Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Erhöhung des prozentualen Tumorgehalts von formalinfixierten paraffineingebetteten Gewebeproben vor.
Abstract
Das Vorhandensein von kontaminierendem Nicht-Tumorgewebe in Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) -Gewebe kann genomische Studien stark untergraben. Hierin beschreiben wir die Makrodissektion, eine Methode, die entwickelt wurde, um den prozentualen Tumorgehalt einer Gewebeprobe zu erhöhen, indem unerwünschtes Gewebe entfernt und eliminiert wird, bevor nachgeschaltete Nukleinsäureextraktionen durchgeführt werden. FFPE-Gewebeblöcke wurden geschnitten, um 4-5 μm Gleitgewebeschnitte zu erzeugen. Ein repräsentativer Abschnitt wurde für die Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung eingereicht und anschließend von einem zertifizierten Pathologen überprüft. Während der Überprüfung identifizierte und markierte der Pathologe die Regionen des Tumorgewebes in der H & E. Nach der Fertigstellung wurde die markierte H & E verwendet, um die Resektion der seriellen unbefleckten Abschnitte aus demselben Gewebeblock zu leiten. Um die Auswirkungen der Makrodissektion zu demonstrieren, wurde RNA, die aus übereinstimmenden makrodissektierten und nicht dissektierten diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen (DLBCL) extrahiert wurde, auf einem digitalen Genexpressionsassay durchgeführt, der in der Lage ist, den DLBCL-Subtyp und den BCL2-Translokationsstatus zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Makrodissektion die Statusaufrufe des Subtyps oder der BCL2-Translokation in 60% der untersuchten Proben veränderte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Makrodissektion eine einfache und effektive Methode zur Durchführung einer Tumoranreicherung vor Nukleinsäureextraktionen ist, deren Produkt dann sicher in nachgelagerten genomischen Studien verwendet werden kann.
Introduction
Formalin-fixierte paraffineingebettete (FFPE) Gewebe, die im Rahmen des normalen klinischen Diagnoseprozesses gesammelt und in klinischen Geweberepositorien aufbewahrt werden, stellen eine umfangreiche Ressource für die Humanforschung, einschließlich der Krebsforschung,dar 1. Da sich unser Verständnis menschlicher Krankheiten vertieft, wird immer deutlicher, dass Krankheiten, die bisher aufgrund morphologischer und immunphänotypischer Merkmale als einzelne Entitäten angesehen wurden, tatsächlich aus verschiedenen molekularen Subtypen bestehen, die molekulare Subtypisierungsassays erfordern. Infolgedessen sind hochempfindliche genomische Assays, die in der Lage sind, diese Subtypen zu erkennen, immer wichtigergeworden 2. Obwohl FFPE-Gewebe dafür bekannt sind, aufgrund von Fixationsproblemen schlecht mit genomischen Techniken kompatibel zu sein, werden diese Techniken mit der Weiterentwicklung von Technologie und Protokollen zunehmend kompatibel mit diesem klinisch allgegenwärtigen Gewebeformat 3,4,5. FFPE-Gewebe sind jedoch häufig Beimischungen von Tumor- und Nicht-Tumorgewebematerialien, bei denen das Vorhandensein von Nicht-Tumormaterial häufig unerwünscht ist und die Ergebnisse genomischer Analysen erheblich untergraben und beeinflussen kann, wenn sie in einem hohen Anteil vorhandensind 6. Tatsächlich wird für solche Analysen häufig ein Mindesttumorgehalt von 60% verwendet, bei denen Gewebe, die diesen Schwellenwert nicht erreichen, ausgeschlossen werden können, obwohl sie ansonsten die Studienkriterienerfüllen 7. Dies kann besonders in seltenen Krankheitssituationen problematisch sein, in denen Patientengewebe wertvoll und schwer in hoher Zahl zu sammeln ist.
