellen zijn, hebben astrocyten robuuste energiebehoeften, die een efficiënt mitochondriaal netwerk vereisen. Deze mitochondriën hebben ook een cruciale rol bij het bufferen van overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS)13. Naast hun individuele of lokale rollen van energieopwekking en ROS-buffering, functioneren mitochondriën als een netwerk14. In die zin handhaven ze het evenwicht tussen splijtings- en fusie-mitochondriën, die respectievelijk nieuwe / gereduceerde mitochondriën en oudere / geoxideerde mitochondriën vertegenwoordigen15. De totale redoxtoestand van een cel kan worden gemeten aan de hand van de redoxtoestand van het mitochondriale netwerk. In de pathologie is dit een cruciaal stuk informatie dat licht kan werpen op welke cellen mogelijk niet optimaal functioneren.
In de afgelopen jaren zijn veel sensoren ontwikkeld om de dynamiek en functies van mitochondriën in cellen te bestuderen. Sensoren die bijvoorbeeld energie-uitwisseling (ATP), redoxtoestand (NADH / NAD+, ROS) en enzymatische functionaliteit (cAMP, Ca2 +, Zn2 + )meten, worden momenteel gebruikt in de studie van mitochondriale functie16. Onder hen maakt MitoTimer het mogelijk om de veranderingen in mitochondriale morfologie (grootte, vorm, oppervlakte), mobiliteit (snelheid, verplaatsing) en dynamiek (fusie- en splijtingsgebeurtenissen) te volgen, evenals de algehele mitochondriale omloopsnelheid en redoxtoestand. MitoTimer is een gemuteerd rood fluorescerend eiwit, drFP58317, met een mitochondriaal signaal van subeenheid VIII van humaan cytochroom c oxidase18,19 om nieuw gesynthetiseerde mitochondriën in groen (488 nm) en geoxideerde mitochondriën in rood (555 nm) te visualiseren. Met behulp van de groene (488 nm) en rode (555 nm) fluorescentieverhouding maakt gelijktijdige evaluatie van individuele mitochondriën, hun morfologische analyse, fusie / splijtingsgebeurtenissen en redoxtoestandsgeschiedenis20,21. Deze unieke eigenschap kan worden gebruikt om veel wetenschappelijke vragen te onderzoeken met betrekking tot de fysiologische en pathologische rollen van mitochondriën en is daarom veelbelovend voor het onthullen van de onderliggende mechanismen van mitochondriale dynamica binnen veel verschillende celtypen.
We hebben onlangs een nieuwe lentivirale vector ontwikkeld (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, hierna LV-G1-MitoTimer genoemd) om de dynamiek en functies van mitochondriën specifiek in astrocyten in vitro en in vivote bestuderen22. LV-G1-MitoTimer maakt gebruik van een afgeknotte versie van de glial fibrillary acidic protein (GFAP) promotor gfaABC1D, met een B3 enhancer (gfaABC1D(B3), hierna G1 genoemd) in combinatie met het eerder beschreven miR124T neuronale detargeting systeem23. Het maakt exclusieve expressie van de mitochondriale biosensor in astrocyten in vitro en in vivomogelijk 22. Hier worden de verschillende stappen gepresenteerd om een cultuur van rat hippocampale astrocyten uit te voeren en ze uit te rusten met de LV-G1-MitoTimer biosensor, evenals de verschillende microscopiestappen om het gedrag van astrocyten mitochondriën gedurende verschillende opeenvolgende uren / dagen te volgen.
Protocol
Het huidige protocol is uitgevoerd met goedkeuring van een ethische commissie (overeenkomst VD3602, Lausanne, Zwitserland) en volgt europese richtlijnen voor het gebruik van dieren.
1. Rat hippocampale astrocyte primaire cultuur
- Offer vijf rattenpups (Wistar IGS Rat) door onthoofding op postnatale dag 1-2.
- Verwijder de hersenen en bewaar het in een petrischaal met 5 ml vers astrocytenmedium (DMEM met GlutaMAX aangevuld met 1% penicilline / streptomycine en 10% vers paardenserum).
