Summary
Bu protokol, formalin sabit parafin gömülü doku örneklerinin yüzde tümör içeriğini artırmak için bir yöntem sunar.
Abstract
Formalin-sabit parafin-gömülü (FFPE) dokularda kontamine edici tümör dışı dokuların varlığı, genomik çalışmaları büyük ölçüde baltalayabilir. Burada, aşağı akış nükleik asit ekstraksiyonları gerçekleştirmeden önce istenmeyen dokuyu çıkarıp ortadan kaldırarak bir doku örneğinin yüzde tümör içeriğini arttırmak için tasarlanmış bir yöntem olan makrodiseksiyonu açıklamaktayız. FFPE doku blokları, 4-5 μm kaydırağa monte doku kesitleri üretmek için kesitlendi. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama için temsili bir bölüm sunuldu ve daha sonra kurul sertifikalı bir patolog tarafından gözden geçirildi. İnceleme sırasında, patolog H & E'deki tümör dokusunun bölgelerini tanımladı ve işaretledi. Tamamlandığında, işaretlenmiş H&E, aynı doku bloğundan seri lekesiz bölümlerin rezeksiyonuna rehberlik etmek için kullanıldı. Makrodiseksiyonun etkilerini göstermek için, eşleşen makrodisseke edilmiş ve disseke edilmemiş Diffüz Büyük B Hücreli Lenfomalardan (DLBCL) ekstrakte edilen RNA, DLBCL alt tipini ve BCL2 translokasyon durumunu belirleyebilen bir dijital gen ekspresyon testi üzerinde çalıştırıldı. Sonuçlar, makrodiseksiyonun incelenen örneklerin% 60'ında alt tip veya BCL2 translokasyon durum çağrılarını değiştirdiğini göstermiştir. Sonuç olarak, makrodiseksiyon, nükleik asit ekstraksiyonlarından önce tümör zenginleştirmeyi gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yöntemdir ve ürünü daha sonra aşağı akış genomik çalışmalarında güvenle kullanılabilir.
Introduction
Normal klinik tanı sürecinin bir parçası olarak toplanan ve klinik doku depolarında tutulan formalin-sabit parafine gömülü (FFPE) dokular, kanser araştırması da dahil olmak üzere insan araştırmaları için geniş bir kaynağı temsil eder1. İnsan hastalığı hakkındaki anlayışımız derinleştikçe, daha önce morfolojik ve immünofenotipik özelliklere dayanan tek varlıklar olduğu düşünülen hastalıkların, aslında moleküler altyazı testleri gerektiren farklı moleküler alt tiplerden oluştuğu giderek daha açık hale gelmektedir. Sonuç olarak, bu alt tipleri ayırt edebilen yüksek duyarlılıklı genomik testler giderek daha önemli hale gelmiştir2. FFPE dokuları, fiksasyonla ilgili sorunlar nedeniyle genomik tekniklerle zayıf bir şekilde uyumlu olmalarıyla ünlü olsa da, teknoloji ve protokoller geliştikçe, bu teknikler klinik olarak her yerde bulunan bu doku formatı 3,4,5 ile giderek daha uyumlu hale gelmektedir. Bununla birlikte, FFPE dokuları genellikle tümör ve tümör dışı doku materyallerinin katkılarıdır, burada tümör dışı materyalin varlığı sıklıkla istenmeyen ve yüksek oranda mevcutsa, genomik analizlerin sonuçlarını önemli ölçüde zayıflatabilir ve etkileyebilir6. Gerçekten de, bu tür analizler için minimum% 60'lık bir tümör içeriği sıklıkla kullanılır; burada bu eşiğin altında kalan dokular, çalışma kriterlerini7'yi yerine getirmesine rağmen dışlanabilir. Bu, hasta dokularının değerli olduğu ve yüksek sayılarda toplanmasının zor olduğu nadir hastalık ortamlarında özellikle sorunlu olabilir.
Makrodiseksiyon, normal doku miktarını azaltarak düşük tümör içeriğinin etkilerini en aza indiren bir yöntemdir3. Nükleik asit ekstraksiyonundan önce bu tür kafa karıştırıcı tümör dışı materyalin uzaklaştırılması, tümör yüzdesi içeriğini ve dolayısıyla ekstrakte edilen nükleik asitlerin tümör saflığını önemli ölçüde artırabilir. Doku rezeksiyonu kritik olarak, tümör bölgesinin kurul sertifikalı bir patolog tarafından yeni üretilen hematoksilin ve eozin (H & E) boyalı doku kesiti üzerinde tanımlandığı ve daire içine alındığı uzman patolojik incelemesine dayanır8. Dairesel H&E daha sonra sırasıyla istenmeyen ve hedef dokuların çıkarılmasına ve toplanmasına rehberlik etmek için kullanılır. Bu protokol, Mayo Clinic'teki AIDS ve Kanser Örnek Kaynağı (ACSR) Teknik Çekirdek Laboratuvarı'nda gerçekleştirilen patolojik incelemeden doku hasadına kadar makrodiseksiyon adımlarını açıklamaktadır.
Protocol
Tüm örnekler onaylanmış Mayo Clinic IRB protokollerine (PR16-000507 ve PR2207-02) uygun olarak toplandı ve kullanıldı.
1. Numune hazırlama
- Doku yüzdürme suyu banyosunu açın. Sıcaklığı 39 ° C'ye ayarlayın ve suyun sıcaklığa gelmesine izin verin. Ahşap toplama çubuklarını su banyosuna batırın.
- Kesitlenecek FFPE doku bloklarını tanımlayın ve alın.
- Ön etiketli mikroskop, solvent yıkamalarına dayanabilen histoloji sınıfı kalıcı bir işaretleyici kullanarak kayar.
- FFPE bloklarını kesmek için bir mikrotom kullanın. Her blok için bölüm başına 4-5 μm kalınlığında en az 2 tam yüzlü kesit kesin (Şekil 1A).
- Doku kesitlerinin yeni kesilmiş şeridini, slayt montajı için önceden ısıtılmış doku yüzdürme banyosuna aktarın (Şekil 1B, C).
NOT: Ilık su, bölümlerdeki kırışıklıkların "ütülenmesine" yardımcı olur (Şekil 1C). - Her bölümü sırayla ele alarak, tek bir bölümü şeritten ayırmak için forseps kullanın (Şekil 1D).
- Önceden etiketlenmiş bir mikroskop slaytındaki tek bölümü toplayın.
- Mikroskop slaytını bölümün altındaki bir açıyla daldırın ve slaytı, doku bölümünün kenarı slayta temas edecek şekilde konumlandırın (Şekil 1E).
- Doku bölümüyle temas ettikten sonra, doku bölümünün sudan çıkarken kaydırağa karşı aynı hizada düzleşmesini sağlamak için sürgüyü yavaşça yüzdürme banyosundan dışarı çekin (Şekil 1F).
- Slayt başına 1 doku kesiti takın ve tüm bölümler toplanana kadar tekrarlayın.
- Kızağa monte edilmiş doku kesitlerinin oda sıcaklığında (RT) iyice kurumasını bekleyin.
2. Patolojik inceleme
- Her blok9 için bir temsili doku kesitinde H&E boyama işlemi gerçekleştirin.
- Yeni boyanmış H&E'leri kurul onaylı bir patolog tarafından patolojik incelemeye gönderin.
NOT: İnceleme sırasında, patolog her dokudaki tümör içeriğinin yüzdesini belirler ve kaydeder ve her H&E slaytındaki tümör alanını çevreler (bkz. Şekil 2 ve Şekil 3, Satır 1). Tablo 1, Şekil 3, Satır 1'de gösterilen A-E örnekleri için H&E'nin patolojik incelemesi sırasında belirlenen hücreselliğe göre tümör içeriğinin yüzdesini özetlemektedir. %<60 tümör içeriğine sahip kesitler makrodiseksiyongerektirir 7. Nükleik asit ekstraksiyonu için gereken bölüm sayısı, daire içine alınmış tümör alanının büyüklüğüne bağlıdır. Protokolün 1. bölümünde yetersiz bölümler kesilmişse ve daha fazla kesim mümkünse, ek bölümlerin kesilmesi gerekebilir.
3. Deparafinizasyon
- Bir duman davlumbazında, iki cam vitray kabı seyreltilmemiş histoloji sınıfı d-Limonen veya d-Limonen bazlı bir çözücü ve seyreltilmemiş 200 geçirmez moleküler sınıf etanol ile 1 cam vitray kabı önceden doldurun.
DİKKAT: D-Limonen'in cilt ve gözlerle temasından kaçının, buhar veya buğunun solunmasından kaçının ve tutuşma kaynaklarından uzak tutun. Etanol'ü ısıdan, kıvılcımlardan ve açık alevlerden uzak tutun, dökülmekten ve cilt veya gözlerle temasından kaçının, iyi havalandırın ve buharları solumaktan kaçının.
NOT: Bulaşıkları rafa kaldırılmış slaytları suya batıracak kadar doldurun (Şekil 4A); Gösterilen 20 slaytlı boyama kaplarını doldurmak için 250 mL gereklidir. Her 40 slayttan sonra d-Limonen ve etanol yıkamalarını değiştirin. D-Limonen (C 10 H 16), histolojik metodolojilerde daha yaygın hale gelen ve ekstraksiyon sonrası iyi kalitede nükleik asit veren ksilene alternatif, benzer şekilde etkili ve daha az toksik bir mum giderme ajanıdır10,11,12,13,14. Bu protokol daha biyo-dostu alternatifler kullanılarak yapılabilmesine rağmen15, eğer varsa, ekstrakte edilen nükleik asit kalitesi üzerindeki etkileri belirlenmeye devam etmektedir. - Lekesiz FFPE dokusuna monte edilmiş slaytları cam Coplin slayt raflarına yerleştirin (Şekil 4A, giriş).
- raflı slaytları 2 dakika boyunca d-Limonene yıkama 1'e batırın; ilk 20 saniye boyunca hafifçe ajitasyon yapın.
NOT: Yıkamalar arasında taşınmayı en aza indirmek için, kızakların rafını yıkamadan çıkarırken, fazla yıkamayı gidermek için rafın tabanını kağıt mendil üzerine hafifçe yapıştırmadan önce rafın kısa bir süre boşalmasına izin verin. - raflı slaytları seyreltilmemiş D-Limonene yıkama 2'ye 2 dakika batırın; ilk 20 saniye boyunca hafifçe ajitasyon yapın. Rafı çıkarın, boşaltın ve tekrar sokun.
- raflı slaytları 2 dakika boyunca etanol yıkamaya batırın; ilk 20 saniye boyunca hafifçe ajitasyon yapın. Rafı çıkarın ve boşaltmak için emici bir doku üzerine yerleştirin. Slaytların en az 10 dakika, ancak en fazla 2 saat boyunca hava ile kurumasına izin verin.
3. Makrodiseksiyon
- Tezgahta, bir Coplin cam kavanozu DNaz / RNase içermeyen suda 50 mL% 3 gliserol ile doldurun
NOT: Her 40 slayttan sonra gliserol yıkamayı değiştirin. - 1,5 mL mikrotüpleri mikrotüp başına 160 μL doku sindirim tamponu ile önceden etiketleyin ve önceden doldurun.
NOT: Makrodiseksiyondan sonra gerçekleştirilen nükleik asit ekstraksiyonlarında DNA/RNA FFPE ekstraksiyon kiti kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Böylece, bu protokolde kullanılan doku sindirim tamponu, 10 μL Proteinaz K ve 150 μL PKD tamponundan oluşuyordu. - H&E üzerindeki patolojik işaretleri deparafinize doku slaytlarının arkasına kadar izleyin.
NOT: Deparafinize edilmemiş dokularla karşılaştırıldığında (Şekil 3, Satır 2 ve Şekil 4B), deparafinize dokular beyazdır ve oldukça görünürdür (Şekil 3, Satır 3 ve Şekil 4C). Makrodiseksiyona izin veren, deparafinize doku özelliklerinin bu yüksek görünürlüğü ve ayırt edilebilirliğidir. H&E'yi tezgahın üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve deparafinize slaytın ön tarafını eşleşen patologun H&E'nin gözden geçirdiği arkaya doğru yerleştirin (Şekil 4D). Deparafinize dokuyu H&E dokusu ile hizalayın (Şekil 4E). Patologun işaretlerini izlemek, makrodiseksiyon sürecinde kritik bir adımdır ve bu işaretlerin mümkün olduğunca doğru bir şekilde çoğaltılmasına özen gösterilmelidir. Bu, B, D ve E örnekleri gibi küçük ve/veya bağlantısı kesilmiş dokular için özellikle zor olabilir (Şekil 3, Şekil 4E ve Şekil 4E iç kısmı). İzlemeye yardımcı olmak için, patolog tarafından çizilen işaretleri izlemek için mürekkepli ince veya ultra ince uçlu bir işaretleyici (Şekil 4E, iç kısım ii) kullanılmalıdır. Etanol mendiller, hataları gidermek ve gerekirse geri izlemeye izin vermek için yararlı olabilir. - Şimdi işaretlenmiş deparafinize slayt dokusunu yüzü yukarı bakacak şekilde çevirin ve tümör bölgesinin kenarlarını önceden kesmek için işaretleyicinin çizgisini temiz bir tıraş bıçağının köşesiyle izleyin.
- Her slaytı sırayla ele alarak, deparafinize slaytları% 3 gliserol çözeltisine batırın. Slaytı yavaşça çıkarmadan önce dokunun tamamen suya batırıldığından emin olun (Şekil 4F).
NOT: Gliserol daldırmanın amacı, doku toplanmasına yardımcı olmak için dokuyu nemlendirmek, aynı zamanda doku ile toplanan dokunun yerleştirilmesi gereken plastik mikrotüp arasında itmeye neden olabilecek statik yük birikimini azaltmaktır. - Fazla gliserol çözeltisini çıkarmak için slaytın arkasını bir mendille yavaşça silin ve slaytı tezgahın üzerine koyun, yüzü aşağı bakacak şekilde silin. Dokuların 1-2 dakika boyunca kısa bir süre hava kurumasına izin verin.
NOT: Fazla gliserolün ekstraksiyon işlemine taşınması, nükleik asit ekstraksiyonlarının verimini ve kalitesini olumsuz yönde etkileyebilir. Dokular hafif nemli olmalı, ancak toplandığında gözle görülür şekilde ıslak olmamalıdır. - İlgilenilen tümör alanının slaytta nerede bulunduğuna bağlı olarak, (a) tümör dokusunu doğrudan toplamak, tıraş bıçağını kullanarak ilgili dokuyu slayttan kazımak / toplamak için kullanmak veya (b) ilgilenilen tümör dokusunu toplamadan önce tümör olmayan dokuyu çıkarmak ve atmak için tıraş bıçağının düz kenarını kullanın (Şekil 3).
NOT: Toplanan doku bıçağın dibinde toplanma veya yuvarlanma eğilimindedir (Şekil 4G) - Toplanan dokuyu bıçaktan çıkarmak için tahta bir çubuk kullanın (Şekil 4H ve iç kısım) ve uygun önceden etiketlenmiş ve önceden doldurulmuş mikrotüpe aktarın (Şekil 4I).
NOT: Sindirim tamponu, dokuyu tahta toplayıcıdan sıvıya "çekmeye" yarar. - Nükleik asit ekstraksiyonuna devam edin.
NOT: Nükleik asit ekstraksiyonları, üreticinin talimatlarına göre DNA/RNA FFPE ekstraksiyon kiti kullanılarak tamamlandı ve elde edilen nükleik asitler bir UV-vis spektrofotometre kullanılarak ölçüldü. Elde edilen RNA, dijital gen ekspresyon profillemesi tabanlı DLBCL90 testi16 üzerinde çalıştırıldı.
Representative Results
Toplam 5 Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma (DLBCL) FFPE doku bloğu kesitlendi ve elde edilen kesitler nükleik asit ekstraksiyonundan önce makrodiseke edildi veya yapılmadı. Ekstrakte edilen RNA, DLBCL90 testi16 üzerinde çalıştırıldı. Makrodisseke edilmiş örnekler, bir kez 5 μL RNA stok konsantrasyonu kullanılarak, ancak toplam RNA girişinin 300 ng'den fazla olmaması ve bir kez de disseke edilmemiş muadillerinin RNA girdileriyle eşleşmesi için seyreltilmiş 5 μL RNA stoğu kullanılarak iki kez çalıştırıldı. DLBCL90 sonuçları Tablo 2'de özetlenmiştir.
DLBCL, GCB, ABC ve sınıflandırılmamış veya UNC17,18 olarak bilinen bir ara grup olmak üzere farklı terapötik yanıtlara sahip 3 ayrı orijin hücre (COO) alt tipinden oluşur. MYC, BCL2 ve veya BCL6'yı tek başına veya kombinasyon halinde (çift veya üçlü vuruş) içeren translokasyonlar da DLBCL'de, özellikle GCB alt tipi19'da sıklıkla gözlenir. DLBCL90 testi, selefi Lymph2Cx klinik testinin bir uzantısıdır ve bu nedenle DLBCL COO alt tip belirleme yeteneğine sahiptir, ancak esas olarak, floresan in-situ hibridizasyonuna (FISH) alternatif olarak dijital gen ekspresyonu kullanarak BCL2'yi içeren çift vuruşlu (DH) translokasyonları barındıran örnekleri tanımlamak için geliştirilmiştir 16,20. Tablo 2'deki sonuçlar, makrodiseksiyonun COO veya DHITsig durum çağrılarını değiştirdiğini, incelenen örneklerin% 60'ını (3/5) gerektirdiğini göstermektedir.
A örneğinin makrodiseksiyonunun COO çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak DHITsig çağrısını NEG'den UNCLASS'a değiştirdi ve bu değişiklik makrodiseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak ve benzer olasılık puanlarıyla gözlendi (0.224, 0.254). Buna karşılık, örnek C'nin makrodiseksiyonunun DHITsig çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak COO çağrısını GCB'den UNC'ye değiştirdi. Yine, bu değişiklik makrodisseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak gözlenmiştir. Bununla birlikte, 0.117'de, COO çağrı olasılığı, azaltılmış RNA girişi olan makrodisseke edilmiş örnek için 0.1'lik çağrı eşiğine daha yakındı. Örnek A'ya benzer şekilde, örnek E'nin makrodiseksiyonunun COO çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak DHITsig çağrısını değiştirdi. Bununla birlikte, E örneği için çağrı UNCLASS'tan NEG'ye değişti ve bunu makrodisseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak makul derecede benzer olasılık çağrılarıyla yaptı (0.849, 0.833). Özellikle, DHITsig NEG'deki bu çağrı değişikliği, E örneğinin ABC-DLBCL'ye bulunduğu ve BCL2'yi içeren çift vuruşlu translokasyonların yalnızca GCB-DLBCL19'da gözlemlendiği bildirildiği için biyolojik olarak mantıklıdır.
Şekil 1: Bir mikrotom kullanılarak slayta monte edilmiş doku kesitlerinin oluşturulması . (A) FFPE doku bloğu mikrotom mandren tarafından yerinde tutulur ve sıralı FFPE doku kesitlerinden oluşan bir şerit üretmek için kesilir. (B) Önceden ıslatılmış tahta çubuklar kullanılarak, şerit mikrotomdan toplanır ve ılık su banyosuna aktarılır. (C) Suyun sıcaklığı, doku şeridindeki kırışıklıkların giderilmesine yardımcı olur. (D) Bireysel FFPE doku kesitleri, iki bölümün birleşme noktasına kapalı forseps yerleştirilerek ve bölümleri birbirinden ayıran forsepsleri nazikçe açarak doku şeridinden çıkarılır. (E) Kesitler, bir cam sürgüyü bir açıyla batırarak ve bölümün kenarı cam kızağa değene kadar yan tarafı doku bölümüne doğru yavaşça hareket ettirerek sudan toplanır. (F) Slayt ve bölüm dokunduğunda, slaytı yavaşça sudan çıkarın ve doku bölümünün slayda aynı hizada düşmesini sağlayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyalı kesitlerin patolojisi ve histolojik incelemesi. (A,B) H&E doku kesiti, kurul onaylı bir patolog tarafından mikroskobik incelemeye tabi tutulur. (C,D) Patolog tüm dokuyu inceledikten ve% 100 tümör dokusu olmadığını bulduktan sonra, patolog dokunun tümör alanını çevrelemek için bir belirteç kullanacaktır. (E,F) İşaretli H&E'yi orijinal FFPE doku bloğuna karşı tutmak, tüm dokunun tümör materyali olmadığını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Doku örnekleri. Bu görüntüde patolojik olarak gözden geçirilmiş ve tümör işaretli H&Es (Sıra 1), işlenmemiş slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 2), deparafinize slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 3), slaytın arkasında izlenen patoloji işaretlerine sahip deparafinize slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 4), bu protokolü göstermek için kullanılan 5 örnek (A-E) için deparafinize edilmiş ve makrodisseke edilmiş slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 5) gösterilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FFPE doku kesitlerinin deparafinizasyonu ve makro-diseksiyonu: (A) Bir duman davlumbazında, bir sürgü rafına monte edilen FFPE dokuları iki d-limonen yıkamada ve bir etanol yıkamada yıkanır. (B,C) Yıkama sonrası, tüm parafin çıkarıldı ve sadece önceden yıkanmış muadillerine kıyasla şimdi beyaz ve oldukça görünür olan slaytta sadece doku kaldı. (D) Deparafinize slayda monte edilmiş doku bölümü, eşleşen işaretli H & E'nin arkasına yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir. (E) H & E'deki tümör alanı işaretleri daha sonra ince veya ultra ince uçlu kalıcı bir işaretleyici kullanılarak deparafinize slaytın arkasında izlenir (F) İşaretli deparafinize slayda monte edilmiş doku bölümü daha sonra toplanacak doku bölümünü nemlendirmek için bir gliserol yıkamaya batırılır. Slayt gliserolden yavaşça çıkarılır ve slayt dokusunu tezgahın üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirmeden önce slaytın arkası fazla gliserolü çıkarmak için bir doku ile silinir. (G) Temiz bir tıraş bıçağının düz tarafı kullanılarak, doku makrodiseke edilir ve patolog işaretlerinin dışındaki istenmeyen doku, bıçağın kenarı boyunca toplanan ilgili doku toplanmadan önce atılır. (H) Toplanan dokuyu bıçağın kenarından çıkarmak için tahta bir çubuk kullanılır. (I) Doku daha sonra önceden etiketlenmiş bir mikrotüp önceden doldurulmuş doku sindirim tamponuna aktarılır ve nükleik asit ekstraksiyonu için hazırdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek Kimlik | Bütün Doku (a) | Dairesel doku alanı (b) | Tüm dokunun genel tümör içeriği (c) | Makrodiseksiyon ile tümör içeriğinde katlama artışı (d) | Makrodisseke edilmemiş (e) | Makrodisseke (f) | ||||
| % Canlı tümör | % Diğer | % Canlı tümör | % Diğer | Çıkarılan 5 μm slaytların sayısı | RNA konk (ng/μL) | Çıkarılan 5 μm slaytların sayısı | RNA konk (ng/μL) |
|||
| Örnek A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Örnek B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Örnek C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Örnek D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Örnek E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tablo 1: Patoloji inceleme verileri. Tablo, (a) tüm doku kesitindeki canlı tümörün yüzölçümünü, (b) hücreselliğe göre inceleme sırasında patolog tarafından daire içine alınan/işaretlenen bölgedeki canlı tümör yüzdesini, (c) tüm dokunun tahmini genel tümör hücreselliğini (a x b), (d) makrodiseksiyon ile elde edilen tümör hücreselliğinde tahmini kıvrım artışını, (e ve f) ekstrakte edilen 5 μm lekesiz FFPE slayta monte edilmiş doku kesitlerinin sayısı ve eşleşen makrodisseke edilmemiş ve makrodisseke edilmiş numuneler için elde edilen RNA konsantrasyonları. % Diğer, tümör dokusu olmayan ve bağ dokusu, stromal fibroblastlar, kan damarları ve diğer doğal stromal elementleri içerebilen belirli bir numunede bulunan diğer tüm dokuları ifade eder. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
| Örnek Kimlik | RNA girişi (ng) | DLBCL90 COO çağrısı | DLBCL90 çağrı olasılığı | DHITsig çağrısı | DHITsig pos olasılığı | DHITsig olumsuzlama olasılığı | |
| Makrodisseke edilmemiş | Örnek A | 95.0 | cesaret | 0.000 | Negatif | 0.135 | 0.865 |
| Örnek B | 170.0 | cesaret | 0.000 | Negatif | 0.032 | 0.968 | |
| Örnek C | 68.5 | cesaret | 0.028 | Negatif | 0.033 | 0.967 | |
| Örnek D | 286.5 | Abc | 0.998 | Negatif | 0.002 | 0.998 | |
| Örnek E | 126.0 | Abc | 0.989 | UNCLASS | 0.212 | 0.788 | |
| Makrodisseke edilmiş | Örnek A_M | 291.7 | cesaret | 0.000 | UNCLASS | 0.224 | 0.776 |
| Örnek B_M | 300.0 | cesaret | 0.000 | Negatif | 0.016 | 0.984 | |
| Örnek C_M | 231.2 | UNCLASS | 0.210 | Negatif | 0.015 | 0.985 | |
| Örnek D_M | 300.0 | Abc | 0.999 | Negatif | 0.002 | 0.998 | |
| Örnek E_M | 223.2 | Abc | 0.987 | Negatif | 0.151 | 0.849 | |
| Makrodisseke edilmiş ve RNA seyreltilmiş | Örnek A_M | 95.0 | cesaret | 0.000 | UNCLASS | 0.254 | 0.746 |
| Örnek B_M | 170.0 | cesaret | 0.000 | Negatif | 0.023 | 0.977 | |
| Örnek C_M | 68.5 | UNCLASS | 0.117 | Negatif | 0.027 | 0.973 | |
| Örnek D_M | 286.5 | Abc | 0.999 | Negatif | 0.002 | 0.998 | |
| Örnek E_M | 126.0 | Abc | 0.995 | Negatif | 0.167 | 0.833 | |
Tablo 2: DLBCL90 dijital gen ekspresyon testi sonuçları. Nükleik asit ekstraksiyonları yapılmadan önce beş örnek (A-E) makrodiseke edilmedi veya makrodiseke edildi. Elde edilen RNA, maksimum RNA giriş hacminin 5 μL olduğu DLBCL90 testinde çalıştırıldı. makrodisseke edilmemiş örnekler 5 μL stok RNA kullanılarak çalıştırıldı. Her makrodisseke edilmiş numune, (a) 60 ng / μL'lik alikotlar mümkün olmadıkça 5 μL stok RNA kullanılarak iki kez çalıştırıldı ve (b) makrodisseke edilmemiş muadillerinin konsantrasyonlarına / girdilerine uyacak şekilde seyreltilmiş 5 μL stok RNA'sı kullanıldı. _M sonek, bu örneğin makrodisseke edildiğini gösterir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
FFPE dokuları sıklıkla tümörlü ve tümör dışı dokuların heterojen katkılarıdır. Yüksek duyarlılıklı genomik testler hem klinik hem de araştırma ortamlarında giderek daha yaygın hale gelmektedir, ancak tümör dışı dokuyu kirleten varlığıyla karıştırılabilir. Gerçekten de, genomik çalışmalar için minimum% 60'lık bir tümör içeriği sıklıkla önerilmektedir. Tümör yüzdesi, tümör materyalinin kapladığı doku alanına veya doku içindeki tümör hücrelerinin oranına göre belirlenebilir. Bölgeye göre tümör, tümör saflığı için yaygın olarak kullanılan bir metrik olmasına rağmen, her zaman dokunun doğru bir tanımını göstermez. Her ikisi de 1000 hücreli iki doku düşünün, bunların 500'ü tümör hücreleridir. Doku A'da, tümör olmayan 500 hücre, tümör hücresininkine benzer hacimlere sahip stromal hücrelerdir. Bu dokuda, tümör yüzdesi hem hücresellik hem de alan açısından% 50 olarak kabul edilebilir. B dokusunda, tümör olmayan 500 hücre, tümör hücresinin 4 katı hacimli yağ hücreleridir. Bu dokuda, tümör yüzdesi hala hücreselliğe göre% 50, ancak alana% 20'dir. Üçüncü bir doku olan C dokusu, 500 tümör hücresi artı 400 yağ hücresi ve 800 stromal hücreden oluşur ve hacimleri sırasıyla tümör hücrelerinin 4x ve 0.5x olanıdır. 100 yağ hücresinin 800 stromal hücrenin hacmine eşit olduğu göz önüne alındığında, C dokusunun tümör yüzdesi hücreselliğe göre% 29'dur (500/1700), ancak yine de alana% 20'dir. D dokusu ayrıca 1x, 4x ve 0.1x hacim oranlarına sahip tümör, yağ ve stromal hücrelerden oluşur. Ancak, hücre sayısı sırasıyla 400, 10 ve 720'dir. Böylece, D dokusunun tümör yüzdesi hücreselliğe göre %35 (400/1130) ancak alana göre %78'dir. Bu örnekler aşırı derecede basittir ve gerçek dünyadaki doku bileşimlerini yansıtmaz, ancak doku kompozisyonunun önemini ve tümör içeriği arasındaki farkı alana ve hücreselliğe göre açıkça ifade eder. Önemli olarak, aşağı akış nükleik asit ekstraksiyonu için tümör içeriğinin zenginleştirilmesi söz konusu olduğunda, tümör hücreselliği, tümör hücrelerinden daha fazla tümör dışı hücreden genomik materyal çıkarmanın artan kafa karıştırıcı potansiyeli nedeniyle daha önemli bir özelliktir. Bu sadece dokuların tümör içeriğini yüzde hücresellik açısından değerlendirme ihtiyacını değil, aynı zamanda tümör dışı dokunun olası olumsuz etkilerini en aza indirmek için istenmeyen dokuyu eksize etme ihtiyacını da vurgulamaktadır. Doku zenginleştirme için çeşitli yöntemler vardır, bunlardan başlıcaları makrodiseksiyon ve mikrodiseksiyondur.
Bu protokolde açıklanan yöntem olan makrodiseksiyon nispeten hızlı, basittir ve pahalı veya özel ekipman gerektirmez. Makrodiseksiyon tümör içeriğini büyük ölçüde iyileştirebilse de, tümör dışı materyali tamamen ortadan kaldırmadığını anlamak önemlidir. Makrodiseksiyonun amacı, istenmeyen dokudan kaynaklanan "gürültüyü" azaltmak için istenmeyen dokunun dışlanması yoluyla ilgilenilen dokuyu yeterince zenginleştirmektir, bu da ilgilenilen dokudan gelen ilgi sinyalini artırabilir. Bu nedenle, makrodiseksiyon aracılı tümör zenginleştirme, ilgilenilen belirteçleri, özellikle de düşük bolluğa veya zayıf ekspresyona sahip tümöre özgü moleküler belirteçleri daha iyi tespit etmek için sinyal-gürültü oranını arttırmanın bir yoludur. Bununla birlikte, makrodiseksiyon, tıraş bıçağı gibi kaba aletlerin sunduğu hassasiyet eksikliği nedeniyle sınırlamalara sahiptir ve patologun işaretleyicisinin çizgi kalınlığından kaynaklanan hassasiyet sorunlarına ve patologların H & E sınırlarını izlerken potansiyel hatalara karşı hassastır. Yukarıda belirtildiği gibi, tümörün içine gömülü doğal ve tümöre neden olan stromal elementlerin (yani bağ dokusu, stromal fibroblastlar, kan damarları, benign reaktif lenfositler, makrofajlar) varlığı nedeniyle% 100 tümör saflığı elde etmek mümkün değildir. Gerçekten de, birçok invaziv veya diffüz infiltratif malignite, stromal fibroblastlar ve diğer neoplastik olmayan hücre tipleri ile yakından karışmış tümör hücresi kümeleri ile sonuçlanan sağlam bir desmoplastik stromal yanıta neden olur; pankreas kanseri dokuları21 gibi bu stromal reaksiyon paterniyle ilişkili tümörlerin, manuel makrodiseksiyondan ziyade dijital olarak yönlendirilmiş mikrodiseksiyondan daha fazla fayda sağlayabileceği yerlerde.
Manuel mikrodiseksiyon, bir iğne veya neşter kullanarak dokulara özgü hücrelerin veya popülasyonların tanımlanmasına, diseksiyonuna ve izolasyonuna yardımcı olmak için mikroskop altında gerçekleştirilir ve makrodiseksiyon22'ye göre artan hassasiyet avantajına sahiptir. Bununla birlikte, manuel mikrodiseksiyon, düşük tümör içeriğine veya manuel diseksiyonla uyumlu olmayan karmaşık özelliklere sahip karmaşık dokular için gereken incelikten yoksun zahmetli bir işlemdir. Bu tür dokular, lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi yüksek hassasiyetli otomatik yöntemler kullanılarak diseke edilebilir. Gerçekten de, dijital olarak yönlendirilen mikrodiseksiyonun, pankreas kanseri dokularında manuel makrodiseksiyona kıyasla daha yüksek oranda tümör içeriği sağladığı gösterilmiştir23. Bununla birlikte, uzmanlaşmış, pahalı ekipmanlara ve yüksek eğitimli bireylere duyulan ihtiyaç gibi bu yüksek hassasiyetli otomatik yöntemlerin dezavantajları, iş akışlarına dahil edilmesini engellemiştir. Makrodiseksiyon ve lazer yakalama mikrodiseksiyonunun (LCM) gen ekspresyon profillemesi üzerindeki etkilerini karşılaştıran de Bruin ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada, LCM örneklerinin düşük toplam RNA verimine (30 ng ortalama) sahip olduğu ve cDNA kütüphanesi hazırlık giriş eşiğini karşılamak için iki tur mRNA amplifikasyonu gerektirdiği bulunmuştur24. Yazarlar, ortaya çıkan LCM gen ekspresyon profillerinin, makrodisseke edilmiş profillerin tümör dışı stromal katkılardan etkilendiğinden daha fazla mRNA amplifikasyon turlarından etkilendiğini bulmuş ve makrodiseksiyonun güvenilir gen ekspresyon verileri üretmek için yeterince kullanılabileceği sonucuna varmışlardır24.
NanoString dijital gen ekspresyon profillemesinin önemli bir avantajı, özellikle yüksek oranda bozulmuş FFPE türevi RNA ile çalışırken, RNA amplifikasyonu veya cDNA kütüphanelerinin hazırlanması gibi enzimatik bağımlı süreçler gerektirmemesidir. Bununla birlikte, tahliller tipik olarak toplam RNA 25,26'nın 50-300 ng arasındaki girdiler için optimize edilmiştir, bu da de Bruin ve ark.24'ün bulgularına dayanarak, doku girişini arttırmadan mikrodisseke dokularla uyumlu olmayabilir; doku örneklerinin cerrahi rezeksiyonlardan ziyade küçük biyopsiler olarak giderek daha fazla toplandığı bir çağda olumsuz bir talep. DLBCL90 testi için kullanılan RNA girişleri, hem makrodisseke edilmiş hem de disseke edilmemiş dokular için 68.5-300 ng arasında değişmiştir. Sonuçlar, makrodiseksiyonun incelenen örneklerin% 60'ında çağrı değişikliklerine neden olduğunu ve bu değişikliklerin makrodisseke edilen örneklerin RNA girişinden bağımsız olarak gözlemlendiğini göstermektedir. Bununla birlikte, düşük RNA girişi için COO olasılığı, eşiklerin GCB için 0 ila 0.1, UNC için 0.1-0.9 ve ABC çağrıları20 için 0.9 >ila <0.0 olduğu COO CB / UNC olasılık çağrı eşiğini ihlal etmiştir. Başlıca DLBCL COO alt tipleri, tüm DLBCL vakalarının% 41 ve% 44'ünü oluşturan GCB ve ABC'dir; UNC ikisinin ara grubunu temsil eder ve ABC en agresif 20,27'dir. Bu nedenle, COO'nun C örneğinin makrodiseksiyonu üzerine yaptığı değişiklik, COO alt tipinde GCB'den ABC'ye açık bir değişikliğe neden olmazken, GCB'den UNC'ye geçiş, daha agresif bir hastalığa doğru bir kayma önerebilir. Dahası, son zamanlarda yapılan çalışmalar, UNC alt tipinin sadece bir ara alt tip olmadığını ve potansiyel olarak alt tipe özgü terapötik olarak sömürülebilir niteliklere sahip olabileceğini göstermektedir28. Benzer şekilde, A ve E örneklerinin makrodiseksiyonu, DHITsig çağrılarında DH negatiften DH pozitife veya tam tersi yönde belirgin değişikliklere neden olmamıştır. Bununla birlikte, makrodiseksiyon üzerine bir GCB örneğinin (örnek A) NEG'den UNCLASS'a ve bir ABC örneğinin (örnek E) makrodiseksiyon üzerine UNCLASS'tan NEG'e hareketleri biyolojik olarak uygundur, çünkü BCL2'yi içeren çift vuruşlu translokasyonların münhasıran bir GCB fenomeni olduğu bildirilmiştir19. Translokasyonlar klinik ortamlarda FISH tarafından geleneksel olarak ve her yerde tespit edilmesine rağmen, tespitleri için alternatif daha az ilgili ve zaman alıcı bir yöntem tanımlamak için artan bir ivme vardır. DLBCL90 testi, bu testin klinik tanı29'da kullanılan FISH problarına şifreli translokasyonları tespit edebildiği bulgusuyla kullanımının gerekçesinin güçlendirildiği bu ihtiyacı karşılayan önemli bir araçtır.
Yukarıda açıklanan makrodiseksiyon protokolü, araştırmacıların normalde yaygın olarak kullanılan çalışma dahil etme kriterleri eşiklerinin altına düşecek doku örneklerinin tümör içeriğini arttırmalarını sağlayan basit bir yöntemi özetlemektedir. Bir çalışma iş akışına makrodiseksiyon dahil etmek, araştırmacıların tümör içeriğini artırarak zayıf tümör yoğun dokuları çalışma dışlamasından kurtarmalarını sağlar. Buna karşılık, bu, ortaya çıkan RNA ve DNA'nın genomik araştırma altındaki tümörü temsil ettiğine dair artan güvene izin verir. Doku diseksiyonu için daha kesin yöntemler mevcut olsa da, daha geniş, infiltratif olmayan, tabaka benzeri veya katı bir şekilde büyüyen tümörler için makrodiseksiyon muhtemelen yeterlidir. Burada sunulan sonuçlar, genomik tahlillerde tümör saflığının önemini ve bunu başarmak için güvenilir bir araç olarak makrodiseksiyonun önemini vurgulamaktadır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, biyonumune bilim programı kapsamında NIH tarafından finanse edilen AIDS ve Kanser Örnek Kaynağı (ACSR, UM1 CA181255-2) tarafından desteklenmektedir. Video çekildi ve post prodüksiyon düzenlemesi Mayo Clinic Media Services tarafından gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).
- Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).
- Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), 0178706 (2017).
- Oh, E., et al. Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples. PLoS One. 10 (12), 0144162 (2015).
- Holley, T., et al. Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples. PLoS One. 7 (11), 50586 (2012).
- Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers (2021).
- Javey, M., et al. Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment. Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).
- Kim, Y. W., et al. Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).
- Foti, C., et al. Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician. Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).
- Meuse, C. W., Barker, P. E. Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).
- Schmeller, J., et al. Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA. Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).
- Prema, V., et al. Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).
- Ennishi, D., et al. Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).
- Rosenwald, A., et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).
- Scott, D. W., et al. High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology. Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).
- Scott, D. W., et al. Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).
- Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).
- Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R.
- Geiersbach, K., et al. Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors. Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).
- de Bruin, E. C., et al. Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles. BMC Genomics. 6, 142 (2005).
- Ramsower, C. A., et al. Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma. Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).
- Maguire, A., et al. Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature. International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).
- Rosenwald, A., Staudt, L. M. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).
- Wright, G. W., et al. A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications. Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).
- Hilton, L. K., et al. The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH. Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).