Die Makrodissektion ist eine Methode, die die Auswirkungen eines niedrigen Tumorgehalts minimiert, indem sie die Menge an normalem Gewebereduziert 3. Die Entfernung von solchem störenden Nicht-Tumormaterial vor der Nukleinsäureextraktion kann den Tumorprozentgehalt und damit die Tumorreinheit der extrahierten Nukleinsäuren signifikant erhöhen. Die Geweberesektion stützt sich entscheidend auf eine pathologische Überprüfung durch Experten, bei der die Tumorregion von einem zertifizierten Pathologen identifiziert und auf einem frisch erzeugten Hämatoxylin und Eosin (H & E) -gefärbten Gewebeabschnitteingekreist wird 8. Das eingekreiste H & E wird dann verwendet, um die Entfernung und Sammlung von unerwünschtem bzw. Zielgewebe zu steuern. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der Makrodissektion von der pathologischen Überprüfung bis zur Gewebeentnahme, wie sie im AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory der Mayo Clinic durchgeführt werden.
Protocol
Alle Proben wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten IRB-Protokollen der Imsengco Clinic (PR16-000507 und PR2207-02) gesammelt und verwendet.
1. Probenvorbereitung
- Schalten Sie das Gewebeschwimmwasserbad ein. Stellen Sie die Temperatur auf 39 °C ein und lassen Sie das Wasser auf Temperatur kommen. Holzsammelstäbe im Wasserbad einweichen.
- Identifizieren und extrahieren Sie die FFPE-Gewebeblöcke, die geschnitten werden sollen.
- Pre-Label-Objektträger mit einem histologischen Permanentmarker, der Lösungsmittelwäschen standhält.
- Verwenden Sie ein Mikrotom, um die FFPE-Blöcke zu schneiden. Schneiden Sie mindestens 2 Vollflächenabschnitte mit einer Dicke von 4-5 μm pro Abschnitt für jeden Block (Abbildung 1A).
- Überführen Sie das frisch geschnittene Band der Gewebeabschnitte zur Schlittenmontage in das vorgewärmte Gewebeschwimmbad (Abbildung 1B, C).
HINWEIS: Das warme Wasser hilft, die Falten in den Abschnitten zu "bügeln" (Abbildung 1C). - Wenn Sie jeden Abschnitt nacheinander behandeln, verwenden Sie eine Pinzette, um einen einzelnen Abschnitt vom Menüband wegzubrechen (Abbildung 1D).
- Sammeln Sie den einzelnen Abschnitt auf einem vorbeschrifteten Objektträger.
- Tauchen Sie den Objektträger in einem Winkel unter den Abschnitt ein und positionieren Sie den Objektträger so, dass der Rand des Gewebeabschnitts den Objektträger berührt (Abbildung 1E).
- Sobald Sie mit dem Gewebeabschnitt in Berührung kommen, ziehen Sie den Objektträger langsam aus dem Schwimmbad, damit sich der Gewebeabschnitt bündig gegen den Objektträger richten kann, wenn er aus dem Wasser austritt (Abbildung 1F).
- Montieren Sie 1 Gewebeabschnitt pro Objektträger und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Abschnitte gesammelt sind.
- Lassen Sie die auf dem Objektträger montierten Gewebeabschnitte bei Raumtemperatur (RT) gründlich trocknen.
2. Pathologische Überprüfung
- Führen Sie eine H & E-Färbung auf einem repräsentativen Gewebeabschnitt für jeden Block9 durch.
- Reichen Sie die frisch gefärbten H & Es zur pathologischen Überprüfung durch einen Board-zertifizierten Pathologen ein.
HINWEIS: Während der Überprüfung bestimmt und zeichnet der Pathologe den prozentualen Tumorgehalt in jedem Gewebe auf und umkreist den Tumorbereich auf jedem H & E-Objektträger (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3, Zeile 1). Tabelle 1 zeigt den prozentualen Tumorgehalt nach Zellularität, der während der pathologischen Überprüfung der H&E für die in Abbildung 3, Zeile 1 gezeigten Proben A-E bestimmt wurde. Schnitte mit <60% Tumorgehalt erfordern eine Makrodissektion7. Die Anzahl der Abschnitte, die für die Nukleinsäureextraktion benötigt werden, hängt von der Größe der eingekreisten Tumorfläche ab. Wenn in Abschnitt 1 des Protokolls nicht genügend Abschnitte geschnitten wurden und weitere Schnitte möglich sind, müssen möglicherweise zusätzliche Abschnitte geschnitten werden.
