Summary
מאמר זה מתאר את השיטה להדמיה מיטוכונדריאלית של תרביות אסטרוציטים המצוידות בביו-סנסור MitoTimer ואת הניתוח הרב-פרמטרי המתקבל של דינמיקה מיטוכונדריאלית, ניידות, מורפולוגיה, ביוגנזה, מצב אדום ומחזור.
Abstract
בעוד תשומת לב רבה ניתנה לשינויים מיטוכונדריאליים ברמה העצבית, הראיות האחרונות מדגימות כי דינמיקה מיטוכונדריאלית ותפקוד אסטרוציטים מעורבים בקוגניציה. מאמר זה מתאר את השיטה להדמיה בזמן-לשגות של תרביות אסטרוציטים המצוידות בביו-סנסור מיטוכונדריאלי: MitoTimer. MitoTimer הוא כלי רב עוצמה וייחודי להערכת דינמיקה מיטוכונדריאלית, ניידות, מורפולוגיה, ביוגנזה ומצב redox. כאן מוצגים ההליכים השונים לתרבות, לרכישת תמונות וניתוח מיטוכונדריאלי עוקב.
Introduction
אסטרוציטים הם שחקנים קריטיים בתחזוקת הומאוסטזיס במוח. הם אולי ידועים ביותר יש תפקידים מבניים משמעותיים במוח, כחלק ממחסום הדם - מוח1 ועל ידי תמיכה נוירונים וסינפסות ברחבי המוח2. תמיכה אסטרוציטים של נוירונים הוא מבני3 מטבולי4,5, עם אסטרוציטים קידום neurogenesis ו synaptogenesis תוך מתן מטבוליטים מפתח כמו לקטט נוירונים פעילים4,6,7. מעבר לתפקיד התמיכה המבנית, אסטרוציטים הם תאים פעילים שלוקחים חלק ב- Ca2 + איתות ואגירה (כולל זרם מיטוכונדריאלי ספונטני Ca2 + )8,9, K+ אגירה10, ויכולים להתאים ולהגיב לצרכי המוח בזמנים שלפגיעה 11,12 . בהיותם תאים דינמיים כאלה, לאסטרוציטים יש דרישות אנרגיה חזקות, המחייבות רשת מיטוכונדריאלית יעילה. המיטוכונדריה האלה יש גם תפקיד מכריע באגירת מינים חמצן תגובתי מופרז (ROS)13. בנוסף לתפקידים האישיים או המקומיים שלהם של ייצור אנרגיה ואגירת ROS, המיטוכונדריה מתפקדת כרשת14. במובן זה, הם שומרים על שיווי משקל בין ביקוע לבין מיטוכונדריה היתוך, המייצג מיטוכונדריה חדשה / מופחתת ומיטוכונדריה ישנה / מחומצנת, בהתאמה15. ניתן לאמוד את מצב ההוקסם מחדש הכולל של תא על-ידי מצב ההוקסם מחדש של רשת המיטוכונדריה. בפתולוגיה, זוהי פיסת מידע קריטית שיכולה לשפוך אור על אילו תאים לא מתפקדים בצורה אופטימלית.
בשנים האחרונות פותחו חיישנים רבים כדי לחקור את הדינמיקה והפונקציות של המיטוכונדריה בתאים. לדוגמה, חיישנים המודדים חילופי אנרגיה (ATP), מצב redox (NADH/NAD+, ROS) ופונקציונליות אנזימטית (cAMP, Ca2+, Zn2+) משמשים כעת במחקר של פונקציה מיטוכונדריאלית16. ביניהם, MitoTimer מאפשר לעקוב אחר השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית (גודל, צורה, שטח פנים), ניידות (מהירות, תזוזה) ודינמיקה (אירועי היתוך וביקוע), כמו גם את שיעור המחזור המיטוכונדריאלי הכולל ומצב ההוקסם מחדש. MitoTimer הוא חלבון פלואורסצנטי אדום מוטנטי, drFP58317, עם אות מיטוכונדריאלי מתת-unit VIII של ציטוכרום c אוקסידאז אנושי18,19 כדי לדמיין מיטוכונדריה מסונתזת חדשה בירוק (488 ננומטר) ומיטוכונדריה מחומצנת באדום (555 ננומטר). שימוש ביחס הפלואורסצנטיות הירוק (488 ננומטר) והאדום (555 ננומטר) מאפשר הערכה סימולטנית של המיטוכונדריה הבודדת, ניתוח המורפולוגיה שלהם, אירועי היתוך/ביקוע והיסטוריית מצב20,21. מאפיין ייחודי זה יכול לשמש כדי לחקור שאלות מדעיות רבות לגבי התפקידים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של המיטוכונדריה ולכן הוא מבטיח מאוד לחשיפת המנגנונים הבסיסיים של דינמיקה מיטוכונדריאלית בתוך סוגי תאים רבים ושונים.