- Isoleer de hippocampus. Dissociëren in 5 ml van het astrocytische medium door drie passages door een naald van 21 G en drie passages door een naald van 25 G.
- Breng de gedissocieerde cellen over naar een centrifugebuis van 15 ml en tel in een hemocytometer.
- Plaat 20.000-25.000 cellen/cm2 in multiwell schotels (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) en bewaar ze bij 37 °C onder een atmosfeer met 5% CO2 voor de rest van het experiment.
- Vervang het medium volledig na 3 dagen in vitro (DIV3).
- Voeg bij DIV8 0,6 pg p24-antigeen toe per cel van lentivirale vectorcodering voor mitochondriale biosensor MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22) verdund in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS + 0,01% BSA).
- Was bij DIV9 met voorverwarmd 1x steriel PBS (37 °C) en voeg vers astrocytenmedium toe.
- Voer bij DIV11 2 wasbeurten uit met voorverwarmde 1x steriele PBS (37 °C) en voeg vers astrocytenmedium toe zonder fenolrood.
OPMERKING: De keuze van de coating is afhankelijk van de beoogde test. Als standaardcoating voor primaire astrocytenkweek wordt aanbevolen om 0,2 mg / ml poly-D-lysine of 8,7 μg / cm2 keldermembraanmatrix (bijv. Matrigel) te gebruiken. Om het mitochondriale systeem van astrocyten te visualiseren, is het essentieel om te werken aan afgeplatte en uitgerekte cellen. In deze context is de combinatie van keldermembraanmatrix op IBIDI u-dia's het meest geschikt. Het is ook cruciaal om niet te werken met fenolrood, dat giftig is voor de cel bij herhaalde blootstelling aan licht.
2. Langetermijnmonitoring van het mitochondriale systeem.
- Beoordeel het astrocytische mitochondriale systeem minimaal 3-5 dagen na de lentivirale infecties met LV-G1-MitoTimer (om een voldoende niveau van fluorescentie in de mitochondriën mogelijk te maken).
- Stel de cellen in beeld met een omgekeerde microscoop die wordt bestuurd door de acquisitie- en analysesoftware en een module voor volledige automatisering van acquisitie.
OPMERKING: Raadpleeg de tabel met materialen voor de details van de software en module die in dit onderzoek zijn gebruikt. - Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met een kooi-incubator (zie Tabel met materialen)om de astrocytencultuur gedurende het hele experiment op 5% CO2 en 37 °C te houden.
- Leg fluorescentiebeelden vast met behulp van sequentiële excitatie bij 490 nm (voor groen kanaal) en 550 nm (voor rood kanaal) met detectie van groene (500-540 nm voor groen kanaal) en rode (550-600 nm voor rood kanaal) fluorescentiesignalen.
- Selecteer 5 astrocyten per put met een mitochondriaal netwerk dat voldoende niveaus van LV-G1-MitoTimer tot expressie brengt met een vergroting van 40x. Zorg ervoor dat astrocyten zo plat en groot mogelijk worden geselecteerd en zich niet in clusters van cellen bevinden (om aan individuele cellen te werken).
- Sla de coördinaten van de 5 geselecteerde cellen op in een xlm-bestand (map.xlm). Met deze map.xlm kan de gebruiker na verloop van tijd terugkeren naar dezelfde cellen.
- Verkrijg beeldsequenties (1 afbeelding (1 afbeelding (s voor 60 s) met een vergroting van 150x (100x olie-onderdompelingsobjectief, 1,5x tussenliggende vergroting) voor elke coördinaten.
- Herhaal beeldverwerving (1 beeld (1 beeld(len) voor 60 s) voor dezelfde astrocyten 6 h, 12 h en 24 h na de behandelingen.
OPMERKING: Gebruik een microscoop die is uitgerust met een snel en efficiënt autofocussysteem. In dit kader werd de hardware-oplossing genaamd Perfect Focus System (PFS) gebruikt. PFS maakt gebruik van nabij-infrarode 870-nm LED- en CCD-lijnsensoren om axiale focusfluctuaties in realtime te bestrijden tijdens langetermijnbeeldvormingsonderzoeken.
