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Neuroscience

सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की लाइव इमेजिंग

Published: November 16, 2021 doi: 10.3791/62957
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Psychiatry, Center for Psychiatric Neurosciences, Lausanne University Hospital (CHUV) and University of Lausanne

Summary

यह लेख मिटोटिमर बायोसेंसर से लैस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के माइटोकॉन्ड्रियल समय-चूक इमेजिंग और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, बायोजेनेसिस, रेडॉक्स राज्य और टर्नओवर के परिणामस्वरूप मल्टीपैरामेट्रिक विश्लेषण के लिए विधि का वर्णन करता है।

Abstract

जबकि न्यूरोनल स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों पर बहुत ध्यान दिया गया है, हाल के सबूत दर्शाता है कि एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और कार्य अनुभूति में फंसाया जाता है। यह लेख एक माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर: मिटोटिमर से लैस एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के समय-चूक इमेजिंग के लिए विधि का वर्णन करता है। माइटोटाइमर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, गतिशीलता, आकृति विज्ञान, बायोजेनेसिस और रेडॉक्स राज्य का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और अनूठा उपकरण है। यहां, संस्कृति, छवि अधिग्रहण और बाद में माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रक्रियाएं प्रस्तुत की जाती हैं।

Introduction

एस्ट्रोसाइट्स मस्तिष्क हो्योसाइटसिस के रखरखाव में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। वे शायद सबसे अच्छी तरह से मस्तिष्क में महत्वपूर्ण संरचनात्मक भूमिकाओं के लिए जाना जाता है, रक्त मस्तिष्क बाधा1 के भाग के रूप में और मस्तिष्क2भर में न्यूरॉन्स और synapses का समर्थन करके । न्यूरॉन्स का एस्ट्रोसाइट समर्थन संरचनात्मक 3 और मेटाबोलिक4 ,5दोनों है , जिसमें एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोजेनेसिस और सिंप्टोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं, जबकि सक्रिय न्यूरॉन्स 4 ,6,7को लैक्टेट जैसे प्रमुख मेटाबोलाइट्स भी प्रदान करते हैं। संरचनात्मक समर्थन की भूमिका से परे, एस्ट्रोसाइट्स सक्रिय कोशिकाएं हैं जो सीए2 + सिग्नलिंग और बफरिंग (सहज माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + प्रवाह सहित)8,9,कश्मीर+ बफरिंग10में भाग लेती हैं, और चोट के समय मस्तिष्क की जरूरतों के अनुकूल और प्रतिक्रिया कर सकती हैं11,12 . इस तरह की गतिशील कोशिकाओं होने के नाते, एस्ट्रोसाइट्स में मजबूत ऊर्जा आवश्यकताएं होती हैं, जिनके लिए एक कुशल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की आवश्यकता होती है। अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)13को बफर करने में भी इन माइटोकॉन्ड्रिया की महत्वपूर्ण भूमिका है । ऊर्जा उत्पादन और आरओएस बफरिंग की उनकी व्यक्तिगत या स्थानीय भूमिकाओं के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया एक नेटवर्क14के रूप में कार्य करता है। इस अर्थ में, वे क्रमशः15,नए/कम माइटोकॉन्ड्रिया और पुराने/ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करते हुए विखंडन और संलयन माइटोकॉन्ड्रिया के बीच संतुलन बनाए रखते हैं । एक सेल की समग्र रेडॉक्स स्थिति का अंदाजा माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की रेडॉक्स स्थिति से लगाया जा सकता है। पैथोलॉजी में, यह जानकारी का एक महत्वपूर्ण टुकड़ा है जो प्रकाश डाल सकता है जिस पर कोशिकाएं बेहतर ढंग से काम नहीं कर रही हैं।

हाल के वर्षों में, कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की गतिशीलता और कार्यों का अध्ययन करने के लिए कई सेंसर विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, ऊर्जा विनिमय (एटीपी), रेडॉक्स स्टेट (NADH/NAD+,ROS), और एंजाइमेटिक कार्यक्षमता (सीएएएमपी, सीए2 +,जेडएन2 +)को मापने वाले सेंसर वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन16के अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। उनमें से, माइटोटाइमर माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान (आकार, आकार, सतह क्षेत्र), गतिशीलता (गति, विस्थापन), और गतिशीलता (संलयन और विखंडनीय घटनाओं), साथ ही समग्र माइटोकॉन्ड्रियल टर्नओवर दर और रेडॉक्स राज्य में परिवर्तनों का पालन करने की अनुमति देता है। मिटोटाइमर एक उत्परिवर्ती लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, drFP58317है, जिसमें मानव साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस18, 19के उपइकैण आठवीं से एक माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नलहै, जो हरे (488 एनएम) में नए संश्लेषित माइटोकॉन्ड्रिया और लाल (555 एनएम) में ऑक्सीकृत माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना करने के लिए है। हरे (488 एनएम) और लाल (555 एनएम) फ्लोरेसेंस अनुपात का उपयोग करना व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया, उनके आकृति विज्ञान विश्लेषण, संलयन/विखंडन घटनाओं, और रेडॉक्स राज्य इतिहास20,21के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस अनूठी संपत्ति का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया की शारीरिक और रोग भूमिकाओं के बारे में कई वैज्ञानिक सवालों की जांच करने के लिए किया जा सकता है और इसलिए कई अलग-अलग सेल प्रकारों के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र का अनावरण करने के लिए बहुत आशाजनक है।

