Summary
Denna artikel beskriver metoden för mitokondriell tidsfördröjning av astrocyt kulturer utrustade med MitoTimer biosensor och den resulterande multiparametrisk analys av mitokondriell dynamik, rörlighet, morfologi, biogenesis, redox tillstånd och omsättning.
Abstract
Medan mycket uppmärksamhet har ägnats åt mitokondriella förändringar på neuronal nivå, visar nya bevis att mitokondriell dynamik och funktion i astrocyter är inblandade i kognition. Denna artikel beskriver metoden för time-lapse imaging av astrocyt kulturer utrustade med en mitokondriell biosensor: MitoTimer. MitoTimer är ett kraftfullt och unikt verktyg för att bedöma mitokondriell dynamik, mobilitet, morfologi, biogenes och redox tillstånd. Här presenteras de olika förfarandena för kultur, bildförvärv och efterföljande mitokondriell analys.
Introduction
Astrocyter är kritiska aktörer i upprätthållandet av hjärnans homeostas. De är kanske mest kända för att ha betydande strukturella roller i hjärnan, som en del av blod - hjärnbarriären1 och genom att stödja nervceller och synapser i hela hjärnan2. Astrocyt stöd av nervceller är både strukturella3 ochmetaboliska 4,5, med astrocyter främja neurogenes och synaptogenes samtidigt som de ger viktiga metaboliter som laktat till aktiva nervceller4,6,7. Utöver rollen som strukturellt stöd är astrocyter aktiva celler som deltar i Ca2 + signalering och buffring (inklusive spontan mitokondriell Ca2 + tillströmningar)8,9, K+ buffring10, och kan anpassa sig och reagera på hjärnans behov i tider av skada11,12 . Eftersom astrocyter är sådana dynamiska celler har de robusta energibehoven, vilket kräver ett effektivt mitokondriellt nätverk. Dessa mitokondrier har också en avgörande roll för att buffra alltför reaktiva syrearter (ROS)13. Förutom sina individuella eller lokala roller som energiproduktion och ROS-buffring fungerar mitokondrier som ett nätverk14. I den meningen upprätthåller de jämvikt mellan fissioning och fusioning mitokondrier, som representerar nya / reducerade mitokondrier och äldre/ oxiderade mitokondrier, respektive15. Det övergripande redoxtillståndet för en cell kan mätas av redoxtillståndet för mitokondriellt nätverk. I patologi är detta en kritisk information som kan kasta ljus över vilka celler som kanske inte fungerar optimalt.
Under de senaste åren har många sensorer utvecklats för att studera dynamiken och funktionerna hos mitokondrier i celler. Till exempel används sensorer som mäter energiutbyte (ATP), redoxtillstånd (NADH/NAD+, ROS) och enzymatisk funktionalitet (cAMP, Ca2+, Zn2+) för närvarande i studien av mitokondriell funktion16. Bland dem tillåter MitoTimer att följa förändringarna i mitokondriell morfologi (storlek, form, yta), rörlighet (hastighet, förskjutning) och dynamik (fusionering och fissioning händelser), liksom den totala mitokondriella omsättningshastigheten och redox tillstånd. MitoTimer är ett muterat rött fluorescerande protein, drFP58317, med en mitokondriell signal från underenhet VIII av humant cytokrom c oxidas18,19 för att visualisera nyligen syntetiserade mitokondrier i grönt (488 nm) och oxiderat mitokondri i rött (555 nm). Med hjälp av det gröna (488 nm) och röda (555 nm) fluorescensförhållandet möjliggör samtidig utvärdering av enskilda mitokondrier, deras morfologianalys, fusion/fissionshändelser och redox tillståndshistoria20,21. Denna unika egenskap kan användas för att undersöka många vetenskapliga frågor om mitokondriers fysiologiska och patologiska roller och är därför mycket lovande för att avslöja de underliggande mekanismerna för mitokondriell dynamik inom många olika celltyper.
Vi utvecklade nyligen en ny lentiviral vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, nedan kallad LV-G1-MitoTimer) för att studera mitokondriers dynamik och funktioner specifikt i astrocyter in vitro och in vivo22. LV-G1-MitoTimer använder en trunkerad version av gliafibrillärsyrans (GFAP) promotor gfaABC1D, med en B3-förstärkare (gfaABC1D(B3), nedan kallad G1) i kombination med det tidigare beskrivna miR124T neuronala detargetingssystemet23. Det tillåter exklusivt uttryck av den mitokondriella biosensorn i astrocyter in vitro och in vivo22. Presenteras här är de olika stegen för att utföra en kultur av råtta hippocampal astrocyter och utrusta dem med LV-G1-MitoTimer biosensor, liksom de olika mikroskopi steg för att följa beteendet hos astrocyt mitokondrier under flera på varandra följande timmar / dagar.
Protocol
Detta protokoll har utförts med godkännande av en etisk kommitté (avtal VD3602, Lausanne, Schweiz) och följer europeiska riktlinjer för användning av djur.
1. Råtta hippocampal astrocyt primärkultur
- Offra fem råttvalpar (Wistar IGS Rat) genom halshuggning på postnatal dag 1-2.
- Ta bort hjärnan och håll den i en Petriskål som innehåller 5 ml färskt astrocytmedium (DMEM med GlutaMAX kompletterat med 1% Penicillin/Streptomycin och 10% färskt hästserum).
- Isolera hippocampus. Dissociera i 5 ml av det astrocytiska mediet genom tre passager genom en 21 G nål och tre passager genom en 25 G nål.
- Överför de dissocierade cellerna till ett 15 ml centrifugrör och räkna i en hemocytometer.
- Plätera 20 000-25 000 celler/cm2 i flerbrunnrätter (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) och förvara dem vid 37 °C under en atmosfär som innehåller 5 % CO2 för resten av experimentet.
- Byt ut mediet helt vid 3 dagars in vitro (DIV3).
- Vid DIV8 tillsätt 0, 6 pg p24 antigen per cell av lentiviral vektorkodning för mitokondriell biosensor MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22) utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS + 0,01% BSA).
- Tvätta med förvärmd 1x steril PBS (37 °C) vid DIV9 och tillsätt nytt astrocytmedium.
- Vid DIV11, utför 2 tvättar med förvärmd 1x steril PBS (37 °C) och tillsätt färskt astrocytmedium utan fenolrött.
OBS: Valet av beläggning beror på den avsedda analysen. Som standardbeläggning för astrocyt primärkultur rekommenderas att använda 0,2 mg/ml poly-D-lysin eller 8,7 μg/cm2 källarmembranmatris (t.ex. Matrigel). För att visualisera astrocyternas mitokondriella system är det viktigt att arbeta med platta och sträckta celler. I detta sammanhang är kombinationen av källarmembranmatris på IBIDI u-bilder den mest lämpliga. Det är också viktigt att inte arbeta med fenolrött, vilket är giftigt för cellen under upprepad exponering för ljus.
2. Långsiktig övervakning av mitokondriellt system.
- Utvärdera det astrocytiska mitokondriella systemet minst 3-5 dagar efter de lentivirala infektionerna med LV-G1-MitoTimer (för att möjliggöra en tillräcklig fluorescens i mitokondrierna).
- Avbilda cellerna med ett inverterat mikroskop styrt av förvärvs- och analysprogramvaran och en modul för fullständig automatisering av förvärv.
OBS: Se materialförteckningen för information om programvaran och modulen som används i denna studie. - Se till att mikroskopet är utrustat med en burinkubator (se Materialtabellen)för att bibehålla astrocytkulturen vid 5 % CO2 och 37 °C under hela experimentet.
- Fånga fluorescensbilder med sekventiell excitation vid 490 nm (för grön kanal) och 550 nm (för röd kanal) med detektion av gröna (500-540 nm för grön kanal) och röda (550-600 nm för röd kanal) fluorescenssignaler.
- Välj 5 astrocyter per brunn med ett mitokondriellt nätverk som uttrycker tillräckliga nivåer av LV-G1-MitoTimer med en förstoring på 40x. Var noga med att välja astrocyter så platta och stora som möjligt och inte belägna i kluster av celler (för att arbeta med enskilda celler).
- Spara koordinaterna för de 5 markerade cellerna i en xlm-fil (map.xlm). Med den här map.xlm kan användaren återgå till samma celler med tiden.
- Skaffa bildsekvenser (1 bild/s i 60 s) med en förstoring på 150x (100x oljesänkningsmål, 1,5x mellanliggande förstoring) för varje koordinat.
- Upprepa bildförvärv (1 bild/s för 60 s) för samma astrocyter 6 h, 12 h och 24 h efter behandlingar.
OBS: Använd ett mikroskop utrustat med ett snabbt och effektivt autofokussystem. I detta sammanhang användes hårdvarulösningen Perfect Focus System (PFS). PFS använder nära infraröda 870 nm LED- och CCD-linjesensorer för att bekämpa axiella fokusfluktuationer i realtid under långsiktiga avbildningsundersökningar.
3. Analys av individuell mitokondriell morfologi och LV-G1-MitoTimer-förhållande
OBS: NIS General Analysis 3 (GA3) från Nikon användes för att automatisera morfometrisk analys i denna studie.
- För varje bildsekvens (baslinje, 6 h, 12 h, 24 h) väljer du den första bildrutan för röda och gröna kanaler genom att klicka på ND Processing > Välj ram.
- Sammanfoga de röda och gröna kanalerna genom att välja Konverteringar > Sammanfoga kanal.
- Om du vill korrigera bildskuggning väljer du Förbearbetning > Automatisk skuggningskorrigering.
- Använd algoritmen Rullande boll genom att välja Förbearbetning > Rullande kula.
- Om du vill generera binära masker för varje mitokondrion väljer du Segmentering > Tröskelvärde.
- Ta bort alla objekt som trunkeras av kantlinjen genom att välja Binär bearbetning > vidröra kantlinje.
- Om du vill mäta ytan väljer du Mät > objektområde.
- Om du vill mäta diametern väljer du Mät > Eq Diameter.
- Om du vill mäta längden väljer du Mät > längd.
- Om du vill mäta bredden väljer du Mät > bredd.
- Om du vill mäta grovhet väljer du Mät > grovhet.
- Om du vill mäta cirkularitet väljer du Mät > cirkularitet.
- Om du vill mäta förlängning väljer du Mät > förlängning.
- Komponera en grupp (högerklicka) med ovanstående mått och byt namn på den till MorphoData.
- Mät genomsnittlig grön intensitet genom att välja Mät > Medelintensitet.
- Mät genomsnittlig röd intensitet genom att välja Mät > Medelintensitet.
- Om du vill mäta förhållandet röd/grön väljer du Mät > förhållande.
- Skriv en grupp (högerklicka) med ovanstående mått och byt namn på den till RatioData.
- Exportera tabellen till en CSV-fil genom att välja Referens > tabell till CSV.
- Spara GA3-analysskriptet genom att välja Spara som
OBS: En icke uttömmande förteckning över de kriterier som används i den här proceduren sammanfattas i figur 1, tabell 1och tabell 2. Analysen GA3 skriptfil finns i kompletterande (Kompletterande kodning fil 1 och figur 2). De tröskelvärden som användes anpassades för att individualisera så många mitokondrier som möjligt (exklusive stora mitokondriella nätverk där det var möjligt). Där det är möjligt individualiseras mitokondriella nätverk antingen manuellt eller exkluderas från analyserna. På grund av intercellulär variabilitet, utför dessa analyser på minst 20-25 celler per tillstånd (med minst 50 mitokondrier per cell).