3. Analyse van individuele mitochondriale morfologie en LV-G1-MitoTimer ratio
OPMERKING: NIS General Analysis 3 (GA3) van Nikon werd in deze studie gebruikt om morfometrische analyse te automatiseren.
- Selecteer voor elke afbeeldingsreeks (basislijn, 6 h, 12 h, 24 h) het eerste frame voor rode en groene kanalen door op ND Processing > Select Framete klikken.
- Voeg de rode en de groene kanalen samen door Conversies > Samenvoegen te selecteren.
- Als u beeldschaduw wilt corrigeren, selecteert u Voorbewerking > Automatische arceringscorrectie.
- Pas het Rolling Ball-algoritme toe door Voorbewerking > Rolling Ballte selecteren.
- Als u binaire maskers wilt genereren voor elk mitochondrion, selecteert u Segmentatie > Drempel.
- Verwijder alle objecten die door de rand zijn afgekapt door Binaire verwerking te selecteren > Rand aanraken.
- Als u het oppervlak wilt meten, selecteert u Meting > objectgebied.
- Als u de diameter wilt meten,selecteert u Meting > Eq Diameter .
- Als u de lengte wilt meten,selecteert u Meten > Lengte .
- Als u de breedte wilt meten,selecteert u Meting > breedte .
- Als u de ruwheid wilt meten, selecteert u Meting > Ruwheid.
- Als u circulariteit wilt meten, selecteert u Meting > Circulariteit.
- Als u de rek wilt meten, selecteert u Meting > rek.
- Stel een groep samen (klik met de rechtermuisknop) met de bovenstaande meting en hernoem deze als MorphoData.
- Meet de gemiddelde groene intensiteit door Meting > gemiddelde intensiteit teselecteren.
- Meet de gemiddelde rode intensiteit door Meting > gemiddelde intensiteit teselecteren.
- Als u de verhouding Rood/Groen wilt meten,selecteert u Meting > verhouding .
- Stel een groep samen (klik met de rechtermuisknop) met de bovenstaande meting en hernoem deze als RatioData.
- Exporteer de tabel naar een CSV-bestand door Verwijzing > tabel naar CSV teselecteren.
- Sla het GA3-analysescript op door Opslaan als te selecteren
OPMERKING: Een niet-uitputtende lijst van de bij deze procedure gehanteerde criteria is samengevat in figuur 1, tabel 1en tabel 2. Het analyse GA3 scriptbestand is beschikbaar in aanvullend(Supplemental Coding File 1 en Figuur 2). De gebruikte drempels werden aangepast om zoveel mogelijk mitochondriën te individualiseren (waar mogelijk met uitzondering van grote mitochondriale netwerken). Waar mogelijk worden mitochondriale netwerken handmatig geïndividualiseerd of uitgesloten van de analyses. Vanwege intercellulaire variabiliteit, voer deze analyses uit op ten minste 20-25 cellen per aandoening (met een minimum van 50 mitochondriën per cel).
4. Analyse van mitochondriale motiliteit
OPMERKING: Vanwege de hoge complexiteit van mitochondriale bewegingen heeft handmatige motiliteitsanalyse de voorkeur. Hier werd Nikon's NIS Element-systeem gebruikt om mitochondriën handmatig te volgen.
- Open de trackingmodule in NIS, selecteer Weergeven > analyse > bijhouden.
- Klik op Define New ROI.
- Selecteer metde Automatic Detection Tool 25-50 mitochondriën op de eerste afbeelding van de beeldreeks.
- Klik op Track Autodetected ROIs Analyze.
- Verwijder indien nodig de onjuiste ROI-tracks.
- Exporteer de tabel naar een CSV-bestand.
OPMERKING: Een niet-uitputtende lijst van de bij deze procedure gehanteerde criteria is samengevat in figuur 1 en tabel 3. Een trackinganalyse geeft over het algemeen een pad dat de bewegingen van het midden van elk gevolgd object weergeeft. De verschillende trackingopties moeten worden ingesteld in de trackingoptie. Geef de voorkeur aan de selectie van geïsoleerde mitochondriën die voldoende ver van elkaar verwijderd zijn om het volgen te vergemakkelijken. Bewaar alleen de objecten die consistent over de hele reeks kunnen worden gevolgd. Ga op dezelfde manier te werk om uitschieters te verwijderen als gevolg van tracking van slechte kwaliteit. Bijgevolg verschilt de set objecten die in deze sectie wordt geanalyseerd van die geanalyseerd voor statische morfologische analyses en zal deze over het algemeen kleiner zijn.