3. Deparaffinisierung
- In einem Abzug füllen Sie zwei Glasfärbeschalen mit unverdünntem d-Limonen der Histologieklasse oder einem Lösungsmittel auf d-Limonenbasis und 1 Glasfärbeschale mit unverdünntem 200-prozentigem Ethanol in molekularer Qualität.
VORSICHT: Vermeiden Sie d-Limonen-Kontakt mit Haut und Augen, vermeiden Sie das Einatmen von Dampf oder Nebel und halten Sie sich von Zündquellen fern. Halten Sie Ethanol von Hitze, Funken und offenen Flammen fern, vermeiden Sie das Verschütten und den Kontakt mit der Haut oder den Augen, lüften Sie gut und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen.
HINWEIS: Füllen Sie das Geschirr ausreichend auf, um die abgesaugten Dias einzutauchen (Abbildung 4A); 250 ml werden benötigt, um die gezeigten 20-Dia-Färbeschüsseln zu füllen. Ersetzen Sie die d-Limonen- und Ethanolwäschen nach jeweils 40 Objektträgern. D-Limonen (C 10 H16) ist ein alternatives, ähnlich wirksames und weniger toxisches Entwachsmittel zu Xylol, das in histologischen Methoden immer alltäglicher wird und nach der Extraktion10,11,12,13,14 eine gute Qualität liefert. Obwohl dieses Protokoll mit biofreundlicheren Alternativendurchgeführt werden kann 15, müssen ihre Auswirkungen, falls vorhanden, auf die extrahierte Nukleinsäurequalität noch bestimmt werden. - Rack die unbefleckten FFPE-Gewebe montierten Gleitschienen in die Coplin Dia-Racks aus Glas (Abbildung 4A, Einschub).
- Tauchen Sie die abgesaugten Dias für 2 min in d-Limonenwaschen 1 ein; In den ersten 20 Jahren sanft rühren.
HINWEIS: Um die Verschleppung zwischen den Wäschen zu minimieren, lassen Sie das Rack beim Entfernen des Objektträgers aus einer Wäsche kurz abtropfen, bevor Sie den Boden des Racks vorsichtig auf Seidenpapier tupfen, um überschüssige Wäsche zu entfernen. - Tauchen Sie die abgesaugten Dias für 2 min in unverdünnte D-Limonen-Wäsche 2 ein; In den ersten 20 Jahren sanft rühren. Entfernen Sie, entleeren Sie das Rack und tupfen Sie es erneut ab.
- Tauchen Sie die abgesaugten Objektträger für 2 min in die Ethanolwäsche; In den ersten 20 Jahren sanft rühren. Entfernen Sie das Rack und legen Sie es auf ein saugfähiges Gewebe, um es abzulassen. Lassen Sie die Objektträger mindestens 10 min, aber nicht länger als 2 h an der Luft trocknen.
3. Makrodissektion
- Füllen Sie auf der Bank ein Coplin-Glas mit 50 ml 3% Glycerin in DNase/RNase-freiem Wasser vor
HINWEIS: Ersetzen Sie die Glycerinwäsche nach jeweils 40 Objektträgern. - Voretikettierung und Vorfüllung von 1,5 ml Mikroröhrchen mit 160 μL Gewebeaufschlusspuffer pro Mikroröhrchen.
HINWEIS: Nukleinsäureextraktionen, die nach der Makrodissektion durchgeführt wurden, verwendeten ein DNA / RNA FFPE-Extraktionskit (Tabelle der Materialien). Somit umfasste der in diesem Protokoll verwendete Gewebeverdauungspuffer 10 μL Proteinase K und 150 μL PKD-Puffer. - Verfolgen Sie die pathologischen Markierungen auf dem H & E auf die Rückseite der deparaffinisierten Gewebeobjektträger.