לאחרונה פיתחנו וקטור lentiviral חדש (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, להלן נקרא LV-G1-MitoTimer) כדי לחקור את הדינמיקה והפונקציות של המיטוכונדריה במיוחד אסטרוציטים במבחנה וב- vivo22. LV-G1-MitoTimer משתמש בגרסה חתוכה של מקדם החלבון החומצי הפריאלי (GFAP) gfaABC1D, עם משפר B3 (gfaABC1D(B3), להלן G1) בשילוב עם מערכת detargeting עצבית miR124T שתוארה בעבר23. זה מאפשר ביטוי בלעדי של הביונסור המיטוכונדריאלי באסטרוציטים במבחנה וב- vivo22. המוצגים כאן הם השלבים השונים כדי לבצע תרבות של אסטרוציטים היפוקמפוס חולדה ולצייד אותם עם biosensor LV-G1-MitoTimer, כמו גם את השלבים מיקרוסקופיים שונים כדי לעקוב אחר ההתנהגות של מיטוכונדריה אסטרוציטים במהלך מספר שעות / ימים רצופים.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי בוצע באישור ועדת אתיקה (הסכם VD3602, לוזאן, שוויץ) ועוקב אחר הנחיות אירופיות לשימוש בבעלי חיים.
1. רטט תרבות ראשונית של אסטרוציט היפוקמפוס
- להקריב חמישה גורים חולדה (עכברוש Wistar IGS) על ידי עריפת ראש ביום שלאחר ההולדה 1-2.
- הסר את המוח ולשמור אותו בצלחת פטרי המכיל 5 מ"ל של מדיום אסטרוציטים טרי (DMEM עם גלוטמקס בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו 10% סרום סוס טרי).
- לבודד את ההיפוקמפוס. לנתק ב 5 מ"ל של המדיום אסטרוציטי על ידי שלושה מעברים דרך מחט 21 G ושלושה מעברים דרך מחט 25 G.
- מעבירים את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וסופרים בהמוציטומטר.
- צלחת 20,000-25,000 תאים / ס"מ2 במנות multiwell (9.4 מ"מ x 10.7 מ"מ x 9.3 מ"מ) ולאחסן אותם ב 37 °C תחת אווירה המכילה 5% CO2 למשך שארית הניסוי.
- החלף את המדיום לחלוטין ב 3 ימים במבחנה (DIV3).
- ב- DIV8, הוסיפו 0.6 pg של אנטיגן p24 לכל תא של קידוד וקטור לנטיוויראלי עבור ביו-סנסור מיטו-נדריאלי MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22) מדולל מלוחים חוצצי פוספט (PBS + 0.01% BSA).
- ב-DIV9, יש לשטוף עם PBS סטרילי 1x (37 °C) והוסיף בינוני אסטרוציטים טרי.
- ב- DIV11, בצע 2 שטיפות עם PBS סטרילי 1x מחומם מראש (37 °C) ולהוסיף אסטרוציטים טריים בינוני ללא פנול אדום.
הערה: בחירת הציפוי תלויה ב- assay המיועד. כציפוי סטנדרטי לתרבות ראשונית אסטרוציטים, מומלץ להשתמש 0.2 מ"ג / מ"ל פולי-D-ליצין או 8.7 מיקרוגרם / ס"מ 2 של מטריצת קרוםהמרתף (למשל, מטריג'ל). כדי לדמיין את המערכת המיטוכונדריאלית של אסטרוציטים, חיוני לעבוד על תאים שטוחים ומתוחים. בהקשר זה, השילוב של מטריצת קרום המרתף על IBIDI u-שקופיות הוא המתאים ביותר. זה גם חיוני לא לעבוד עם פנול אדום, אשר רעיל עבור התא תחת חשיפה חוזרת ונשנית לאור.