हमने हाल ही में माइटोकॉन्ड्रिया के गतिशील और विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स इन विट्रो और वीवो22 में कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक नया लेंटीवायरल वेक्टर (एलवी-जी1-मिटोटाइमर-MiR124T, इसके बाद एलवी-जी1-मिटोटाइमर कहाजाताहै) विकसित किया है। एलवी-जी 1-मिंटोटाइमर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर gfaABC1D के एक कटे हुए संस्करण का उपयोग करता है, जिसमें B3 एन्हांसर (gfaABC1D (B3) कहा जाता है, इसके बाद पहले वर्णित miR124T न्यूरोनल डिटरगेटिंग सिस्टम23के साथ संयुक्त है। यह एस्ट्रो में एस्ट्रोसाइट्स और वीवो22में माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर की अनन्य अभिव्यक्ति की अनुमति देताहै । यहां प्रस्तुत चूहे हिप्पोकैम्पस एस्ट्रोसाइट्स की संस्कृति का प्रदर्शन करने और उन्हें एलवी-जी1-मिटोटाइमर बायोसेंसर से लैस करने के लिए विभिन्न कदम हैं, साथ ही लगातार कई घंटों/दिनों के दौरान एस्ट्रोसाइट माइटोकॉन्ड्रिया के व्यवहार का पालन करने के लिए विभिन्न माइक्रोस्कोपी कदम हैं।

Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल एक नैतिक समिति (समझौते VD3602, लुसाने, स्विट्जरलैंड) के अनुमोदन के साथ किया गया है और जानवरों के उपयोग के लिए यूरोपीय दिशा निर्देशों का पालन करता है ।

1. चूहा हिप्पोकैम्पल एस्ट्रोसाइट प्राथमिक संस्कृति

  1. प्रसवोत्तर दिन 1-2 में डेपुटेशन द्वारा पांच चूहे पिल्ले (Wistar IGS चूहा) का बलिदान ।
  2. मस्तिष्क को निकालें और इसे ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त पेट्री डिश में रखें (ग्लूटामैक्स के साथ डीएमईएम 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% ताजा हॉर्स सीरम के साथ पूरक)।
  3. हिप्पोकैम्पस को अलग-थलग करें। एस्ट्रोसाइटिक माध्यम के 5 एमएल में 21 जी सुई और तीन मार्ग के माध्यम से 25 जी सुई के माध्यम से तीन मार्ग से अलग करें।
  4. अलग कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और हीमोसाइटोमीटर में गिनें।
  5. प्लेट 20,000-25,000 कोशिकाओं/सेमी2 मल्टीवेल व्यंजनों में (9.4 मिमी x 10.7 मिमी x 9.3 मिमी) और उन्हें बाकी प्रयोग के लिए 5% सीओ2 वाले वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. माध्यम को पूरी तरह से 3 दिनों में विट्रो (DIV3) में बदलें।
  7. DIV8 में, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस + 0.01% बीएसए) में पतला माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर मिटोटाइमर (एलवी-जी1-मिटोटाइमर22)के लिए लेंटीवायरल वेक्टर कोडिंग के प्रति सेल पी24 एंटीजन के 0.6 स्नातकोत्तर जोड़ें।
  8. DIV9 में, पूर्व-गर्म 1x बाँझ पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ धोएं और ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम जोड़ें।
  9. DIV11 में, पूर्व-गर्म 1x बाँझ पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ 2 वॉश करें और फेनोल लाल के बिना ताजा एस्ट्रोसाइट माध्यम जोड़ें।
    नोट: कोटिंग का विकल्प अभीष्ट परख पर निर्भर करता है। एस्ट्रोसाइट प्राथमिक संस्कृति के लिए एक मानक कोटिंग के रूप में, बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (जैसे, मैट्रिक्स) के 0.2 मिलीग्राम/एमएल पॉली-डी-लिसाइन या8.7 माइक्रोन/सेमी 2 का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की कल्पना करने के लिए, चपटी और फैला हुई कोशिकाओं पर काम करना आवश्यक है। इस संदर्भ में, आईवीडीआई यू-स्लाइड्स पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स का संयोजन सबसे उपयुक्त है। फेनोल लाल रंग के साथ काम करना भी महत्वपूर्ण नहीं है, जो प्रकाश के बार-बार संपर्क में आने वाले कोशिका के लिए विषाक्त है।

2. माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की दीर्घकालिक निगरानी।

  1. एलवी-जी1-मिटोटाइमर के साथ लेंटीवायरल संक्रमण के बाद एस्ट्रोसाइटिक माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम का कम से कम 3-5 दिन का आकलन करें (माइटोकॉन्ड्रिया में पर्याप्त स्तर पर फ्लोरेसेंस की अनुमति दें)।
  2. अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित एक उल्टे माइक्रोस्कोप और अधिग्रहण के पूर्ण स्वचालन के लिए एक मॉड्यूल के साथ कोशिकाओं छवि ।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सॉफ्टवेयर और मॉड्यूल के विवरण के लिए सामग्री की तालिका का उल्लेख करें।
  3. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप पूरे प्रयोग में 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एस्ट्रोसाइट संस्कृति को बनाए रखने के लिए एक पिंजरे इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिकादेखें) से लैस है।
  4. ग्रीन (ग्रीन चैनल के लिए 500-540 एनएम) और लाल (रेड चैनल के लिए 550-540 एनएम) और लाल (लाल चैनल के लिए 550-600 एनएम) फ्लोरेसेंस संकेतों का पता लगाने के साथ 490 एनएम (ग्रीन चैनल के लिए) और 550 एनएम पर अनुक्रमिक उत्तेजन का उपयोग करके फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें।
  5. 40x के आवर्धन का उपयोग करके एलवी-जी1-मिटोटाइमर के पर्याप्त स्तर को व्यक्त करने वाले माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के साथ 5 एस्ट्रोसाइट्स का चयन करें। एस्ट्रोसाइट्स को यथासंभव सपाट और बड़े के रूप में चुनने और कोशिकाओं के समूहों (व्यक्तिगत कोशिकाओं पर काम करने के लिए) में स्थित नहीं होने का ध्यान रखें।
  6. एक्सएलएम फाइल (map.xlm) में 5 चयनित कोशिकाओं के निर्देशांक को सहेजें। यह map.xlm उपयोगकर्ता को समय के साथ एक ही कोशिकाओं पर लौटने की अनुमति देता है।
  7. प्रत्येक निर्देशांक के लिए 150x (100x तेल विसर्जन उद्देश्य, 1.5x मध्यवर्ती आवर्धन) के आवर्धन का उपयोग करके छवि दृश्यों (60 एस के लिए 1 छवि/एस) प्राप्त करें।
  8. एक ही एस्ट्रोसाइट्स 6 एच, 12 एच, और उपचार के बाद 24 घंटे के लिए छवि अधिग्रहण (60 एस के लिए 1 छवि/एस) दोहराएं।
    नोट: एक तेज और कुशल ऑटोफोकस प्रणाली से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इस संदर्भ में परफेक्ट फोकस सिस्टम (पीएफएस) नामक हार्डवेयर सॉल्यूशन का इस्तेमाल किया गया। पीएफएस लंबी अवधि की इमेजिंग जांच के दौरान वास्तविक समय में अक्षीय फोकस उतार-चढ़ाव का मुकाबला करने के लिए निकट अवरक्त 870-एनएम एलईडी और सीसीडी लाइन सेंसर का उपयोग करता है।

3. व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और एलवी-जी 1-मिटोटिमर अनुपात का विश्लेषण

नोट: निकॉन से एनआईएस जनरल एनालिसिस 3 (GA3) का उपयोग इस अध्ययन में मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए किया गया था।

  1. प्रत्येक इमेज सीक्वेंस (बेसलाइन, 6 एच, 12 एच, 24 एच) के लिए, एनडी प्रोसेसिंग > सेलेक्ट फ्रेम पर क्लिक करके लाल और हरे चैनलों के लिए पहला फ्रेम चुनें।
  2. मर्ज चैनल के > रूपांतरणों का चयन करके लाल और हरे चैनलों को मर्जकरें ।
  3. इमेज शेडिंग को सही करने के लिए, ऑटो शेडिंग करेक्शन > प्रीप्रोसेसिंग काचयन करें ।
  4. रोलिंग बॉल > प्रीप्रोसेसिंगका चयन करके रोलिंग बॉल एल्गोरिदम लागू करें।
  5. प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन के लिए बाइनरी मास्क उत्पन्न करने के लिए, सेगमेंटेशन > थ्रेसहोल्डका चयन करें।
  6. बाइनरी प्रोसेसिंग> टचिंग बॉर्डर का चयन करके सीमा से काटी गई किसी भी वस्तु > हटा दें .
  7. सतह क्षेत्र को मापने के लिए, ऑब्जेक्ट एरिया > माप का चयन करें।
  8. व्यास को मापने के लिए, माप > Eq व्यासका चयन करें ।
  9. लंबाई मापने के लिए, माप > लंबाईका चयन करें ।
  10. चौड़ाई मापने के लिए, माप > चौड़ाईका चयन करें।
  11. खुरदरापन मापने के लिए, मापने > खुरदरापन काचयन करें ।
  12. परिपत्रता को मापने के लिए, माप > परिपत्रताका चयन करें ।
  13. विस्तार को मापने के लिए, माप > विस्तार काचयन करें ।
  14. उपरोक्त माप के साथ एक समूह (दाएं क्लिक) की रचना करें और इसे मोर्फोडाटा के रूप में बदलें।
  15. माप माप > मतलब तीव्रता का चयन करके हरी तीव्रता का मतलब है।
  16. माप का अर्थ है माप > मतलब तीव्रताका चयन करके लाल तीव्रता ।
  17. लाल/हरित अनुपात को मापने के लिए, माप > अनुपातका चयन करें ।
  18. उपरोक्त माप के साथ एक समूह (दाएं क्लिक) की रचना करें और इसे अनुपातडेटा के रूप में बदलें।
  19. सीएसवी को संदर्भ > तालिका का चयन करके सीएसवी फाइल को टेबल निर्यात करें।
  20. सेव ए का चयन करके विश्लेषण की GA3 स्क्रिप्ट को बचाएं
    नोट: इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले मानदंडों की एक गैर-संपूर्ण सूची चित्रा 1, तालिका 1और तालिका 2में संक्षेप में दी गई है। विश्लेषण GA3 स्क्रिप्ट फ़ाइल पूरक(पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 और चित्रा 2)में उपलब्ध है। उपयोग की जाने वाली थ्रेसहोल्ड को यथासंभव अधिक से अधिक माइटोकॉन्ड्रिया को व्यक्तिगत बनाने के लिए अनुकूलित किया गया था (जहां संभव हो बड़े माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को छोड़कर)। जहां भी संभव हो, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क या तो मैन्युअल रूप से व्यक्तिगत हैं या विश्लेषण से बाहर हैं। अंतरकोशिकीय परिवर्तनशीलता के कारण, इन विश्लेषणों को कम से कम 20-25 कोशिकाओं प्रति स्थिति (कोशिका द्वारा न्यूनतम 50 माइटोकॉन्ड्रिया के साथ) पर करें।

4. माइटोकॉन्ड्रियल मोटिविटी का विश्लेषण

नोट: माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलनों की उच्च जटिलता के कारण, मैनुअल मोटिवेशन विश्लेषण पसंद किया जाता है। यहां, निकॉन के एनआईएस तत्व प्रणाली का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया को मैन्युअल रूप से ट्रैक करने के लिए किया गया था।

  1. एनआईएस में ट्रैकिंग मॉड्यूल खोलें, व्यू > एनालिसिस > ट्रैकिंग काचयन करें।
  2. नई आरओआई को परिभाषित करनेपर क्लिक करें ।
  3. स्वचालित डिटेक्शन टूलके साथ, छवि अनुक्रम की पहली छवि पर 25-50 माइटोकॉन्ड्रिया का चयन करें।
  4. ट्रैक ऑटोस पता लगाया ROIs विश्लेषणपर क्लिक करें ।
  5. यदि आवश्यक हो, तो गलत आरओआई ट्रैक हटा दें।
  6. सीएसवी फ़ाइल को तालिका का निर्यात करें।
    नोट: इस प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले मानदंडों की एक गैर-संपूर्ण सूची चित्र 1 और तालिका 3में संक्षेप में प्रस्तुत की गई है। एक ट्रैकिंग विश्लेषण आम तौर पर हर ट्रैक ऑब्जेक्ट के केंद्र के आंदोलनों को दर्शाते हुए एक रास्ता देता है। ट्रैकिंग विकल्प में अलग-अलग ट्रैकिंग विकल्प सेट किए जाने चाहिए। अलग माइटोकॉन्ड्रिया के चयन का पक्ष लेते हैं जो ट्रैकिंग की सुविधा के लिए एक दूसरे से पर्याप्त रूप से दूर हैं। केवल उन वस्तुओं को रखें जिन्हें पूरे अनुक्रम पर लगातार ट्रैक किया जा सकता है। खराब गुणवत्ता ट्रैकिंग के कारण आउटलर्स को हटाने के लिए उसी तरह आगे बढ़ें। नतीजतन, इस खंड में विश्लेषण की गई वस्तुओं का सेट स्थिर रूपात्मक विश्लेषणों के लिए विश्लेषण किए गए एक से अलग है और आम तौर पर छोटा होगा।

5. डेटा परिवर्तन, सामान्यीकरण और सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट: मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया की उच्च विषमता के कारण, उत्पन्न डेटा में अक्सर गैर-सामान्य वितरण होता है।

  1. प्रसंस्करण से पहले मापों को मैन्युअल रूप से लॉग-ट्रांसफॉर्म करें।
  2. प्रत्येक विश्लेषण और समय सीमा के लिए, संदर्भ अधिग्रहण में प्राप्त लोगों के मतलब से परिणामी डेटा को मैन्युअल रूप से सामान्य करें।
  3. इसके अलावा, एक नियंत्रण स्थिति के लिए एक दूसरे/डबल सामान्यीकरण पर विचार करें, उदाहरण के लिए, एक उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए ।
  4. फिर, दो तरह से मिलान किए गए इनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें। यहां ग्राफपैड प्रिज्म V8 का इस्तेमाल किया गया था।

Representative Results

एलवी-जी1-मिटोटाइमर से संक्रमित एस्ट्रोसाइट्स की प्राथमिक संस्कृति ने विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का प्रदर्शन किया। उपचार से पहले, एलवी-जी1-मिटोटाइमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स ने विषम माइटोकॉन्ड्रियल आकार और विभिन्न हरे/लाल फ्लोरेसेंस तीव्रता(चित्र 3, चित्र 4और वीडियो 1)को दिखाया। एलवी-जी1-मिटोटाइमर को व्यक्त करने वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों की माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की निगरानी एच2 0 2 (10माइक्रोन) के साथ इनक्यूबेशन से पहले और बाद में की गई थी। ऊपर वर्णित विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सुविधाओं की गणना 12 घंटे (हर 3 घंटे) से अधिक की गई थी और उनकी प्रारंभिक स्थिति में सामान्यीकृत (सेल द्वारा सेल) किया गया था। रूपात्मक स्तर(चित्रा 3 बी)पर, एच2ओ2 का प्रभाव लगभग 6 घंटे पर दिखाई देना शुरू कर देता है। दरअसल, माइटोकॉन्ड्रिया खंडित थे (लंबाई, सतह क्षेत्र और विस्तार कारक की कमी)। यह विखंडन उपचार के बाद और भी स्पष्ट है 12 घंटे। ध्यान रहे कि व्यास, चौड़ाई और स्पिरसिटी को कम नहीं किया गया। एच 2 ओ 2 उपचार के बाद रेडॉक्स राज्य और कारोबार(चित्रा 3 सी),3एच के संबंध में, एस्ट्रोसाइट्स (माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस में तेजी से वृद्धि का परिणाम) में हरे रंग के माइटोकॉन्ड्रिया का अनुपात बढ़ गया। 6 घंटे में, हरे/लाल अनुपात बेसलाइन स्तर पर लौट आए, लेकिन विशुद्ध रूप से लाल माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या बेसल के स्तर से काफी बढ़ गई । 12 एच के बाद, एच2ओ2 के ऑक्सीडेटिव उपचार के परिणाम दिखाई दे रहे थे और इसके परिणामस्वरूप लाल विराम के अनुपात और संख्या में पर्याप्त वृद्धि हुई। उपचार के बाद गतिशीलता और गतिशीलता(चित्रा 3 डी),3 एच के संबंध में, सभी मानदंडों में क्षणिक वृद्धि हुई । लंबी अवधि (12 एच) में, माइटोकॉन्ड्रिया अधिक धीरे-धीरे और कम दूरी पर चला गया।

Figure 1
चित्रा 1:एलवी-जी1-माइटोटाइमर बायोसेंसर व्यक्त करने वाली एस्ट्रोसाइट संस्कृति। (ए)एलवी-जी1-मिटोटिमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स की कॉन्फोकल तस्वीरें । (ख)विखंडन के विभिन्न स्तरों के साथ कम (हरे) संतुलित (नारंगी) और ऑक्सीकृत (लाल) माइटोकॉन्ड्रिया की कॉन्फोकल तस्वीरों का चयन। (ग)एलवी-जी1-माइटोटाइमर को व्यक्त करते हुए एस्ट्रोसाइट में विश्लेषण के लिए उपलब्ध विभिन्न मानदंडों का सारांश आरेख । स्केल बार: (A)ऊपरी पैनल: 50 माइक्रोन, लोअर पैनल: 10 माइक्रोन,(B)1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और अनुपात विश्लेषण। (A)GA3 स्क्रिप्ट का अवलोकन व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और अनुपात के विश्लेषण के लिए । (ख)एलवी-जी1-माइटोटाइमर को व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट की प्रारंभिक तस्वीरों का GA3 स्क्रिप्ट के साथ विश्लेषण किया गया । (ग)एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम के लिए उत्पन्न बाइनरी मास्क का उदाहरण। स्केल बार: 10 माइक्रोन (बी-सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली पर एच2ओ2 का प्रभाव। (A)एस्ट्रोसाइट्स की तस्वीरें एलवी-जी1-मिंटोटाइमर 1 घंटे पहले और 6 घंटे, पीबीएस (सीटीआरएल) के साथ उपचार के बाद 24 घंटे और एच2ओ2के 10 माइक्रोनएम व्यक्त करती हैं । (ख)माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी के रडार चार्ट,(सी)रेडॉक्स स्टेट एंड टर्नओवर, और(डी)गतिशीलता मानदंडों का मूल्यांकन बेसलाइन के दौरान एस्ट्रोसाइट्स पर किया गया और एच 2 ओ 2 उपचार के बाद 3 एच, 6 एच और12घंटे । एसए: सतह क्षेत्र; डी: व्यास; एल: लंबाई; डब्ल्यू: चौड़ाई; आर: गोलाई; एस: स्पिरसिटी; EF: विस्तार कारक (=L/W); G/R: व्यक्तिगत लाल/हरे अनुपात; Gpuncta: हरे समय तक माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत; Rpuncta: लाल puncta माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत; जिला: विस्थापन; टीआर: ट्रैक की लंबाई; एसपी और एसपीवी: गति और गति विचरण; एसटीआर: सीधापन। स्केल बार: 20 माइक्रोन (ए) और 2.5 माइक्रोन (इनसेट)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एलवी-जी1-मिंटोटिमर व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स की तस्वीरें और बेसलाइन के दौरान एक सजातीय और संतुलित माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क दिखा रही हैं। स्केल बार: 20 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली पर एच2 ओ2 उपचार का प्रभाव। एच 2 ओ2उपचार (बेसलाइन) से पहले एस्ट्रोसाइटिक माइटोकॉन्ड्रिया, साथ ही गैर-उपचारित नियंत्रण कोशिका की तुलना में एच2ओ 2 उपचार के बाद 6 एच और 24 घंटे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

आकृति विज्ञान मानदंड श्रेणी टिप्पणियां
सतह क्षेत्र (एसए) 0.5-4 माइक्रोन2 ये मानदंड माइटोकॉन्ड्रिया की खंडित-लम्बी विशेषताओं पर सूचित करते हैं। वे आम तौर पर एक ही दिशा में विकसित होते हैं। खंडित माइटोकॉन्ड्रिया में सतह क्षेत्र, व्यास, लंबाई और विस्तार कारक में कमी आएगी, जबकि गोलाई, स्पिरसिटी और चौड़ाई अपरिवर्तित या बढ़ सकती है।
व्यास (डी) 0.5-1.5 माइक्रोन
लंबाई (एल) 0.5-5 माइक्रोन
चौड़ाई (डब्ल्यू) 0.5-2 माइक्रोन
गोलाई (नि.) 0–1
स्पाइरिसिटी (एस) 0–1
विस्तार कारक (EF = L/W) 1–10

तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के लिए चयनित मापदंडों का सारांश।

रेडॉक्स राज्य मानदंड श्रेणी टिप्पणियां
व्यक्तिगत अनुपात (जी/आर) 0–10 अनुपात रेडॉक्स राज्य के परिणाम को इंगित करता है। यह कोशिका में माइटोकॉन्ड्रिया की सामान्य स्थिति और उम्र के बारे में सूचित करता है। यह विचार करना आवश्यक है कि यह अनुपात बायोजेनेसिस और माइटोकॉन्ड्रिया के क्षरण और कम माइटोकॉन्ड्रिया के साथ ऑक्सीडाइज्ड माइटोकॉन्ड्रिया का विखंडन/संलयन है । इसलिए हरे और लाल समय का समय की संख्या का मूल्यांकन शक्तिशाली परिणामों की व्याख्या करने में मदद कर सकता है।  हरे रंग की विराम्ता माइटोकॉन्ड्रिया निर्धारित किया जाता है जब हरे रंग की तीव्रता लाल रंग की 10 गुना होती है। लाल विराम माइटोकॉन्ड्रिया तब निर्धारित होता है जब लाल रंग की तीव्रता हरे रंग की तुलना में 10 गुना अधिक होती है। एस्ट्रोसाइट की रेडॉक्स स्थिति उस कोशिका के सभी माइटोकॉन्ड्रिया अनुपात का औसत है।
हरे रंग के समय्टा माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत (जीपंचा) 0%–100%
लाल समय पर माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिशत (आरपंक्चरा) 0%–100%

तालिका 2: माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य के लिए चयनित मापदंडों का सारांश।

गतिशीलता मानदंड श्रेणी टिप्पणियां
विस्थापन (डिस) 0-10 माइक्रोन साथ में इन सुविधाओं नेटवर्क की सामान्य गतिशीलता गतिशीलता को सूचित करते हैं। स्थिर माइटोकॉन्ड्रिया कम गति के साथ कम विस्थापन और ट्रैक लंबाई प्रदर्शित करता है। दूसरी ओर, दोलनीय कणों को ट्रैक की लंबाई और विस्थापन (जिसके परिणामस्वरूप कम सीधापन) और स्थिर की तुलना में बढ़ी हुई गति के बीच अंतर के साथ विभेदित किया जा सकता है।
ट्रैक लंबाई (टीआर) 0-10 माइक्रोन
गति और गति भिन्नता (एसपी और एसपीवी) 0-1.5 माइक्रोन/एस ± 0.2 μm/s
सहीपन 0–1
(एसटीआर = विस्थापन/ट्रैक लंबाई)

तालिका 3: माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के लिए चयनित मापदंडों का सारांश।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए GA3 स्क्रिप्ट फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां, एक सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट में माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की गतिशीलता और कारोबार का पालन करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तावित है। कोशिकाओं के एक निश्चित समूह या एक समय में एक व्यक्तिगत कोशिका पर एक समय-चूक दृष्टिकोण के विपरीत (अक्सर साहित्य में उपयोग किया जाता है)24,25,शोधकर्ता एक ही व्यक्तिगत कोशिकाओं पर कई दिनों के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम के विकास का पालन कर सकते हैं। एकल अच्छी तरह से लाइव इमेजिंग के विपरीत जहां प्रकाश जोखिम के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है, और कई व्यक्तिगत कोशिकाओं का चयन कम संभव है, प्रस्तावित विधि इस माइक्रोस्कोप की एक अच्छी तरह से विभिन्न क्षेत्रों में कई विभिन्न कोशिकाओं को छवि बनाने और उन्हें फिर से छवि करने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर उन समान कोशिकाओं पर वापस आने की क्षमता का लाभ उठाती है। ब्याज की प्रत्येक कोशिका पर प्रत्येक मापा मापदंड के लिए किए गए एक आधार रेखा के लिए सामान्यीकरण के लिए धन्यवाद, यह माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम की जटिलता को ध्यान में रखता है और अपनी आधारभूत छवि के सापेक्ष प्रत्येक कोशिका पर उपचार के प्रभाव की जांच करता है। माइक्रोस्कोप की क्षमता स्वायत्त रूप से एक समय में 16 कुओं तक इमेजिंग के इस प्रकार को पूरा करने के लिए (इमेजिंग 5 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह) माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली की विषमता के लिए अनुमति देता है जो विभिन्न दिनों में विभिन्न स्थितियों इमेजिंग के साथ आने वाली प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के बिना विश्लेषण के दौरान ठीक से ध्यान में रखा जा सकता है।

संस्कृतियों की गुणवत्ता, एलवी-जी1-माइटोटाइमर बायोसेंसर, माइक्रोस्कोप और उद्देश्यों के प्रकार, और उपयुक्त कोशिकाओं का चयन व्यक्त करने वाले वायरल संक्रमणों का स्तर महत्वपूर्ण चर हैं जो इस प्रोटोकॉल में यथासंभव सुसंगत रहना चाहिए। सेल घनत्व, वेक्टर के प्रकार, और वायरल टाइटर्स को प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि पिछले काम से पता चलता है कि एलवी-जी 1-मिटोटाइमर अभिव्यक्ति में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और गतिशीलता21, 22,26, 27के लिए कोई हानिकारक परिणाम नहीं है, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि कोशिकाओं के लिए एकाग्रता विषाक्त नहीं है (उदाहरण के लिए, नियंत्रण में कोशिकाओं की कुल संख्या की जांच अच्छीतरहसे)। जैसा कि एक फोकल प्लेन का उपयोग किया जाता है, एस्ट्रोसाइट्स होना चाहिए: (1) जितना संभव हो उतना सपाट, (2) अन्य लेबल कोशिकाओं से अलग (पकवान में विस्थापन के मामले में विश्लेषण को सरल बनाने के लिए), और (3) उच्च फ्लोरेसेंस स्तर रखते हैं। चूंकि संस्कृति में कोशिकाएं आकृति विज्ञान में अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती हैं, इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रणाली अत्यधिक विषम हो सकती है। इस संदर्भ में, आरओआई का विश्लेषण करना (और पूरी कोशिका नहीं) कुछ समस्याग्रस्त क्षेत्रों, जैसे कि पेरिन्यूक्लियर क्षेत्रों के लिए क्षतिपूर्ति करता है, और परिवर्तनशीलता को कम करता है। अपेक्षाकृत समान कोशिकाओं और नमूने पर यथासंभव अधिक से अधिक कोशिकाओं पर आधारभूत करना आवश्यक है। नतीजतन, उच्च सामग्री अधिग्रहण और विश्लेषण माइक्रोस्कोप आदर्श रूप से अनुकूल हैं। इस देशांतर निगरानी के दौरान, बायोसेंसर ब्लीचिंग से बचने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में अधिक नहीं करना भी महत्वपूर्ण है।

यह इमेजिंग विधि इसकी जटिलताओं के बिना नहीं है, और पूरे प्रोटोकॉल में, कई नोट्स शामिल हैं, जो माइक्रोस्कोप के साथ पिछले परीक्षणों के दौरान किए गए समस्या निवारण को ध्यान में रखते हैं। उदाहरण के लिए, इस्तेमाल की गई प्लेट कोटिंग का विकल्प अभीष्ट परख पर निर्भर करता है, लेकिन एस्ट्रोसाइट प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सबसे उपयुक्त विकल्पों के लिए सिफारिशों को शामिल किया गया है। इसके अतिरिक्त, अंतरकोशिकीय परिवर्तनशीलता के कारण प्रति शर्त कम से कम 5 कोशिकाओं पर छवि अधिग्रहण किया जाना चाहिए। अधिक विशेष रूप से, बेसलाइन इमेजिंग में चयनित कुछ कोशिकाएं मर जाएंगी, कुछ सौंपे गए छवि अधिग्रहण क्षेत्र के फ्रेम से बाहर निकल जाएंगी, और कुछ अपनी आकृति विज्ञान को बदल देंगे, जिससे माइटोकॉन्ड्रिया विश्लेषण में व्यक्तिगत होना बहुत मुश्किल हो जाएगा। शुरुआत से कई कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोग के अंत में विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं के एक बड़े पर्याप्त नमूना आकार की संभावना में वृद्धि। इस इमेजिंग तकनीक के अधिक जटिल पहलुओं के अलावा, जहां तक इमेजिंग और विश्लेषण के इस प्रकार से लाभ हो सकता है, कुछ एकमुश्त सीमाएं हैं। छवि अधिग्रहण के स्वचालितीकरण का पूरा लाभ उठाने के लिए, उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप में एक ऑटोफोकस सिस्टम होना चाहिए जो छवियों के बीच समय अंतराल की गति को संभाल सके (यानी, इस प्रोटोकॉल में हर 3 एस) और प्रत्येक छवि को लेने से पहले लगातार प्रश्न में सेल पर ध्यान केंद्रित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, जॉब्स सॉफ्टवेयर के बिना, जो पूरी छवि अधिग्रहण प्रक्रिया को स्वचालित करता है, यह विधि कोशिकाओं की संख्या के आधार पर दुरूह और संभावित रूप से असंभव हो जाती है क्योंकि इसे उचित समय बिंदु पर प्रत्येक कोशिका को फिर से खोजने और इमेजिंग की आवश्यकता होगी। अंत में, यह इमेजिंग विधि फोटोब्लैचिंग के मुद्दे से प्रतिरक्षा नहीं है। इस कारण से, किसी भी दीर्घकालिक अधिग्रहण विधि के साथ, फ्लोरोसेंट मार्कर चुनना महत्वपूर्ण है जो फोटोब्लैचिंग के लिए कम संवेदनशील हैं और जितना संभव हो इस मुद्दे से बचने के लिए छवि अधिग्रहण दर्जी करते हैं।

यह तकनीक वर्तमान में एक महत्वपूर्ण तरीके से उपयोग किए जाने वाले अन्य लोगों से अलग है। अन्य समय-चूक अध्ययनों के विपरीत, इस तकनीक को पूरे समय में एक ही स्थिति पर इमेजिंग की आवश्यकता नहीं होती है, न ही अन्य क्षेत्रों को छवि बनाने के लिए प्लेट के मैनुअल आंदोलन की आवश्यकता होती है। यह शोधकर्ताओं को एक 24 घंटे की समय सीमा में कई स्थितियों में कई कोशिकाओं को छवि करने की क्षमता की अनुमति देता है । नतीजतन, प्रत्येक कुएं में कई कोशिकाओं पर इस इमेजिंग और विश्लेषण को पूरा करने की क्षमता एक ही जनसंख्या जानकारी देती है जो एक ही जनसंख्या जानकारी देती है जो कोशिकाओं के एक बड़े समूह का मोटे तौर पर अध्ययन करने से प्राप्त होती है, जबकि इसके अतिरिक्त प्रत्येक कोशिका से विशिष्ट उपाय प्रदान करती है। जबकि इस विधि के लिए कुछ विशिष्टताएं अन्य छवि अधिग्रहण विधियों (ऊपर उल्लिखित) पर लागू नहीं हो सकती हैं, लाभ अधिग्रहण के बाद संभव विश्लेषण के प्रकार के साथ जटिलताओं से पल्ला झाड़ लेते हैं। यह तकनीक शोधकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रियल सिस्टम पर विभिन्न उपचारों के सटीक असर को देखने की अनुमति देती है, और नतीजतन, सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स पर।

इसके अतिरिक्त, यह विधि विशिष्ट संदर्भों में माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार और भूमिकाओं के बारे में कई अलग-अलग वैज्ञानिक प्रश्नों के लिए अत्यधिक अनुकूलन योग्य है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल विशेष रूप से सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स के साथ सौदों। हालांकि, कई अन्य सेल प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है, और जिन उपचारों का परीक्षण किया जा सकता है, वे केवल जांच किए जा रहे प्रश्नों द्वारा सीमित हैं। इमेजिंग के इस प्रकार के सामूहिक ज्ञान और माइटोकॉन्ड्रियल व्यवहार की समझ अग्रिम करने की क्षमता है, अंतर्निहित तंत्र है कि माइटोकॉन्ड्रियल रोग के लिए नेतृत्व, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मौजूद सहज गतिशीलता पर कई विकृतियों के प्रभाव।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को केआर और लुसाने विश्वविद्यालय अस्पताल (CHUV) को सम्मानित एक सिनेप्सिस फाउंडेशन फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों को उनकी मदद के लिए Nikon धंयवाद, विशेष रूप से जे Gannevat ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide 8 Well IBIDI 80807
19 G needle Plexus SANTE PL001213
21 G needle Plexus SANTE PL000142
25 G needle Plexus SANTE PL000133
Bovin Serum Albumin LIFE TECH 15260037
Camera HAMAMATSU ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) THERMOFISHER 61965059
Glutamax Supplement THERMOFISHER 35050061
Horse Serum SIGMA 16050122
Lens Nikon Instruments CFI Plan Fluor 100x Oil
Light Engines LUMENCOR SPECTRA X
Linear-encoded motorized platine Nikon Instruments N/A
Microscope Nikon Instruments ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module OKOLAB H201-NIKON-TI-S-ER
PBS 1x liquid THERMOFISHER 20012068
Penicillin-Streptomycin SIGMA 15140122
Petri dishes 100 mm SIGMA P5731
Petri dishes 35 mm SIGMA CLS430165
Pregnant Rats CHARLES RIVERS 3
Software Nikon NIS-HC Nikon Instruments NIS-Elements HC
Sofware Prism GraphPad V8.02
Stericup 500 mL MERCK MILLIPORE 10412701

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न्यूरोसाइंस अंक 177
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Espourteille, J., Zufferey, V., Laurent, J. H., Richetin, K. Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes. J. Vis. Exp. (177), e62957, doi:10.3791/62957 (2021).

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