HINWEIS: Im Vergleich zu nicht deparaffinisierten Geweben (Abbildung 3, Zeile 2 und Abbildung 4B) sind deparaffinisierte Gewebe weiß und gut sichtbar (Abbildung 3, Zeile 3 und Abbildung 4C). Es ist diese erhöhte Sichtbarkeit und Erkennbarkeit von deparaffinisierten Gewebemerkmalen, die eine Makrodissektion ermöglichen. Legen Sie das H & E mit der Vorderseite nach unten auf die Bank und legen Sie die Vorderseite des deparaffinisierten Objektträgers gegen die Rückseite des passenden, von Pathologen überprüften H & E (Abbildung 4D). Richten Sie das deparaffinisierte Gewebe mit dem H&E-Gewebe aus (Abbildung 4E). Die Verfolgung der Markierungen des Pathologen ist ein kritischer Schritt im Makrodissektionsprozess, und es sollte darauf geachtet werden, diese Markierungen so genau wie möglich zu reproduzieren. Dies kann besonders für kleine und/oder nicht miteinander verbundene Gewebe wie die Proben B, D und E eine Herausforderung darstellen (Abbildung 3, Abbildung 4E und Abbildung 4E Inset i). Um die Rückverfolgung zu erleichtern, sollte man einen tintenfeinen oder ultrafeinen geknabberten Marker verwenden (Abbildung 4E, Inset ii), um die von Pathologen gezeichneten Markierungen zu verfolgen. Ethanol-Tücher können nützlich sein, um Fehler zu entfernen und bei Bedarf eine Rückverfolgung zu ermöglichen. - Drehen Sie das nun markierte deparaffinisierte Objektträgergewebe nach oben und zeichnen Sie die Linie des Markers mit der Ecke einer sauberen Rasierklinge nach, um die Kanten des Tumorbereichs vorzuschneiden.
- Behandeln Sie jeden Objektträger nacheinander, tauchen Sie die deparaffinisierten Objektträger in die 3% ige Glycerinlösung. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist, bevor Sie den Objektträger langsam entfernen (Abbildung 4F).
HINWEIS: Der Zweck des Glycerin-Dips besteht darin, das Gewebe zu dämpfen, um die Gewebeentnahme zu unterstützen, aber auch die Ansammlung statischer Aufladung zu reduzieren, die zu einer Abstoßung zwischen dem Gewebe und dem Kunststoffmikroröhrchen führen kann, in dem das gesammelte Gewebe platziert werden muss. - Wischen Sie vorsichtig die Rückseite des Objektträgers mit einem Taschentuch ab, um die überschüssige Glycerinlösung zu entfernen, und legen Sie den Objektträger mit der Seite nach unten auf die Bank. Lassen Sie das Gewebe 1-2 min kurz an der Luft trocknen.
HINWEIS: Die Übertragung von überschüssigem Glycerin in den Extraktionsprozess kann sich negativ auf die Ausbeute und Qualität von Nukleinsäureextraktionen auswirken. Taschentücher sollten leicht feucht, aber nicht sichtbar nass sein, wenn sie gesammelt werden. - Je nachdem, wo sich der interessierende Tumorbereich auf dem Objektträger befindet, verwenden Sie die flache Kante der Rasierklinge, um entweder (a) das Tumorgewebe direkt zu sammeln, indem Sie den Rasierer verwenden, um das interessierende Gewebe vom Objektträger zu kratzen / zu sammeln, oder (b) zuerst Nicht-Tumorgewebe zu entfernen und zu verwerfen, bevor Sie das interessierende Tumorgewebe sammeln (Abbildung 3).
HINWEIS: Gesammeltes Gewebe neigt dazu, sich an der Unterseite der Klinge zu sammeln oder aufzurollen (Abbildung 4G) - Entfernen Sie das gesammelte Gewebe mit einem Holzstab von der Klinge (Abbildung 4H und Einschub ) und geben Sie es in das entsprechende vorbeschriftete und vorgefüllte Mikroröhrchen (Abbildung 4I).
HINWEIS: Der Verdauungspuffer dient dazu, das Gewebe aus dem Holzmecker in die Flüssigkeit zu "ziehen". - Fahren Sie mit der Nukleinsäureextraktion fort.
HINWEIS: Nukleinsäureextraktionen wurden mit dem DNA/RNA FFPE-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, und die resultierenden Nukleinsäuren wurden mit einem UV-Vis-Spektralphotometer quantifiziert. Die resultierende RNA wurde auf dem digitalen Genexpressions-Profiling-basierten DLBCL90-Assay16 ausgeführt.
Representative Results
Insgesamt wurden 5 Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) FFPE-Gewebeblöcke geschnitten, und die resultierenden Abschnitte wurden vor der Nukleinsäureextraktion entweder makrodissektiert oder nicht. Die extrahierte RNA wurde auf dem DLBCL90-Assay16 ausgeführt. Makrodissektierte Proben wurden zweimal durchgeführt, einmal mit 5 μL RNA-Stammkonzentration, aber nicht mehr als 300 ng Gesamt-RNA-Input und einmal mit 5 μL RNA-Stock, der verdünnt wurde, um den RNA-Inputs ihrer jeweiligen nicht sezierten Gegenstücke zu entsprechen. Die DLBCL90-Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
DLBCL besteht aus 3 verschiedenen Subtypen der Ursprungszelle (COO) mit unterschiedlicher therapeutischer Reaktionsfähigkeit, nämlich GCB, ABC und einer Zwischengruppe, die als nicht klassifiziert oder UNC17,18 bekannt ist. Translokationen mit MYC, BCL2 und/oder BCL6 allein oder in Kombination (Doppel- oder Dreifachtreffer) werden ebenfalls häufig in DLBCL beobachtet, insbesondere im GCB-Subtyp19. Der DLBCL90-Assay ist eine Erweiterung seines Vorgängers, des klinischen Lymph2Cx-Assays, und ist daher in der Lage, DLBCL-COO-Subtypen zu bestimmen, wurde aber hauptsächlich entwickelt, um Proben zu identifizieren, die Doppelschlagtranslokationen (DH) mit BCL2 beherbergen, wobei die digitale Genexpression als Alternative zur Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet wird16,20. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass die Makrodissektion entweder den COO- oder den DHITsig-Status für 60% (3/5) der untersuchten Proben verändert hat.
Die Makrodissektion von Probe A hatte keinen Einfluss auf den COO-Aufruf, sondern änderte den DHITsig-Aufruf von NEG zu UNCLASS, und diese Veränderung wurde unabhängig vom makrodissektierten RNA-Input der Probe und mit ähnlichen Wahrscheinlichkeitswerten beobachtet (0,224, 0,254). Im Gegensatz dazu hatte die Makrodissektion von Stichprobe C keine Auswirkungen auf den DHITsig-Aufruf, sondern änderte den COO-Aufruf von GCB zu UNC. Auch diese Veränderung wurde unabhängig vom makrodissektierten RNA-Input der Probe beobachtet. Mit 0,117 lag die COO-Call-Wahrscheinlichkeit jedoch näher an der Call-Schwelle von 0,1 für die makrodissektierte Probe mit reduziertem RNA-Input. Ähnlich wie bei Beispiel A hatte die Makrodissektion von Stichprobe E keine Auswirkungen auf den COO-Anruf, änderte jedoch den DHITsig-Anruf. Für Probe E änderte sich der Aufruf jedoch von UNCLASS zu NEG und tat dies unabhängig vom makrodissektierten RNA-Eingang der Probe mit einigermaßen ähnlichen Wahrscheinlichkeitsaufrufen (0,849, 0,833). Insbesondere ist diese Rufänderung in DHITsig NEG biologisch sinnvoll, da Probe E zu ABC-DLBCL gefunden wurde und Doppeltreffertranslokationen mit BCL2 ausschließlich in GCB-DLBCL19 beobachtet wurden.