4. Analys av mitokondriell motilitet
OBS: På grund av den höga komplexiteten i mitokondriella rörelser är manuell motilitetsanalys att föredra. Här användes Nikons NIS Element-system för att manuellt spåra mitokondrier.
- Öppna spårningsmodulen i NIS och välj Visa > analys > spårning.
- Klicka på Definiera ny ROI.
- Med verktyget Automatisk detekteringväljer du 25-50 mitokondrier på den första bilden av bildsekvensen.
- Klicka på Spåra autodetected ROIs analysera.
- Om det behövs tar du bort de felaktiga ROI-spåren.
- Exportera tabellen till en CSV-fil.
OBS: En icke uttömmande förteckning över de kriterier som används i denna procedur sammanfattas i figur 1 och tabell 3. En spårningsanalys ger i allmänhet en sökväg som visar rörelserna i mitten av varje spårat objekt. De olika spårningsalternativen måste anges i spårningsalternativet. Gynna valet av isolerade mitokondrier som är tillräckligt avlägsna från varandra för att underlätta spårning. Behåll endast de objekt som konsekvent kan spåras över hela sekvensen. Fortsätt på samma sätt för att ta bort avvikande värden på grund av spårning av dålig kvalitet. Följaktligen skiljer sig uppsättningen objekt som analyseras i det här avsnittet från den som analyseras för statiska morfologiska analyser och kommer i allmänhet att vara mindre.
5. Datatransformation, normalisering och statistisk analys
OBS: Främst på grund av mitokondriernas höga heterogenitet har data som genereras ofta en icke-normal fördelning.
- Manuellt logga omformning av mätningarna före bearbetning.
- För varje analys och tidsram normaliserar du manuellt de resulterande uppgifterna med medelvärdet av dem som erhålls vid referensförvärvet.
- Dessutom bör du överväga en andra/dubbel normalisering till ett kontrolltillstånd, till exempel för att utvärdera effekten av en behandling.
- Utför sedan statistisk analys med en tvåvägsmatchad ANOVA. Här användes GraphPad Prism V8.
Representative Results
Primära kultur av astrocyter infekterade med LV-G1-MitoTimer uppvisade typiska mitokondriell nätverk. Före behandlingen visade astrocyter som uttrycker LV-G1-MitoTimer den heterogena mitokondriella storleken och olika gröna/röda fluorescensintensiteter (figur 3, figur 4och video 1). Mitokondriellt system av astrocyt kulturer uttrycker LV-G1-MitoTimer övervakades före och efter inkubation med H202 (10 μM). De olika mitokondriella funktionerna som beskrivs ovan beräknades över 12 h (var 3 h) och normaliserades (cell för cell) till deras ursprungliga tillstånd. På morfologisk nivå (figur 3B) börjar effekterna av H2O2 vara synliga vid ca 6 h. Faktum är att mitokondrierna var fragmenterade (minskning av längd, yta och förlängningsfaktor). Denna fragmentering är ännu mer uppenbar 12 h efter behandlingen. Observera att diametrar, bredder och sfäricitet inte minskades. När det gäller redoxtillstånd och omsättning (figur 3C), 3 h efter H2O2-behandling ökade andelen gröna mitokondrier i astrocyter (följden av en snabb ökning av mitokondriell biogenes). Vid 6 h återvände det gröna/röda förhållandet till baslinjenivåerna, men antalet rent röda mitokondrier ökade betydligt från basala nivåer. Efter 12 h var konsekvenserna av oxidativ behandling av H2O2 synliga och resulterade i en betydande ökning av förhållandet och antalet röda punkter. När det gäller dynamik och rörlighet (figur 3D), 3 h efter behandlingen, ökades alla kriterier tillfälligt. På längre sikt (12 h) rörde sig mitokondrierna långsammare och över kortare avstånd.
Figur 1: Astrocytkultur som uttrycker LV-G1-MitoTimer biosensor. (A) Konfokala fotografier av astrocyter som uttrycker LV-G1-MitoTimer. (B) Urval av konfokala fotografier av reducerade (gröna) balanserade (orange) och oxiderade (röda) mitokondrier med olika fragmenteringsnivåer. C)Sammanfattande diagram över de olika kriterier som finns tillgängliga för analys i en astrocyt som uttrycker LV-G1-MitoTimer. Skalstång: (A) Övre panel: 50 μm, nedre panel: 10 μm, (B) 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mitokondriell morfologi och förhållandeanalys. (A) GA3 script översikt för analys av individuell mitokondriell morfologi och förhållande. (B) Inledande fotografier av en astrocyt som uttrycker LV-G1-MitoTimer analyserade med GA3-skriptet. (C) Exempel på binära masker som genereras för astrocyternas mitokondriella system. Skalstång: 10 μm (B-C). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Effekterna av H2O2 på astrocyternas mitokondriella system. (B) Radardiagram över mitokondriell morfologi, (C) redox tillstånd och omsättning, och (D) rörlighetskriterier utvärderade på astrocyter under baslinjen och 3 h, 6 h och 12 h efter H2O2 behandling. SA: Yta; D: Diameter. L: Längd; W: Bredd; R: Rundhet; S: Sfäricitet; EF: Förlängningsfaktor (=L/W); G/R: Individuellt rött/grönt förhållande. Gpuncta: Procentandel gröna puncta mitokondrier; Rpuncta: Procentandel av röd punkta mitokondrier; Dis: Förskjutning; Tr: Spårlängd; Sp och SpV: Hastighets- och hastighetsvarians; Str: Rakhet. Skalstång: 20 μm (A) och 2,5 μm (infälld). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Fotografier av astrocyter som uttrycker LV-G1-MitoTimer och som visar ett homogent och balanserat mitokondriellt nätverk under baslinjen. Skalningslist: 20 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Effekt av H2O2 behandling på mitokondriellt system av odlade astrocyter. Astrocytiska mitokondrier före H2O2-behandling (utgångslinje), samt 6 h och 24 h efter behandling med H2O2 jämfört med icke- behandlad kontrollcell. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Morfologiska kriterier | Sortiment | Anmärkningar | ||
| Yta (SA) | 0,5–4 μm2 | Dessa kriterier informerar om de fragmenterade långsträckta funktionerna i mitokondrier. De utvecklas i allmänhet i samma riktning. Fragmenterade mitokondrier kommer att ha minskad yta, diameter, längd och förlängningsfaktor medan rundhet, sfäricitet och bredd kan vara oförändrade eller ökade. | ||
| Diameter (D) | 0,5–1,5 μm | |||
| Längd (L) | 0,5–5 μm | |||
| Bredd (W) | 0,5–2 μm | |||
| Rundhet (R) | 0–1 | |||
| Sfäricitet (S) | 0–1 | |||
| Töjfaktor (EF = L/W) | 1–10 | |||
Tabell 1: Sammanfattning av valda parametrar för mitokondriell morfologi.
| Redox tillståndskriterier | Sortiment | Anmärkningar | ||
| Individuellt förhållande (G/R) | 0–10 | Förhållandet anger resultatet av redox-tillståndet. Det informerar om det allmänna tillståndet och åldern för mitokondrierna i cellen. Det är viktigt att överväga att detta förhållande är balansen mellan biogenes och nedbrytning av mitokondrier och fission/fusion av oxiderade mitokondrier med minskad mitokondrier. Därför kan utvärderingen av antalet gröna och röda punkter kraftfullt hjälpa till att tolka resultaten. Grön puncta mitokondrier bestäms när intensiteten av grönt är 10 gånger den röda. Röd puncta mitokondrier bestäms när intensiteten av rött är 10 gånger större än den gröna. Redoxtillståndet för en astrocyt är genomsnittet av alla mitokondrierförhållanden i den cellen. | ||
| Procentandel gröna punkter mitokondrier (Gpuncta) | 0%–100% | |||
| Procentandel röda punkter mitokondrier (Rpuncta) | 0%–100% | |||
Tabell 2: Sammanfattning av valda parametrar för mitokondriellt redoxtillstånd.
| Kriterier för rörlighet | Sortiment | Anmärkningar | ||
| Förskjutning (dis) | 0–10 μm | Tillsammans informerar dessa funktioner nätverkets allmänna motilitetsdynamik. Stationära mitokondrier visar kort förskjutning / spårlängd med låg hastighet. Å andra sidan kan oscillatoriska partiklar differentieras med en skillnad mellan spårlängd och förskjutning (vilket resulterar i låg rakhet) och en ökad hastighet jämfört med statisk. | ||
| Spårlängd (Tr) | 0–10 μm | |||
| Hastighets- och hastighetsavvikelse (Sp och SpV) | 0–1,5 μm/s ± 0,2 μm/s | |||
| Rakhet | 0–1 | |||
| (Str = förskjutning/spårlängd) | ||||
Tabell 3: Sammanfattning av valda parametrar för mitokondriell rörlighet.
Kompletterande kodningsfil 1: GA3 skriptfil för analys av individuell mitokondriell morfologi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Här föreslås en ny metod för att longitudinellt följa dynamiken och omsättningen hos mitokondriellt system i en odlad astrocyt. Till skillnad från en timelapse-strategi på en fast grupp celler eller en enskild cell i taget (oftast används i litteraturen)24,25, kan forskare följa utvecklingen av mitokondriellt system under flera dagar på samma enskilda celler. I motsats till en enda väl levande avbildning där höga nivåer av ljusexponering krävs, och valet av många enskilda celler är mindre genomförbart, drar den föreslagna metoden nytta av detta mikroskops förmåga att avbilda flera olika celler i olika områden i en brunn och att komma tillbaka till samma celler vid olika tidpunkter för att avbilda dem igen. Tack vare normalisering till en baslinje som utförs för varje uppmätt kriterium på varje cell av intresse, tar det hänsyn till mitokondriellt systems komplexitet och undersöker effekten av behandling på varje cell i förhållande till sin egen baslinjebild. Mikroskopets förmåga att självständigt utföra denna typ av avbildning på upp till 16 brunnar åt gången (avbildning 5 celler per brunn) gör det möjligt att ta vederbörlig hänsyn till heterogeniteten hos mitokondriellt system under analysen utan den experimentella variabilitet som följer med avbildning av olika tillstånd på olika dagar.
Kvaliteten på kulturerna, nivåerna av virusinfektioner som uttrycker biosensorn LV-G1-MitoTimer, typen av mikroskop och mål och valet av lämpliga celler är kritiska variabler som måste förbli så konsekventa som möjligt i detta protokoll. Celltätheten, typen av vektor och virustitrar kan anpassas enligt frågan. Även om tidigare arbete visar att LV-G1-MitoTimer-uttrycket inte har några skadliga konsekvenser för mitokondriell funktion och dynamik21,22,26,27, är det viktigt att kontrollera att koncentrationen inte är giftig för cellerna (till exempel kontrollera det totala antalet celler i kontrollbrunnen). Eftersom ett enda fokalplan används bör astrocyter vara: (1) så plana som möjligt, (2) isolerade från andra märkta celler (för att förenkla analysen vid förskjutning i skålen) och (3) med höga fluorescensnivåer. Eftersom celler i kultur kan vara mycket varierande i morfologi, kan mitokondriellt system vara mycket heterogent. I detta sammanhang kompenserar analys av ROI (och inte hela cellen) för vissa problematiska regioner, till exempel de perinukleära regionerna, och minskar variabiliteten. Det är viktigt att göra baslinjen på relativt likartade celler och ta prov på så många celler som möjligt. Följaktligen är höginnehållsförvärv och analysmikroskop idealiska. Under denna longitudinella övervakning är det också viktigt att inte överexponera cellerna till ljus för att undvika biosensorblekning.
Denna avbildningsmetod är inte utan sin komplexitet, och i hela protokollet ingår flera anteckningar, som tar hänsyn till felsökning som gjorts under tidigare tester med mikroskopet. Valet av plattbeläggning som används beror till exempel på den avsedda analysen, men rekommendationer för de mest lämpliga valen för astrocyt primära kulturer har inkluderats. Dessutom bör bildförvärv utföras på minst 5 celler per tillstånd på grund av intercellulär variabilitet. Mer specifikt kommer vissa celler som väljs vid baslinjeavbildning att dö, vissa kommer att flytta ut ur ramen för det tilldelade bildförvärvsområdet, och vissa kommer att ändra sin morfologi, vilket gör mitokondrierna mycket svåra att individualisera i analys. Att avbilda många celler från början ökar sannolikheten för en tillräckligt stor provstorlek på celler för att analysera i slutet av experimentet. Förutom de mer komplexa aspekterna av denna bildteknik finns det några direkta begränsningar när det gäller vem som kan dra nytta av denna typ av avbildning och analys. För att dra full nytta av automatiseringen av bildförvärv måste mikroskopet som används ha ett autofokussystem som kan hantera tidsintervallen mellan bilderna (dvs. var tredje s i detta protokoll) och kan konsekvent fokusera på cellen i fråga innan varje bild tas. Utan JOBS-programvaran, som automatiserar hela bildförvärvsprocessen, blir denna metod dessutom mödosam och potentiellt omöjlig beroende på antalet celler som avbildas eftersom det skulle kräva att varje cell manuellt hittar och avbildas igen vid lämplig tidpunkt. Slutligen är denna avbildningsmetod inte immun mot frågan om fotobleaching. Av denna anledning, som med alla långsiktiga förvärvsmetoder, är det viktigt att välja fluorescerande markörer som är mindre mottagliga för fotobleaching och att skräddarsy bildförvärv för att undvika denna fråga så mycket som möjligt.
Denna teknik skiljer sig från andra som för närvarande används på ett avgörande sätt. Till skillnad från andra timelapse-studier kräver denna teknik inte avbildning på samma position i brunnen hela tiden, och kräver inte heller manuell rörelse av plattan för att avbilda andra områden. Detta ger forskare möjlighet att avbilda många celler under många förhållanden inom en tidsram på 24 timmar. Följaktligen ger förmågan att utföra denna avbildning och analys på många celler i varje brunn samma befolkningsinformation som man skulle få genom att i stort studera en stor grupp celler samtidigt som man dessutom tillhandahåller specifika åtgärder från varje cell som avbildas. Även om vissa specificiteter för denna metod kanske inte gäller för andra bildförvärvsmetoder (beskrivs ovan), överväger fördelarna komplikationerna med den typ av analys som är möjlig efter förvärvet. Denna teknik gör det möjligt för forskare att se de exakta konsekvenserna av olika behandlingar på mitokondriellt system, och följaktligen på de odlade astrocyterna.
Dessutom är denna metod mycket anpassningsbar till många olika vetenskapliga frågor om mitokondriellt beteende och roller i specifika sammanhang. Här behandlar det skisserade protokollet specifikt odlade astrocyter. Många andra celltyper kan dock användas, och de behandlingar som kan testas begränsas endast av de frågor som undersöks. Denna typ av avbildning har potential att främja den kollektiva kunskapen och förståelsen av mitokondriellt beteende, de underliggande mekanismerna som leder till mitokondriell dysfunktion och effekterna av många patologier på den medfödda dynamiken som finns i olika typer av celler.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett Synapsis Foundation-stipendium som tilldelades K.R. och Lausanne University Hospital (CHUV). Författarna tackar Nikon för deras hjälp, särskilt J. Gannevat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
| 19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
| Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
| Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
| Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
| Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
| Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
| Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
References
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105 (2014).
- Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
- MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
- Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
- Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
- Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383 (2021).
- Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
- Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
- de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
- Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
- Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
- Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
- Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
- Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
- Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275 (2017).
- Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
- Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
- Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).