2. ניטור ארוך טווח של המערכת המיטוכונדריאלית.
- להעריך את המערכת המיטוכונדריאלית אסטרוציטית מינימום של 3-5 ימים לאחר זיהומים lentiviral עם LV-G1-MitoTimer (כדי לאפשר רמה מספקת של פלואורסצנטיות במיטוכונדריה).
- צלם את התאים עם מיקרוסקופ הפוך הנשלט על ידי תוכנת הרכישה והניתוח ומודול לאוטומציה מלאה של רכישה.
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטי התוכנה והמודול המשמשים במחקר זה. - ודא כי המיקרוסקופ מצויד אינקובטור כלוב (ראה טבלה של חומרים) כדי לשמור על תרבות אסטרוציטים ב 5% CO2 ו 37 °C (55 °F) לאורך הניסוי.
- לכוד תמונות פלואורסצנטיות באמצעות עירור רציף ב 490 ננומטר (עבור ערוץ ירוק) ו 550 ננומטר (עבור ערוץ אדום) עם זיהוי של ירוק (500-540 ננומטר עבור ערוץ ירוק) ואדום (550-600 ננומטר עבור ערוץ אדום) אותות פלואורסצנטיות.
- בחר 5 אסטרוציטים לבאר עם רשת מיטוכונדריאלית המבטאת רמות מספיקות של LV-G1-MitoTimer באמצעות הגדלה של פי 40. יש להקפיד לבחור אסטרוציטים שטוחים וגדולים ככל האפשר ולא ממוקמים באשכולות של תאים (כדי לעבוד על תאים בודדים).
- שמור את הקואורדינטות של 5 התאים שנבחרו בקובץ xlm (map.xlm). map.xlm זה מאפשר למשתמש לחזור לאותם תאים לאורך זמן.
- השג רצפי תמונות (תמונה אחת/שניה עבור 60 s) באמצעות הגדלה של 150x (יעד טבילת שמן 100x, הגדלה ביניים פי 1.5) עבור כל קואורדינטות.
- רכישת תמונה חוזרת (תמונה אחת/s עבור 60 s) עבור אותם אסטרוציטים 6 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות לאחר הטיפולים.
הערה: השתמש במיקרוסקופ המצויד במערכת מיקוד אוטומטי מהירה ויעילה. בהקשר זה נעשה שימוש בפתרון החומרה הנקרא מערכת מיקוד מושלמת (PFS). PFS משתמש בחיישני LED וקו CCD כמעט אינפרא-אדום 870 ננומטר כדי להילחם בתנודות מיקוד ציריות בזמן אמת במהלך חקירות הדמיה ארוכות טווח.
3. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית אישית ויחס LV-G1-MitoTimer
הערה: ניתוח כללי NIS 3 (GA3) מנייקון שימש לאוטומטיזציה של ניתוח מורפומטרי במחקר זה.
- עבור כל רצף תמונות (בסיסי, 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות), בחר את המסגרת הראשונה עבור ערוצים אדומים וירוקים על ידי לחיצה על עיבוד ND > בחר מסגרת.
- מזג את הערוצים האדומים והירוקים על-ידי בחירת המרות > ערוץ מיזוג.
- לתיקון הצללת תמונה, בחרו 'עיבוד מקדים' > תיקון הצללה אוטומטי.
- החל את אלגוריתם כדור מתגלגל על ידי בחירת עיבוד מראש > כדור מתגלגל.
- כדי ליצור מסיכות בינאריות עבור כל מיטוכונדריון, בחר סגמנטציה > סף.
- הסר אובייקטים שנחתכו על-ידי הגבול על-ידי בחירה בעיבוד בינארי > נגיעה בגבול.
- למדידת שטח הפנים, בחרו 'מדידה > אזור אובייקט' .
- למדידת הקוטר, בחרו 'מדידה > קוטר Eq' .
- למדידת האורך, בחרו 'מדידה > אורך' .
- למדידת הרוחב, בחרו 'מדידה > רוחב' .