Abbildung 1: Erzeugen von Objektträger-montierten Gewebeschnitten mit einem Mikrotom . (A) FFPE-Gewebeblock, der vom Mikrotomfutter an Ort und Stelle gehalten und geschnitten wird, um ein Band aus sequentiellen FFPE-Gewebeschnitten zu erzeugen. (B) Mit vorgetränkten Holzstäbchen wird das Band aus dem Mikrotom gesammelt und in ein warmes Wasserbad überführt. (C) Die Wärme des Wassers hilft, die Falten im Gewebeband auszubügeln. (D) Einzelne FFPE-Gewebeschnitte werden aus dem Gewebeband entfernt, indem eine geschlossene Pinzette an der Verbindung zweier Abschnitte platziert und die Pinzette vorsichtig geöffnet wird, wodurch Abschnitte voneinander getrennt werden. (E) Die Abschnitte werden aus dem Wasser gesammelt, indem ein Glasobjektträger in einem Winkel getaucht wird und die Seite vorsichtig in Richtung des Gewebeabschnitts bewegt wird, bis der Rand des Abschnitts den Glasträger berührt. (F) Sobald sich der Objektträger und der Abschnitt berühren, entfernen Sie den Objektträger langsam aus dem Wasser, so dass der Gewebeabschnitt bündig gegen den Objektträger fallen kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Pathologie und histologische Überprüfung eines Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Abschnitts. (A,B) Der H&E-Gewebeschnitt wird einer mikroskopischen Überprüfung durch einen Board-zertifizierten Pathologen unterzogen. (C,D) Sobald der Pathologe das gesamte Gewebe untersucht und festgestellt hat, dass es sich nicht um 100% Tumorgewebe handelt, wird der Pathologe einen Marker verwenden, um den Tumorbereich des Gewebes zu umkreisen. (E,F) Das Halten des markierten H & E gegen den ursprünglichen FFPE-Gewebeblock zeigt, dass nicht das gesamte Gewebe Tumormaterial ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Gewebeproben. Dieses Bild zeigt die pathologisch überprüften und tumormarkierten H & Es (Zeile 1), unverarbeitete FFPE-Gewebeabschnitte auf Objektträgern (Zeile 2), deparaffinisierte FFPE-Gewebeabschnitte auf Objektträgern (Zeile 3), deparaffinisierte FFPE-Gewebeabschnitte mit Pathologiemarkierungen auf der Rückseite des Objektträgers (Zeile 4), deparaffinisierte und makrodissektierte FFPE-Gewebeabschnitte auf Objektträgern (Zeile 5) für die 5 Proben (A-E), die zur Demonstration dieses Protokolls verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Deparaffinisierung und Makrodissektion von FFPE-Gewebeschnitten: (A) In einem Abzug werden FFPE-Gewebe, die in einem Schieber montiert sind, in zwei d-Limonen-Waschungen und einer Ethanolwäsche gewaschen. (B,C) Nach dem Waschen wurde das gesamte Paraffin entfernt, und nur das Gewebe verbleibt auf dem Objektträger, der jetzt weiß und im Vergleich zu seinem vorgewaschenen Gegenstück gut sichtbar ist. (D) Der deparaffinisierte, auf dem Objektträger montierte Gewebeabschnitt wird mit der Vorderseite nach unten auf der Rückseite seines passenden markierten H & E platziert. (E) Die Tumorbereichsmarkierungen auf dem H & E werden dann auf der Rückseite des deparaffinisierten Objektträgers mit einem feinen oder ultrafeinen geknabberten Permanentmarker verfolgt (F) Der markierte deparaffinisierte Objektträger montierte Gewebeabschnitt wird dann in eine Glycerinwäsche getaucht, um den Gewebeabschnitt zur Entnahme zu befeuchten. Der Objektträger wird langsam vom Glycerin entfernt, und die Rückseite des Objektträgers wird mit einem Gewebe abgewischt, um überschüssiges Glycerin zu entfernen, bevor das Objektträgergewebe mit dem Gesicht nach oben auf die Bank gelegt wird. (G) Mit der flachen Seite einer sauberen Rasierklinge wird das Gewebe makrodissektiert, und das unerwünschte Gewebe außerhalb der pathologischen Markierungen wird verworfen, bevor das Gewebe von Interesse gesammelt wird, das sich entlang der Kante der Klinge sammelt. (H) Ein Holzstab wird verwendet, um das gesammelte Gewebe vom Rand der Klinge zu entfernen. (I) Das Gewebe wird dann in einen vormarkierten mikroröhrchengefüllten Gewebeaufschlusspuffer überführt und ist bereit für die Nukleinsäureextraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Beispiel-ID | Ganzes Gewebe (a) | Kreisförmige Gewebefläche (b) | Gesamttumorgehalt des gesamten Gewebes (c) | