Summary
Denne artikkelen beskriver metoden for mitokondrie-tidsforløpavbildning av astrocyttkulturer utstyrt med MitoTimer biosensor og den resulterende multiparametriske analysen av mitokondriedynamikk, mobilitet, morfologi, biogenese, redokstilstand og omsetning.
Abstract
Mens mye oppmerksomhet har blitt gitt til mitokondrieendringer på nevronnivå, viser nyere bevis at mitokondriedynamikk og funksjon i astrocytter er implisert i kognisjon. Denne artikkelen beskriver metoden for tidsforløpavbildning av astrocyttkulturer utstyrt med en mitokondriebiosensor: MitoTimer. MitoTimer er et kraftig og unikt verktøy for å vurdere mitokondriedynamikk, mobilitet, morfologi, biogenese og redokstilstand. Her presenteres de forskjellige prosedyrene for kultur, bildeanskaffelser og påfølgende mitokondrieanalyse.
Introduction
Astrocytter er kritiske aktører i vedlikehold av hjernen homeostase. De er kanskje mest kjent for å ha betydelige strukturelle roller i hjernen, som en del av blod-hjernebarrieren1 og ved å støtte nevroner og synapser i hele hjernen2. Astrocyttstøtte av nevroner er både strukturell3 og metabolsk4,5, med astrocytter som fremmer nevrogenese og synaptogenesis, samtidig som de gir viktige metabolitter som laktat til aktive nevroner4,6,7. Utover rollen som strukturell støtte, astrocytter er aktive celler som deltar i Ca2 + signalering og bufring (inkludert spontan mitokondrie Ca2 + tilstrømninger)8,9, K+ buffering10, og kan tilpasse seg og reagere på hjernens behov i tider med skade11,12 . Som slike dynamiske celler har astrocytter robuste energibehov, noe som krever et effektivt mitokondrienettverk. Disse mitokondriene har også en avgjørende rolle i buffering av overdreven reaktive oksygenarter (ROS)13. I tillegg til deres individuelle eller lokale roller som energigenerering og ROS-bufring, fungerer mitokondrier som et nettverk14. I denne forstand opprettholder de likevekt mellom fisjon og fusjon av mitokondrier, som representerer nye / reduserte mitokondrier og eldre / oksidert mitokondrier, henholdsvis15. Den generelle redokstilstanden til en celle kan måles av redokstilstanden til mitokondrienettverket. I patologi er dette et kritisk stykke informasjon som kan kaste lys over hvilke celler som kanskje ikke fungerer optimalt.
De siste årene har mange sensorer blitt utviklet for å studere dynamikken og funksjonene til mitokondrier i celler. Sensorer som måler energiutveksling (ATP), redokstilstand (NADH/NAD+, ROS) og enzymatisk funksjonalitet (cAMP, Ca2+, Zn2+) brukes for tiden i studiet av mitokondriefunksjon16. Blant dem tillater MitoTimer å følge endringene i mitokondriemorfologi (størrelse, form, overflateareal), mobilitet (hastighet, forskyvning) og dynamikk (fusjons- og fisjonshendelser), samt den generelle mitokondrieomsetningshastigheten og redokstilstanden. MitoTimer er et mutant rødt fluorescerende protein, drFP58317, med et mitokondriesignal fra subenhet VIII av humant cytokrom coksidase 18,19 for å visualisere nylig syntetiserte mitokondrier i grønt (488 nm) og oksidert mitokondrier i rødt (555 nm). Ved hjelp av det grønne (488 nm) og røde (555 nm) fluorescensforholdet tillater samtidig evaluering av individuelle mitokondrier, deres morfologianalyse, fusjon / fisjonshendelser og redoks tilstandshistorie20,21. Denne unike egenskapen kan brukes til å undersøke mange vitenskapelige spørsmål om mitokondrienes fysiologiske og patologiske roller og er derfor svært lovende for å avduke de underliggende mekanismene for mitokondriedynamikk i mange forskjellige celletyper.
Vi har nylig utviklet en ny lentiviral vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, heretter kalt LV-G1-MitoTimer) for å studere mitokondriers dynamikk og funksjoner spesielt i astrocytter in vitro og in vivo22. LV-G1-MitoTimer bruker en avkortet versjon av glial fibrillary acidic protein (GFAP) promotor gfaABC1D, med en B3 enhancer (gfaABC1D (B3), heretter kalt G1) kombinert med den tidligere beskrevne miR124T nevronal detargeting system23. Det tillater eksklusivt uttrykk for mitokondriebiosensoren i astrocytter in vitro og in vivo22. Presentert her er de forskjellige trinnene for å utføre en kultur av rotte hippocampal astrocytter og utstyre dem med LV-G1-MitoTimer biosensor, samt de forskjellige mikroskopi trinnene for å følge oppførselen til astrocytt mitokondrier i flere påfølgende timer / dager.
Protocol
Den nåværende protokollen er utført med godkjenning av en etisk komité (avtale VD3602, Lausanne, Sveits) og følger europeiske retningslinjer for bruk av dyr.
1. Rotte hippocampal astrocytt primærkultur
- Ofre fem rottevalper (Wistar IGS Rat) ved halshugging på barseldag 1-2.
- Fjern hjernen og oppbevar den i en Petri-tallerken som inneholder 5 ml friskt astrocyttmedium (DMEM med GlutaMAX supplert med 1% Penicillin/Streptomycin og 10% fersk hesteserum).
- Isoler hippocampus. Dissosier i 5 ml av det astrocytiske mediet med tre passasjer gjennom en 21 G nål og tre passasjer gjennom en 25 G nål.
- Overfør de dissosierte cellene til et 15 ml sentrifugerør og tell i et hemocytometer.
- Plate 20,000-25,000 celler/cm2 i multiwell retter (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) og lagre dem ved 37 °C under en atmosfære som inneholder 5% CO2 for resten av eksperimentet.
- Skift ut mediet helt etter 3 dager in vitro (DIV3).
- Ved DIV8, tilsett 0,6 pg p24 antigen per celle av lentiviral vektorkoding for mitokondriebiosensor MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22) fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS + 0,01% BSA).
- Ved DIV9, vask med forvarmet 1x steril PBS (37 °C) og tilsett frisk astrocyttmedium.
- Ved DIV11, utfør 2 vasker med forvarmet 1x steril PBS (37 °C) og tilsett fersk astrocyttmedium uten fenolrød.
MERK: Valg av belegg avhenger av den tiltenkte analysen. Som et standardbelegg for astrocytt primærkultur anbefales det å bruke 0,2 mg/ml poly-D-lysin eller 8,7 μg/cm2 kjellermembranmatrise (f.eks. matrigel). For å visualisere mitokondriesystemet av astrocytter, er det viktig å jobbe med flate og strakte celler. I denne sammenhengen er kombinasjonen av kjellermembranmatrise på IBIDI u-lysbilder den mest egnede. Det er også viktig å ikke jobbe med fenolrød, noe som er giftig for cellen under gjentatt eksponering for lys.
2. Langsiktig overvåking av mitokondriesystemet.
- Vurder det astrocytiske mitokondriesystemet minst 3-5 dager etter lentivirale infeksjoner med LV-G1-MitoTimer (for å tillate et tilstrekkelig nivå av fluorescens i mitokondriene).
- Bilde cellene med et invertert mikroskop kontrollert av oppkjøps- og analyseprogramvaren og en modul for full automatisering av oppkjøpet.
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om programvaren og modulen som brukes i denne studien. - Sørg for at mikroskopet er utstyrt med en burinkubator (se Materialtabell) for å opprettholde astrocyttkulturen ved 5% CO2 og 37 °C gjennom hele eksperimentet.
- Ta fluorescensbilder ved hjelp av sekvensiell eksitasjon ved 490 nm (for grønn kanal) og 550 nm (for rød kanal) med deteksjon av grønne (500-540 nm for grønn kanal) og røde (550-600 nm for rød kanal) fluorescenssignaler.
- Velg 5 astrocytter per brønn med et mitokondrienettverk som uttrykker tilstrekkelige nivåer av LV-G1-MitoTimer ved hjelp av en forstørrelse på 40x. Pass på å velge astrocytter så flate og store som mulig og ikke plassert i klynger av celler (for å jobbe med individuelle celler).
- Lagre koordinatene til de 5 merkede cellene i en xlm-fil (map.xlm). Med dette kartet.xlm kan brukeren gå tilbake til de samme cellene over tid.
- Skaff bildesekvenser (1 bilde/s for 60 s) ved hjelp av en forstørrelse på 150x (100x olje nedsenkingsmål, 1,5x mellomliggende forstørrelse) for hver koordinat.
- Gjenta bildeanskaffelsen (1 bilde/s i 60 s) for de samme astrocyttene 6 timer, 12 timer og 24 timer etter behandlinger.
MERK: Bruk et mikroskop utstyrt med et raskt og effektivt autofokussystem. I denne sammenhengen ble maskinvareløsningen perfect focus system (PFS) brukt. PFS bruker nesten-infrarøde 870-nm LED- og CCD-linjesensorer for å bekjempe aksiale fokussvingninger i sanntid under langsiktige bildeundersøkelser.
3. Analyse av individuell mitokondriemorfologi og LV-G1-MitoTimer-forhold
MERK: NIS General Analysis 3 (GA3) fra Nikon ble brukt til å automatisere morfometrisk analyse i denne studien.
- For hver bildesekvens (grunnlinje, 6 t, 12 t, 24 t) velger du den første rammen for røde og grønne kanaler ved å klikke på ND Processing > Select Frame.
- Slå sammen de røde og grønne kanalene ved å velge Konverteringer > Slå sammen kanal.
- Hvis du vil rette skyggelegging av bilder, velger du Forhåndsbehandling > Korrigering av automatisk skyggelegging.
- Bruk algoritmen Rullende ball ved å velge Forhåndsbehandling > Rullende ball.
- Hvis du vil generere binære masker for hvert mitokondridrier, velger du Segmentering > Terskelverdi.
- Fjern alle objekter som er avkortet av kantlinjen, ved å velge Binær behandling > Berøringskantlinje.
- Hvis du vil måle overflateområdet, velger du Mål > Objektområde.
- Hvis du vil måle diameteren, velger du Måling > Eq Diameter.
- Hvis du vil måle lengden, velger du Måling > Lengde.
- Hvis du vil måle bredden, velger du Mål > Bredde.
- Hvis du vil måle grovhet, velger du Måling > Grovhet.
- Hvis du vil måle sirkularitet, velger du Måling > Sirkularitet.
- Hvis du vil måle forlengelsen, velger du Måling > forlengelse.
- Komponer en gruppe (høyreklikk) med målingen ovenfor og gi den nytt navn som MorphoData.
- Mål gjennomsnittlig grønn intensitet ved å velge Måling > Gjennomsnittlig intensitet.
- Mål gjennomsnittlig rød intensitet ved å velge Måling > Gjennomsnittlig intensitet.
- Hvis du vil måle forholdet mellom rødt og grønt, velger du Mål > forhold.
- Skriv en gruppe (høyreklikk) med målingen ovenfor, og gi den navnet RatioData.
- Eksporter tabellen til en CSV-fil ved å velge Referanse > tabell til CSV.
- Lagre GA3-analyseskriptet ved å velge Lagre som
MERK: En liste over vilkårene som brukes i denne prosedyren, er oppsummert i Figur 1, Tabell 1og Tabell 2. Den analyse GA3 skriptfilen er tilgjengelig i tillegg (Supplemental Coding File 1 og Figur 2). Tersklene som ble brukt ble tilpasset for å individualisere så mange mitokondrier som mulig (unntatt store mitokondrienettverk der det er mulig). Der det er mulig, blir mitokondrienettverk enten individualisert manuelt eller ekskludert fra analysene. På grunn av intercellulær variasjon, utfør disse analysene på minst 20-25 celler per tilstand (med minst 50 mitokondrier etter celle).
4. Analyse av mitokondriemotilitet
MERK: På grunn av den høye kompleksiteten i mitokondriebevegelser, er manuell motilitetsanalyse foretrukket. Her ble Nikons NIS Element-system brukt til å spore mitokondrier manuelt.
- Åpne sporingsmodulen i NIS, velg Vis > analyse > sporing.
- Klikk Definer ny avkastning.
- Med automatisk gjenkjenningsverktøyvelger du 25-50 mitokondrier på det første bildet av bildesekvensen.
- Klikk Spor automatisk oppdaget ROIer Analyser.
- Hvis det er nødvendig, sletter du feil AVKASTNING-spor.
- Eksporter tabellen til en CSV-fil.
MERK: En ikke-uttømmende liste over kriteriene som brukes i denne prosedyren, er oppsummert i figur 1 og tabell 3. En sporingsanalyse gir vanligvis en bane som viser bevegelsene til midten av hvert sporede objekt. De forskjellige sporingsalternativene må angis i sporingsalternativet. Favoriser valget av isolerte mitokondrier som er tilstrekkelig fjernt fra hverandre for å lette sporingen. Behold bare objektene som konsekvent kan spores over hele sekvensen. Fortsett på samme måte for å fjerne outliers på grunn av dårlig kvalitet sporing. Følgelig er settet med objekter analysert i denne delen forskjellig fra det som analyseres for statiske morfologiske analyser og vil generelt være mindre.
5. Datatransformasjon, normalisering og statistisk analyse
MERK: Hovedsakelig på grunn av den høye heterogeniteten til mitokondriene, har data generert ofte en ikke-normal fordeling.
- Loggfør målingene manuelt før behandling.
- For hver analyse og tidsramme normaliserer du de resulterende dataene manuelt ved hjelp av de som er oppnådd i referanseanskaffelsen.
- I tillegg bør du vurdere en andre/dobbel normalisering til en kontrolltilstand, for eksempel for å evaluere effekten av en behandling.
- Deretter utfører du statistisk analyse ved hjelp av en toveis samsvarende ANOVA. Her ble GraphPad Prism V8 brukt.
Representative Results
Primærkultur av astrocytter infisert med LV-G1-MitoTimer viste typiske mitokondrienettverk. Før behandling viste astrocytter som uttrykker LV-G1-MitoTimer den heterogene mitokondriestørrelsen og ulike grønne/røde fluorescensintensiteter (Figur 3, Figur 4og Video 1). Mitokondriesystemet til astrocyttkulturer som uttrykker LV-G1-MitoTimer ble overvåket før og etter inkubasjon med H202 (10 μM). De forskjellige mitokondriefunksjonene beskrevet ovenfor ble beregnet over 12 timer (hver 3 h) og normalisert (celle for celle) til sin opprinnelige tilstand. På morfologiske nivå (Figur 3B) begynner effekten av H2O2 å være synlig ved ca. 6 timer. Faktisk ble mitokondriene fragmentert (reduksjon av lengde, overflateareal og forlengelsesfaktor). Denne fragmenteringen er enda tydeligere 12 timer etter behandlingen. Vær oppmerksom på at diameterene, breddene og sfærisiteten ikke ble redusert. Når det gjelder redokstilstand og omsetning (figur 3C), 3 t etter H2O2-behandling, økte andelen grønne mitokondrier i astrocytter (konsekvensen av en rask økning i mitokondriebiogenese). Ved 6 t returnerte det grønne / røde forholdet til baseline nivåer, men antall rent røde mitokondrier økte betydelig fra basale nivåer. Etter 12 timer var konsekvensene av oksidativ behandling av H2O2 synlige og resulterte i en betydelig økning i forholdet og antall røde punkter. Når det gjelder dynamikken og mobiliteten (Figur 3D), 3 timer etter behandlingen, ble alle kriteriene midlertidig økt. På lengre sikt (12 t) beveget mitokondriene seg saktere og over kortere avstander.
Figur 1: Astrocyttkultur som uttrykker LV-G1-MitoTimer biosensor. (A) Konfokale fotografier av astrocytter som uttrykker LV-G1-MitoTimer. (B) Valg av konfikale fotografier av redusert (grønn) balansert (oransje) og oksidert (rød) mitokondrier med forskjellige fragmenteringsnivåer. (C) Sammendragsdiagram over de ulike kriteriene som er tilgjengelige for analyse i en astrocytt som uttrykker LV-G1-MitoTimer. Skalastang: (A) Øvre panel: 50 μm, nedre panel: 10 μm, (B) 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mitokondriemorfologi og forholdsanalyse. (A) GA3 skriptoversikt for analyse av individuell mitokondriemorfologi og forhold. (B) Innledende fotografier av en astrocytt som uttrykker LV-G1-MitoTimer analysert med GA3-skriptet. (C) Eksempel på binære masker generert for mitokondriesystemet til astrocytter. Skalastang: 10 μm (B-C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effektene av H2O2 på mitokondriesystemet av astrocytter. (A) Fotografier av astrocytter som uttrykker LV-G1-MitoTimer 1 t før og 6 timer, 24 timer etter behandling med PBS (CTRL) og 10 μM H2O2. (B) Radardiagrammer over mitokondriemorfologi, (C) redokstilstand og -omsetning, og (D) mobilitetskriterier evaluert på astrocytter under baseline og 3 t, 6 t og 12 timer etter H2O2-behandling. SA: Overflateareal; D: Diameter; L: Lengde; W: Bredde; R: Rundhet; S: Sfæriskhet; EF: Forlengelsesfaktor (=L/W); G/R: Individuelt rødt/grønt forhold; Gpuncta: Prosentandel av grønne puncta mitokondrier; Rpuncta: Prosentandel av røde puncta mitokondrier; Dis: Forskyvning; Tr: Spor lengde; Sp og SpV: Hastighets- og hastighetsvarians; Str: Retthet. Skalastang: 20 μm (A) og 2,5 μm (innfelt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fotografier av astrocytter som uttrykker LV-G1-MitoTimer og viser et homogent og balansert mitokondrienettverk under baseline. Skalalinje: 20 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Effekt av H2O2 behandling på mitokondriesystemet av dyrkede astrocytter. Astrocytiske mitokondrier før H2O2-behandling (baseline), samt 6 timer og 24 timer etter H2O2-behandling sammenlignet med ikke-behandlet kontrollcelle. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Morfologi vilkår | Rekkevidde | Merknader | ||
| Overflateareal (SA) | 0,5–4 μm2 | Disse kriteriene informerer om de fragmenterte langstrakte egenskapene til mitokondrier. De utvikler seg generelt i samme retning. Fragmenterte mitokondrier vil ha redusert overflateareal, diameter, lengde og forlengelsesfaktor, mens rundhet, sfæriskhet og bredde kan være uendret eller økt. | ||
| Diameter (D) | 0,5–1,5 μm | |||
| Lengde (L) | 0,5–5 μm | |||
| Bredde (W) | 0,5–2 μm | |||
| Rundhet (R) | 0–1 | |||
| Sfæriskhet (S) | 0–1 | |||
| Forlengelsesfaktor (EF = L/W) | 1–10 | |||
Tabell 1: Oppsummering av utvalgte parametere for mitokondriemorfologi.
| Vilkår for Redokstilstand | Rekkevidde | Merknader | ||
| Individuelt forholdstall (G/R) | 0–10 | Forholdet indikerer resultatet av redokstilstanden. Det informerer om den generelle tilstanden og alderen til mitokondriene i cellen. Det er viktig å vurdere at dette forholdet er balansen mellom biogenese og nedbrytning av mitokondrier og fisjon / fusjon av oksidert mitokondrier med redusert mitokondrier. Derfor kan evalueringen av antall grønne og røde puncta kraftig bidra til å tolke resultatene. Grønne puncta mitokondrier bestemmes når intensiteten av grønt er 10 ganger rødt. Røde puncta mitokondrier bestemmes når intensiteten av rødt er 10 ganger større enn for grønt. Redokstilstanden til en astrocytt er gjennomsnittet av alle mitokondriene i den cellen. | ||
| Prosentandel av grønne puncta mitokondrier (Gpuncta) | 0%–100% | |||
| Prosentandel av røde puncta mitokondrier (Rpuncta) | 0%–100% | |||
Tabell 2: Oppsummering av utvalgte parametere for mitokondrie-redokstilstand.
| Mobilitetskriterier | Rekkevidde | Merknader | ||
| Forskyvning (dis) | 0–10 μm | Sammen informerer disse funksjonene nettverkets generelle motilitetsdynamikk. Stasjonære mitokondrier viser kort forskyvning og sporlengde med lav hastighet. På den annen side kan oscillatoriske partikler differensieres med en forskjell mellom sporlengde og forskyvning (noe som resulterer i lav retthet) og økt hastighet sammenlignet med statisk. | ||
| Sporlengde (Tr) | 0–10 μm | |||
| Hastighets- og hastighetsvarians (Sp og SpV) | 0–1,5 μm/s ± 0,2 μm/s | |||
| Retthet | 0–1 | |||
| (Str = lengde på forskyvning/spor) | ||||
Tabell 3: Oppsummering av utvalgte parametere for mitokondriemobilitet.
Supplerende kodingsfil 1: GA3-skriptfil for analyse av individuell mitokondriemorfologi. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Her foreslås en ny metode for å langsgående følge dynamikken og omsetningen av mitokondriesystemet i en kultivert astrocytt. I motsetning til en tidsforløp tilnærming på en fast gruppe celler eller en enkelt celle om gangen (oftest brukt i litteraturen)24,25, kan forskere følge utviklingen av mitokondriesystemet i løpet av flere dager på de samme individuelle cellene. I motsetning til enkeltbrønn levende bildebehandling der høye nivåer av lyseksponering er nødvendig, og valget av mange individuelle celler er mindre gjennomførbart, utnytter den foreslåtte metoden dette mikroskopets evne til å bilde flere forskjellige celler i forskjellige områder av en brønn og å komme tilbake til de samme cellene på forskjellige tidspunkter for å avbilde dem på nytt. Takket være normalisering av en basislinje utført for hvert målte kriterium på hver interessecelle, tar det hensyn til mitokondriesystemets kompleksitet og undersøker effekten av behandling på hver celle i forhold til sitt eget basisbilde. Mikroskopets evne til autonomt å utføre denne typen avbildning på opptil 16 brønner om gangen (avbildning av 5 celler per brønn) gjør det mulig å ta hensyn til heterogeniteten til mitokondriesystemet under analyse uten eksperimentell variasjon som følger med avbildning av ulike forhold på forskjellige dager.
Kvaliteten på kulturene, nivåene av virusinfeksjoner som uttrykker LV-G1-MitoTimer biosensor, type mikroskop og mål, og valg av egnede celler er kritiske variabler som må forbli så konsistente som mulig i denne protokollen. Celletetthetene, typen vektor og virale titere kan tilpasses i henhold til spørsmålet. Selv om tidligere arbeid viser at LV-G1-MitoTimer-uttrykket ikke har skadelige konsekvenser for mitokondriefunksjon og dynamikk21,22,26,27, er det viktig å verifisere at konsentrasjonen ikke er giftig for cellene (for eksempel å sjekke det totale antall celler i kontrollbrønn). Som et enkelt fokusplan brukes, bør astrocytter være: (1) så flate som mulig, (2) isolert fra andre merkede celler (for å forenkle analysen i tilfelle forskyvning i parabolen), og (3) har høye fluorescensnivåer. Siden celler i kultur kan være svært variable i morfologi, kan mitokondriesystemet være svært heterogent. I denne sammenhengen kompenserer analyse av ROIer (og ikke hele cellen) for noen problematiske områder, for eksempel perinukære områder, og reduserer variasjonen. Det er viktig å gjøre grunnlinjen på relativt like celler og prøve så mange celler som mulig. Følgelig er høy innholdsanskaffelse og analysemikroskoper ideelle. Under denne langsgående overvåkingen er det også viktig å ikke overeksponere cellene for lys for å unngå biosensorbleking.
Denne avbildningsmetoden er ikke uten kompleksitet, og gjennom hele protokollen er flere notater inkludert, som tar hensyn til feilsøking gjort under tidligere tester med mikroskopet. For eksempel avhenger valget av platebelegg som brukes av den tiltenkte analysen, men anbefalinger for de mest egnede valgene for astrocytt primærkulturer er inkludert. I tillegg bør bildeanskaffelse utføres på minst 5 celler per tilstand på grunn av intercellulær variasjon. Mer spesifikt vil noen celler valgt ved baseline-avbildning dø, noen vil bevege seg ut av rammen til det tildelte bildeanskaffelsesområdet, og noen vil endre morfologien, noe som gjør mitokondriene svært vanskelig å individualisere i analyse. Hvis du ser på mange celler fra begynnelsen, øker sannsynligheten for en stor nok utvalgsstørrelse på celler til å analysere på slutten av eksperimentet. I tillegg til de mer komplekse aspektene ved denne bildeteknikken, er det noen direkte begrensninger så langt som hvem som kan dra nytte av denne typen avbildning og analyse. For å dra full nytte av automatiseringen av bildeanskaffelse, må mikroskopet som brukes ha et autofokussystem som kan håndtere hastigheten på tidsintervaller mellom bilder (dvs. hver tredje s i denne protokollen) og kan konsekvent fokusere på den aktuelle cellen før hvert bilde tas. I tillegg, uten JOBS-programvaren, som automatiserer hele bildeanskaffelsesprosessen, blir denne metoden vanskelig og potensielt umulig, avhengig av antall celler som blir avbildet, da det ville kreve manuelt å finne og avbilde hver celle igjen på riktig tidspunkt. Til slutt er denne avbildningsmetoden ikke immun mot spørsmålet om fotobleking. Av denne grunn, som med enhver langsiktig oppkjøpsmetode, er det viktig å velge fluorescerende markører som er mindre utsatt for fotobleaching og for å skreddersy bildeanskaffelse for å unngå dette problemet så mye som mulig.
Denne teknikken skiller seg fra andre som for tiden brukes på en avgjørende måte. I motsetning til andre tidsforløpstudier krever denne teknikken ikke avbildning på samme posisjon i brønnen hele tiden, og det krever heller ikke manuell bevegelse av platen for å avbilde andre områder. Dette gjør det mulig for forskere å avbilde mange celler under mange forhold i en tidsramme på 24 timer. Følgelig gir evnen til å utføre denne avbildningen og analysen på mange celler i hver brønn den samme befolkningsinformasjonen man vil få ved å studere en stor gruppe celler, samtidig som man i tillegg gir spesifikke tiltak fra hver celle som er avbildet. Selv om noen spesifisiteter på denne metoden kanskje ikke gjelder for andre metoder for bildeanskaffelse (skissert ovenfor), oppveier fordelene komplikasjonene med typen analyse som er mulig etter oppkjøpet. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å se de nøyaktige konsekvensene av ulike behandlinger på mitokondriesystemet, og følgelig på de kultiverte astrocyttene.
I tillegg er denne metoden svært tilpassbar til mange forskjellige vitenskapelige spørsmål angående mitokondrieadferd og roller i spesifikke sammenhenger. Her handler den skisserte protokollen spesielt om kultiverte astrocytter. Imidlertid kan mange andre celletyper brukes, og behandlingene som kan testes er begrenset bare av spørsmålene som undersøkes. Denne typen avbildning har potensial til å fremme den kollektive kunnskapen og forståelsen av mitokondrieadferd, de underliggende mekanismene som fører til mitokondrie dysfunksjon, og effekten av mange patologier på den medfødte dynamikken som finnes i forskjellige typer celler.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av et Synapsis Foundation-stipend tildelt K.R. og Lausanne University Hospital (CHUV). Forfatterne takker Nikon for deres hjelp, spesielt J. Gannevat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
References
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
- Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
- MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
- Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
- Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
- Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
- Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
- Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
- de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
- Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
- Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
- Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
- Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
- Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
- Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
- Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
- Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).