5. Datatransformatie, normalisatie en statistische analyse
OPMERKING: Voornamelijk vanwege de hoge heterogeniteit van de mitochondriën hebben gegenereerde gegevens vaak een niet-normale verdeling.
- Log de metingen handmatig om voordat ze worden verwerkt.
- Normaliseer voor elke analyse en elk tijdsbestek handmatig de resulterende gegevens met het gemiddelde van de gegevens die zijn verkregen in de referentie-acquisitie.
- Overweeg daarnaast een tweede /dubbele normalisatie van een controleconditie, bijvoorbeeld om het effect van een behandeling te evalueren.
- Voer vervolgens statistische analyses uit met behulp van een in twee richtingen gematchte ANOVA. Hier werd GraphPad Prism V8 gebruikt.
Representative Results
Primaire cultuur van astrocyten geïnfecteerd met LV-G1-MitoTimer vertoonde typische mitochondriale netwerken. Vóór de behandeling vertoonden astrocyten die LV-G1-MitoTimer tot expressie brachten de heterogene mitochondriale grootte en verschillende groen /rode fluorescentie-intensiteiten(figuur 3, figuur 4en video 1). Het mitochondriale systeem van astrocytenculturen die LV-G1-MitoTimer tot expressie brengen, werd voor en na incubatie gevolgd met H202 (10 μM). De verschillende mitochondriale kenmerken die hierboven zijn beschreven, werden berekend over 12 uur (elke 3 uur) en genormaliseerd (cel voor cel) tot hun begintoestand. Op morfologisch niveau (figuur 3B) beginnen de effecten van H2O2 zichtbaar te worden na ongeveer 6 uur. Inderdaad, de mitochondriën waren gefragmenteerd (afname van lengte, oppervlakte en rekfactor). Deze fragmentatie is 12 uur na de behandeling nog duidelijker. Merk op dat de diameters, breedtes en sfericiteit niet zijn verminderd. Wat betreft de redoxtoestand en -omzet (figuur 3C), 3 uur na H2O2-behandeling, nam het aandeel groene mitochondriën toe in astrocyten (het gevolg van een snelle toename van mitochondriale biogenese). Na 6 uur keerde de groen/rode verhouding terug naar de uitgangswaarden, maar het aantal zuiver rode mitochondriën nam aanzienlijk toe ten opzichte van basale niveaus. Na 12 uur waren de gevolgen van de oxidatieve behandeling van H2O2 zichtbaar en resulteerden in een aanzienlijke toename van de verhouding en het aantal rode puncta. Wat betreft de dynamiek en mobiliteit (figuur 3D), 3 uur na de behandeling, werden alle criteria tijdelijk verhoogd. Op langere termijn (12 uur) bewogen de mitochondriën langzamer en over kortere afstanden.
Figuur 1: Astrocytencultuur die LV-G1-MitoTimer biosensor uitdrukt. (A) Confocale foto's van astrocyten die LV-G1-MitoTimer uitdrukken. (B) Selectie van confocale foto's van gereduceerde (groen) gebalanceerde (oranje) en geoxideerde (rode) mitochondriën met verschillende niveaus van fragmentatie. (C) Samenvattend diagram van de verschillende criteria die beschikbaar zijn voor analyse in een astrocyte die LV-G1-MitoTimer tot expressie brengt. Schaalbalk: (A) Bovenpaneel: 50 μm, onderste paneel: 10 μm, (B) 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mitochondriale morfologie en ratio analyse. (A) GA3 script overzicht voor de analyse van individuele mitochondriale morfologie en ratio. BDe eerste foto's van een astrocyte die LV-G1-MitoTimer uitdrukt, geanalyseerd met het GA3-script. (C) Voorbeeld van binaire maskers gegenereerd voor het mitochondriale systeem van astrocyten. Schaalbalk: 10 μm (B-C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De effecten van H2O2 op het mitochondriaal systeem van astrocyten. (A) Foto's van astrocyten die LV-G1-MitoTimer 1 uur vóór en 6 uur, 24 uur na behandeling met PBS (CTRL) en 10 μM van H2O2tot expressie brengen. (B) Radarkaarten van mitochondriale morfologie, (C) redoxtoestand en -omzet, en (D) mobiliteitscriteria geëvalueerd op astrocyten tijdens baseline en 3 h, 6 h en 12 h na H2O2 behandeling. SA: Oppervlakte; D: Diameter; L: Lengte; W: Breedte; R: Rondheid; S: Sfericiteit; EF: Rekfactor (=L/W); G / R: Individuele rood / groene verhouding; Gpuncta: Percentage groene puncta mitochondriën; Rpuncta: Percentage rode puncta mitochondriën; Dis: Verplaatsing; Tr: Track Lengte; Sp en SpV: Snelheid en snelheid variantie; Str: Rechtlijnigheid. Schaalbalk: 20 μm (A) en 2,5 μm (inzet). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Foto's van astrocyten die LV-G1-MitoTimer tot expressie brengen en een homogeen en uitgebalanceerd mitochondriaal netwerk tonen tijdens baseline. Schaalbalk: 20 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Effect van H2O2 behandeling op het mitochondriaal systeem van gekweekte astrocyten. Astrocytische mitochondriën vóór behandeling met H2O2 (baseline), evenals 6 uur en 24 uur na behandeling met H2O2 in vergelijking met niet-behandelde controlecel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Morfologische criteria | Bereik | Opmerkingen | ||
| Oppervlakte (SA) | 0,5-4 μm2 | Deze criteria informeren over de gefragmenteerde-langwerpige kenmerken van mitochondriën. Ze evolueren over het algemeen in dezelfde richting. Gefragmenteerde mitochondriën hebben een verminderd oppervlak, diameter, lengte en rekfactor, terwijl rondheid, bolvormigheid en breedte onveranderd of verhoogd kunnen zijn. | ||
| Diameter (D) | 0,5–1,5 μm | |||
| Lengte (L) | 0,5-5 μm | |||
| Breedte (W) | 0,5-2 μm | |||
| Ronding (R) | 0–1 | |||
| Sfericiteit (S) | 0–1 | |||
| Rekfactor (EF = L/W) | 1–10 | |||
Tabel 1: Samenvatting van geselecteerde parameters voor mitochondriale morfologie.
| Redox Staat criteria | Bereik | Opmerkingen | ||
| Individuele verhouding (G/R) | 0–10 | De verhouding geeft het resultaat van de redoxtoestand aan. Het informeert over de algemene toestand en leeftijd van de mitochondriën in de cel. Het is essentieel om te overwegen dat deze verhouding de balans is van biogenese en afbraak van mitochondriën en de splijting / fusie van geoxideerde mitochondriën met verminderde mitochondriën. Daarom kan de evaluatie van het aantal groene en rode puncta krachtig helpen bij het interpreteren van de resultaten. Groene puncta mitochondriën worden bepaald wanneer de intensiteit van groen 10 keer die van rood is. Rode puncta mitochondriën worden bepaald wanneer de intensiteit van rood 10 keer groter is dan die van groen. De redoxtoestand van een astrocyt is het gemiddelde van alle mitochondriënverhoudingen van die cel. | ||
| Percentage groene puncta mitochondriën (Gpuncta) | 0%–100% | |||
| Percentage rode puncta mitochondriën (Rpuncta) | 0%–100% | |||
Tabel 2: Samenvatting van geselecteerde parameters voor mitochondriale redoxtoestand.
| Mobiliteitscriteria | Bereik | Opmerkingen | ||
| Verplaatsing (Dis) | 0-10 μm | Samen vormen deze kenmerken de algemene beweegdynamiek van het netwerk. Stationaire mitochondriën vertonen een korte verplaatsing en spoorlengte met een lage snelheid. Aan de andere kant kunnen oscillerende deeltjes worden onderscheiden met een verschil tussen de spoorlengte en verplaatsing (wat resulteert in een lage rechtheid) en een verhoogde snelheid in vergelijking met statisch. | ||
| Track Lengte (Tr) | 0-10 μm | |||
| Snelheids- en snelheidsvariatie (Sp en SpV) | 0–1,5 μm/s ± 0,2 μm/s | |||
| Rechtheid | 0–1 | |||
| (Str = verplaatsing/spoorlengte) | ||||
Tabel 3: Samenvatting van geselecteerde parameters voor mitochondriale mobiliteit.
Supplemental Coding File 1: GA3 script bestand voor analyse van individuele mitochondriale morfologie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om de dynamiek en omzet van het mitochondriale systeem in een gekweekte astrocyt longitudinaal te volgen. In tegenstelling tot een time-lapse-benadering op een vaste groep cellen of één individuele cel tegelijk (meestal gebruikt in de literatuur)24,25, kunnen onderzoekers de evolutie van het mitochondriale systeem gedurende meerdere dagen op dezelfde individuele cellen volgen. In tegenstelling tot single well live imaging waar hoge niveaus van blootstelling aan licht vereist zijn, en de selectie van veel individuele cellen minder haalbaar is, maakt de voorgestelde methode gebruik van het vermogen van deze microscoop om verschillende cellen in verschillende gebieden van een put in beeld te brengen en terug te keren naar diezelfde cellen op verschillende tijdstippen om ze opnieuw in beeld te brengen. Dankzij normalisatie van een basislijn die wordt uitgevoerd voor elk gemeten criterium op elke cel van belang, houdt het rekening met de complexiteit van het mitochondriale systeem en onderzoekt het het effect van de behandeling op elke cel ten opzichte van zijn eigen basisbeeld. Het vermogen van de microscoop om dit type beeldvorming autonoom uit te voeren op maximaal 16 putten tegelijk (beeldvorming van 5 cellen per put) maakt het mogelijk om tijdens de analyse goed rekening te houden met de heterogeniteit van het mitochondriale systeem zonder de experimentele variabiliteit die gepaard gaat met beeldvorming van verschillende omstandigheden op verschillende dagen.
De kwaliteit van de culturen, de niveaus van virale infecties die de LV-G1-MitoTimer biosensor tot expressie brengen, het type microscoop en doelstellingen, en de selectie van geschikte cellen zijn kritieke variabelen die zo consistent mogelijk moeten blijven in dit protocol. De celdichtheden, het type vector en de virale titers kunnen worden aangepast aan de vraag. Hoewel eerder werk aantoont dat LV-G1-MitoTimer-expressie geen schadelijke gevolgen heeft voor de mitochondriale functie en dynamiek21,22,26,27, is het essentieel om te verifiëren dat de concentratie niet giftig is voor de cellen (bijvoorbeeld het controleren van het totale aantal cellen dat goed onder controle is). Als een enkel brandpuntsvlak wordt gebruikt, moeten astrocyten: (1) zo plat mogelijk zijn, (2) geïsoleerd van andere gelabelde cellen (om de analyse te vereenvoudigen in geval van verplaatsing in de schotel) en (3) hoge fluorescentieniveaus bezitten. Omdat cellen in cultuur zeer variabel kunnen zijn in morfologie, kan het mitochondriale systeem zeer heterogeen zijn. In deze context compenseert het analyseren van ROI's (en niet de hele cel) voor sommige problematische regio's, zoals de perinucleaire regio's, en vermindert de variabiliteit. Het is essentieel om de basislijn op relatief vergelijkbare cellen te doen en zoveel mogelijk cellen te bemonsteren. Daarom zijn high content acquisitie- en analysemicroscopen bij uitstek geschikt. Tijdens deze longitudinale monitoring is het ook belangrijk om de cellen niet te veel te belichten aan licht om biosensorbleking te voorkomen.
Deze beeldvormingsmethode is niet zonder complexiteit en in het hele protocol zijn verschillende opmerkingen opgenomen, die rekening houden met het oplossen van problemen tijdens eerdere tests met de microscoop. De keuze van de gebruikte plaatcoating hangt bijvoorbeeld af van de beoogde test, maar aanbevelingen voor de meest geschikte keuzes voor primaire astrocytenculturen zijn opgenomen. Bovendien moet beeldacquisitie worden uitgevoerd op ten minste 5 cellen per aandoening vanwege intercellulaire variabiliteit. Meer specifiek zullen sommige cellen die bij baseline imaging zijn geselecteerd, sterven, sommige zullen uit het kader van het toegewezen beeldacquisitiegebied bewegen en sommige zullen hun morfologie veranderen, waardoor de mitochondriën zeer moeilijk te individualiseren zijn in analyse. Het in beeld brengen van veel cellen vanaf het begin verhoogt de kans op een voldoende grote steekproefgrootte van cellen om aan het einde van het experiment te analyseren. Naast de meer complexe aspecten van deze beeldvormingstechniek, zijn er enkele regelrechte beperkingen voor wie baat kan hebben bij dit type beeldvorming en analyse. Om ten volle te profiteren van de automatisering van beeldacquisitie, moet de gebruikte microscoop een autofocussysteem hebben dat de snelheid van tijdsintervallen tussen afbeeldingen aankan (d.w.z. elke 3 s in dit protocol) en zich consequent kan concentreren op de cel in kwestie voordat elke afbeelding wordt gemaakt. Bovendien, zonder de JOBS-software, die het hele beeldacquisitieproces automatiseert, wordt deze methode moeilijk en mogelijk onmogelijk, afhankelijk van het aantal cellen dat wordt afgebeeld, omdat het nodig zou zijn om elke cel handmatig opnieuw te vinden en in beeld te brengen op het juiste moment. Ten slotte is deze beeldvormingsmethode niet immuun voor het probleem van fotobleaching. Om deze reden is het, zoals bij elke langetermijnacquisitiemethode, belangrijk om fluorescerende markers te kiezen die minder gevoelig zijn voor fotobleaching en om beeldacquisitie op maat te maken om dit probleem zoveel mogelijk te voorkomen.
Deze techniek verschilt op een cruciale manier van andere die momenteel worden gebruikt. In tegenstelling tot andere time-lapse studies, vereist deze techniek niet de hele tijd beeldvorming op dezelfde positie in de put, noch vereist het handmatige beweging van de plaat om andere gebieden in beeld te brengen. Dit stelt onderzoekers in staat om veel cellen in vele omstandigheden in één tijdsbestek van 24 uur in beeld te brengen. Bijgevolg geeft de mogelijkheid om deze beeldvorming en analyse uit te voeren op veel cellen in elke put dezelfde populatie-informatie die men zou verkrijgen door een grote groep cellen in grote lijnen te bestuderen, terwijl bovendien specifieke maatregelen van elke afgebeelde cel worden verstrekt. Hoewel sommige specifieke kenmerken van deze methode mogelijk niet van toepassing zijn op andere beeldacquisitiemethoden (hierboven beschreven), wegen de voordelen op tegen de complicaties met het type analyse dat mogelijk is na acquisitie. Met deze techniek kunnen onderzoekers de exacte vertakkingen van verschillende behandelingen op het mitochondriale systeem en bijgevolg op de gekweekte astrocyten zien.
Bovendien is deze methode zeer aanpasbaar aan veel verschillende wetenschappelijke vragen met betrekking tot mitochondriaal gedrag en rollen in specifieke contexten. Hier gaat het geschetste protocol specifiek over gekweekte astrocyten. Er kunnen echter veel andere celtypen worden gebruikt en de behandelingen die kunnen worden getest, worden alleen beperkt door de vragen die worden onderzocht. Dit type beeldvorming heeft het potentieel om de collectieve kennis en het begrip van mitochondriaal gedrag, de onderliggende mechanismen die leiden tot mitochondriale disfunctie en de effecten van vele pathologieën op de aangeboren dynamiek in verschillende soorten cellen te bevorderen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een Synapsis Foundation fellowship toegekend aan K.R. en het Lausanne University Hospital (CHUV). De auteurs bedanken Nikon voor hun hulp, in het bijzonder J. Gannevat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
References
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
- Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
- MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
- Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
- Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
- Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
- Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
- Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
- de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
- Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
- Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
- Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
- Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
- Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
- Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
- Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
- Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).