- כדי למדוד חספוס, בחר מדידה > חספוס.
- למדידת מעגליות, בחרו 'מדידה > מעגליות' .
- למדידת התארכות, בחרו 'מדידה > התארכות' .
- חבר קבוצה (לחיצה ימנית) עם המידה שלעיל ושנה את שמה כ- MorphoData.
- מדוד עוצמה ירוקה פירושה על-ידי בחירת מדידה > עוצמה ממוצעת.
- מדוד עוצמה אדומה פירושה על-ידי בחירת מדידה > עוצמה ממוצעת.
- כדי למדוד את היחס האדום/ירוק, בחר יחס מדידה >.
- חבר קבוצה (לחיצה ימנית) עם המידה שלעיל ושנה את שמה כ- RatioData.
- יצא את הטבלה לקובץ CSV על-ידי בחירה באפשרות טבלת > הפניה ל- CSV.
- שמור את קובץ ה- Script של הניתוח GA3 על-ידי בחירה באפשרות שמירה בשם
הערה: רשימה לא ממצה של הקריטריונים המשמשים בהליך זה מסוכמת באיור 1, בטבלה 1 ובטבלה 2. קובץ Script של ניתוח GA3 זמין בתוספת (קובץ קידוד משלים 1 ואיור 2). הסף ששימש הותאם כדי להתאים אישית כמה שיותר מיטוכונדריה (למעט רשתות מיטוכונדריאליות גדולות במידת האפשר). במידת האפשר, רשתות מיטוכונדריאליות בודדות באופן ידני או אינן נכללות מהניתוחים. בשל שונות בין-תאית, בצע ניתוחים אלה על לפחות 20-25 תאים לכל תנאי (עם מינימום של 50 מיטוכונדריה לפי תא).
4. ניתוח תנועתיות מיטוכונדריאלית
הערה: בשל המורכבות הגבוהה של תנועות מיטוכונדריאליות, ניתוח תנועתיות ידני עדיף. כאן, מערכת אלמנט NIS של ניקון שימשה למעקב ידני אחר המיטוכונדריה.
- פתחו את מודול המעקב ב-ש"ח, בחרו 'הצג ניתוח > > מעקב'.
- לחץ על הגדרת ROI חדש.
- בעזרת כלי הזיהוי האוטומטי, בחר 25-50 מיטוכונדריה בתמונה הראשונה של רצף התמונות.
- לחץ על עקוב אחר ניתוח החזרי ROIs אוטומטית.
- במידת הצורך, מחק את רצועות ההמחמחה השגויות.
- יצא את הטבלה לקובץ CSV.
הערה: רשימה לא ממצה של הקריטריונים המשמשים בהליך זה מסוכמת באיור 1 ובטבלה 3. ניתוח מעקב בדרך כלל נותן נתיב המתאר את התנועות של המרכז של כל אובייקט במעקב. יש להגדיר את אפשרויות המעקב השונות באפשרות המעקב. להעדיף את הבחירה של מיטוכונדריה מבודדת כי הם רחוקים מספיק אחד מהשני כדי להקל על המעקב. שמור רק את האובייקטים שניתן לעקוב אחריהם באופן עקבי לאורך כל הרצף. המשך באותה דרך כדי להסיר חריגים עקב מעקב באיכות גרועה. כתוצאה מכך, ערכת האובייקטים המנותחים בסעיף זה שונה מזו שנותחה עבור ניתוחים מורפולוגיים סטטיים ובדרך כלל תהיה קטנה יותר.
5. טרנספורמציה של נתונים, נורמליזציה וניתוח סטטיסטי
הערה: בעיקר בשל ההטרוגניות הגבוהה של המיטוכונדריה, נתונים שנוצרו לעתים קרובות יש התפלגות לא נורמלית.
- יומן רישום ידני של המדידות לפני העיבוד.
- עבור כל ניתוח ומסגרת זמן, נרמל באופן ידני את הנתונים המתקבלים לפי הממוצע של אלה שהושגו ברכישת הייחוס.
- בנוסף, שקול נורמליזציה שנייה/כפולה למצב שליטה, למשל, כדי להעריך את ההשפעה של טיפול.
- לאחר מכן, בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA תואם דו כיווני. כאן נעשה שימוש במנסרה של GraphPad V8.
Representative Results
התרבות העיקרית של אסטרוציטים נגועים LV-G1-MitoTimer הציג רשתות מיטוכונדריאליות טיפוסיות. לפני הטיפול, אסטרוציטים המבטאות LV-G1-MitoTimer הראו את הגודל המיטוכונדריאלי ההטרוגני ואת עוצמות הפלואורסצנטיות הירוקות/אדומות השונות (איור 3, איור 4 וסרטון 1). המערכת המיטוכונדריאלית של תרבויות אסטרוציטים המבטאות LV-G1-MitoTimer הייתה במעקב לפני ואחרי הדגירה עם H202 (10 מיקרומטר). התכונות המיטוכונדריאליות השונות שתוארו לעיל חושבו מעל 12 שעות (כל 3 שעות) ונורמלו (תא אחר תא) למצבן ההתחלתי. ברמה המורפולוגית (איור 3B), ההשפעות של H2O2 מתחילות להיות גלויות בסביבות 6 שעות. ואכן, המיטוכונדריה היו מקוטעים (ירידה של אורך, שטח הפנים, גורם התארכות). פיצול זה הוא אפילו יותר ברור 12 שעות לאחר הטיפול. שים לב שהקוטרים, הרוחב והספירה לא צומצמו. לגבי מצב ומחזור redox (איור 3C),3 שעות לאחר טיפול H2O2, שיעור המיטוכונדריה הירוקה גדל באסטרוציטים (כתוצאה מעלייה מהירה בביוגנזה המיטוכונדריאלית). בשעה 6 שעות, היחס הירוק/אדום חזר לרמות הבסיס, אך מספר המיטוכונדריה האדומה גרידא גדל באופן משמעותי מרמות הבסיס. לאחר 12 שעות, ההשלכות של הטיפול החמצוני של H2O2 היו גלויים והביאו לעלייה משמעותית ביחס ובמספר puncta אדום. לגבי הדינמיקה והניידות (איור 3D),3 שעות לאחר הטיפול, כל הקריטריונים הוגדלו באופן ארעי. בטווח הארוך יותר (12 שעות), המיטוכונדריה נעה לאט יותר ובמרחקים קצרים יותר.
איור 1: תרבות אסטרוציטים המבטאת ביו-סנסור LV-G1-MitoTimer. (A)תצלומים קונפוקליים של אסטרוציטים המבטאים LV-G1-MitoTimer. (B)מבחר תצלומים קונפוקליים של מיטוכונדריה מופחתת (ירוקה) מאוזנת (כתומה) ומחמצן (אדום) עם רמות שונות של פיצול. (ג)דיאגרמת סיכום של הקריטריונים השונים הזמינים לניתוח באסטרוציט המבטא LV-G1-MitoTimer. סרגל קנה מידה: (A) חלונית עליונה: 50 מיקרומטר, לוח תחתון: 10 מיקרומטר, (B) 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה מיטוכונדריאלית וניתוח יחס. (A)סקירת סקריפט GA3 לניתוח מורפולוגיה ויחס מיטוכונדריאליים בודדים. (B)תצלומים ראשוניים של אסטרוציטים המבטאים את LV-G1-MitoTimer נותחו עם התסריט GA3. (C)דוגמה למסכות בינאריות שנוצרו עבור המערכת המיטוכונדריאלית של אסטרוציטים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר (B-C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעות של H2O2 על המערכת המיטוכונדריאלית של אסטרוציטים. (A)תצלומים של אסטרוציטים המבטאים LV-G1-MitoTimer 1 שעה לפני ו 6 שעות, 24 שעות לאחר הטיפול ב- PBS (CTRL) ו - 10 מיקרומטר של H2O2. (B)תרשימי מכ"ם של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, (C) מצב ומחזור מחדש, ו -( D)קריטריוני ניידות המוערכים על אסטרוציטים במהלך קו הבסיס ו 3 שעות, 6 שעות, ו 12 שעות לאחר טיפול H2O2. SA: שטח פנים; D: קוטר; L: אורך; W: רוחב; R: עגולות; S: כדוריות; EF: גורם התארכות (=L/W); G/R: יחס אדום/ירוק בודד; Gpuncta: אחוז המיטוכונדריה הירוקה; Rpuncta: אחוז המיטוכונדריה האדומה; דיס: תזוזה; Tr: אורך המסלול; Sp ו- SpV: סטיית מהירות ומהירות; סטראדה: ישרות. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר (A) ו 2.5 מיקרומטר (inset). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תצלומים של אסטרוציטים המבטאים את LV-G1-MitoTimer ומציגים רשת מיטוכונדריאלית הומוגנית ומאוזנת במהלך קו הבסיס. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: ההשפעה שלטיפול H2O2 על המערכת המיטוכונדריאלית של אסטרוציטים מתורבתים. מיטוכונדריה אסטרוציטית לפני טיפול H2O2 (בסיסי), כמו גם 6 שעות ו 24 שעות לאחר H2O2 טיפול לעומת תא בקרה שאינו מטופל. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| קריטריוני מורפולוגיה | טווח | הערות | ||
| שטח פנים (SA) | 0.5–4 מיקרומטר2 | קריטריונים אלה מודיעים על התכונות המפוצלות של המיטוכונדריה. הם בדרך כלל מתפתחים באותו כיוון. המיטוכונדריה המפוצלת תפחית את שטח הפנים, הקוטר, האורך וגורם ההארכה בעוד שעיגוליות, כדוריות ורוחב עשויים להיות ללא שינוי או להגדלה. | ||
| קוטר (D) | 0.5–1.5 מיקרומטר | |||
| אורך (L) | 0.5-5 מיקרומטר | |||
| רוחב (W) | 0.5–2 מיקרומטר | |||
| עגולות (R) | 0–1 | |||
| כדוריות (S) | 0–1 | |||
| גורם התארכות (EF = L/W) | 1–10 | |||
טבלה 1: סיכום הפרמטרים שנבחרו עבור מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.
| קריטריוני מצב Redox | טווח | הערות | ||
| יחס אישי (G/R) | 0–10 | היחס מציין את התוצאה של מצב ההרחבה מחדש. זה מודיע על המצב הכללי וגיל המיטוכונדריה בתא. זה חיוני כדי לקחת בחשבון כי יחס זה הוא האיזון של ביוגנזה השפלה של המיטוכונדריה ואת הביקוע / היתוך של מיטוכונדריה מחומצנת עם מיטוכונדריה מופחתת. לכן ההערכה של מספר puncta ירוק ואדום יכול לעזור בעוצמה לפרש את התוצאות. פונקטה מיטוכונדריה ירוקה נקבעת כאשר עוצמת הירוק היא פי 10 מזה של אדום. מיטוכונדריה אדומה נקבעת כאשר עוצמת האדום גדולה פי 10 מזו של הירוק. המצב האדום של אסטרוציט הוא הממוצע של כל יחסי המיטוכונדריה של התא הזה. | ||
| אחוז המיטוכונדריה הירוקה (Gpuncta) | 0%–100% | |||
| אחוז המיטוכונדריה האדומה (Rpuncta) | 0%–100% | |||
טבלה 2: סיכום הפרמטרים שנבחרו עבור מצב הפעלה מחדש של מיטוכונדריה.
| קריטריוני ניידות | טווח | הערות | ||
| תזוזה (Dis) | 0-10 מיקרומטר | יחד תכונות אלה ליידע את הדינמיקה תנועתיות כללית של הרשת. המיטוכונדריה הנינוחה מציגה תזוזה קצרה ואורך מסלול במהירות נמוכה. מצד שני, חלקיקים מתנדנדים ניתן להבדיל עם הבדל בין אורך המסלול ואת עקירה (וכתוצאה מכך ישרות נמוכה) ומהירות מוגברת לעומת סטטי. | ||
| אורך רצועה (Tr) | 0-10 מיקרומטר | |||
| סטיית מהירות ומהירות (Sp ו- SpV) | 0-1.5 מיקרומטר/שני ± 0.2 מיקרומטר/s | |||
| ישרות | 0–1 | |||
| (Str = אורך תזוזה/רצועה) | ||||
טבלה 3: סיכום הפרמטרים שנבחרו עבור ניידות מיטוכונדריאלית.
קובץ קידוד משלים 1: קובץ סקריפט GA3 לניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בודדת. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
כאן מוצעת שיטה חדשנית לעקוב לאורך הדינמיקה והמחזור של המערכת המיטוכונדריאלית באסטרוציטים תרבותיים. שלא כמו גישה של זמן לשגות על קבוצה קבועה של תאים או תא בודד אחד בכל פעם (בשימוש הנפוץ ביותר בספרות)24,25, חוקרים יכולים לעקוב אחר האבולוציה של המערכת המיטוכונדריאלית במהלך מספר ימים על אותם תאים בודדים. בניגוד להדמיה חיה אחת שבה נדרשות רמות גבוהות של חשיפה לאור, ובחירת תאים בודדים רבים היא פחות ריאלית, השיטה המוצעת מנצלת את יכולתו של מיקרוסקופ זה לדמיין מספר תאים שונים באזורים שונים של באר ולחזור לאותם תאים בנקודות זמן שונות כדי לדמיין אותם מחדש. הודות לנורמליזציה לקו בסיס המתבצע עבור כל קריטריון מדוד בכל תא מעניין, הוא לוקח בחשבון את המורכבות של המערכת המיטוכונדריאלית ובוחן את השפעת הטיפול על כל תא ביחס לתמונת הבסיס שלו. היכולת של המיקרוסקופ לבצע באופן אוטונומי סוג זה של הדמיה על עד 16 בארות בכל פעם (הדמיה 5 תאים לבאר) מאפשרת את ההטרוגניות של המערכת המיטוכונדריאלית להילקח בחשבון כראוי במהלך ניתוח ללא השונות הניסיונית שמגיעה עם הדמיה תנאים שונים בימים שונים.
איכות התרבויות, רמות הזיהומים הנגיפיים המבטאים את הביונסור LV-G1-MitoTimer, סוג המיקרוסקופ והיעדים, ובחירת התאים המתאימים הם משתנים קריטיים שחייבים להישאר עקביים ככל האפשר בפרוטוקול זה. ניתן להתאים את צפיפות התאים, סוג הווקטור והפטירים הנגיפיים בהתאם לשאלה. למרות עבודה קודמת מראה כי ביטוי LV-G1-MitoTimer אין השלכות מזיקות על תפקוד מיטוכונדריאלי ודינמיקה21,22,26,27, זה חיוני כדי לוודא כי הריכוז אינו רעיל עבור התאים (לדוגמה, בדיקת המספר הכולל של תאים בשליטה היטב). כמו מישור מוקד יחיד משמש, אסטרוציטים צריך להיות: (1) שטוח ככל האפשר, (2) מבודד מתאים מסומנים אחרים (כדי לפשט את הניתוח במקרה של עקירה בצלחת), ו (3) בעל רמות פלואורסצנטיות גבוהות. כמו תאים בתרבית יכול להיות משתנה מאוד במורפולוגיה, המערכת המיטוכונדריאלית יכולה להיות הטרוגנית מאוד. בהקשר זה, ניתוח ROIs (ולא התא כולו) מפצה על אזורים בעייתיים מסוימים, כגון אזורי perinuclear, ומקטין את השונות. זה חיוני לעשות את הבסיס על תאים דומים יחסית ולדגום תאים רבים ככל האפשר. כתוצאה מכך, מיקרוסקופים של רכישת תוכן וניתוח תוכן גבוהים מתאימים באופן אידיאלי. במהלך ניטור אורך זה, חשוב גם לא חשיפת יתר של התאים לאור כדי למנוע הלבנה biosensor.
שיטת הדמיה זו אינה נטולת המורכבות שלה, ולאורך הפרוטוקול נכללות מספר הערות, אשר לוקחות בחשבון פתרון בעיות שנעשה במהלך בדיקות קודמות עם המיקרוסקופ. לדוגמה, הבחירה של ציפוי צלחת בשימוש תלויה במבחן המיועד, אבל המלצות עבור האפשרויות המתאימות ביותר עבור תרבויות ראשוניות אסטרוציטים נכללו. בנוסף, רכישת תמונה צריכה להתבצע על לפחות 5 תאים לכל תנאי עקב שונות בין-תאית. ליתר דיוק, כמה תאים שנבחרו בהדמיה בסיסית ימותו, חלקם יצאו מהמסגרת של אזור רכישת התמונות שהוקצה, וחלקם ישנו את המורפולוגיה שלהם, מה שהופך את המיטוכונדריה לקשה מאוד לאינדיבידואליזציה בניתוח. הדמיה של תאים רבים מההתחלה מגדילה את הסבירות של גודל מדגם גדול מספיק של תאים לנתח בסוף הניסוי. בנוסף להיבטים המורכבים יותר של טכניקת הדמיה זו, ישנן כמה מגבלות על הסף ככל מי יכול להפיק תועלת מסוג זה של הדמיה וניתוח. על מנת לנצל את מלוא היתרונות של אוטומציה של רכישת תמונה, המיקרוסקופ המשמש חייב להיות בעל מערכת פוקוס אוטומטי שיכולה להתמודד עם מהירות מרווחי הזמן בין תמונות (כלומר, כל 3 שניות בפרוטוקול זה) ויכולה להתמקד בעקביות בתא המדובר לפני כל תמונה נלקחת. בנוסף, ללא תוכנת JOBS, אשר הופכת את כל תהליך רכישת התמונה לאוטומטי, שיטה זו הופכת מפרכת ופוטנציאל בלתי אפשרי בהתאם למספר התאים שמצולם מכיוון שהיא תדרוש חיפוש והדמיה ידנית של כל תא שוב בנקודת הזמן המתאימה. לבסוף, שיטת הדמיה זו אינה חסינה לסוגיית ההלבנה. מסיבה זו, כמו בכל שיטת רכישה ארוכת טווח, חשוב לבחור סמנים פלואורסצנטיים שפחות רגישים להלבנה בתמונה ולהתאים את רכישת התמונות כדי למנוע בעיה זו ככל האפשר.
טכניקה זו שונה מאחרים המשמשים כיום באופן מכריע. שלא כמו מחקרים אחרים של זמן לשגות, טכניקה זו אינה דורשת הדמיה על אותה תנוחה בבאר כל הזמן, וגם אינה דורשת תנועה ידנית של הצלחת כדי לדמיין אזורים אחרים. זה מאפשר לחוקרים את היכולת לדמיין תאים רבים בתנאים רבים במסגרת זמן אחת של 24 שעות. כתוצאה מכך, היכולת לבצע הדמיה וניתוח זה על תאים רבים בכל באר נותנת לאותו מידע אוכלוסיה שניתן היה להשיג ממחקר רחב של קבוצה גדולה של תאים תוך מתן אמצעים ספציפיים מכל תא שמצולם. בעוד כמה ספציפיים לשיטה זו לא יכול לחול על שיטות רכישת תמונה אחרות (מתואר לעיל), היתרונות עולים על הסיבוכים עם סוג הניתוח האפשרי לאחר הרכישה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לראות את ההשלכות המדויקות של טיפולים שונים על המערכת המיטוכונדריאלית, וכתוצאה מכך, על אסטרוציטים מתורבתים.
בנוסף, שיטה זו ניתנת להתאמה אישית רבה לשאלות מדעיות רבות ושונות לגבי התנהגות מיטוכונדריאלית ותפקידים בהקשרים ספציפיים. כאן הפרוטוקול המתואר עוסק במיוחד עם אסטרוציטים מתורבתים. עם זאת, סוגים רבים אחרים של תאים יכולים לשמש, ואת הטיפולים שניתן לבדוק מוגבלים רק על ידי השאלות הנחקרות. סוג זה של הדמיה יש פוטנציאל לקדם את הידע הקולקטיבי והבנה של התנהגות מיטוכונדריאלית, המנגנונים הבסיסיים המובילים לתפקוד מיטוכונדריאלי, ואת ההשפעות של פתולוגיות רבות על הדינמיקה המולדת הקיימת בסוגים שונים של תאים.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מלגת קרן סינפסיס שהוענקה לקיי.אר ול בית החולים האוניברסיטאי לוזאן (CHUV). המחברים מודים לנייקון על עזרתם, ובמיוחד לג'יי גנווט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
References
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
- Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
- MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
- Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
- Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
- Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
- Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
- Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
- de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
- Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
- Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
- Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
- Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
- Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
- Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
- Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
- Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).
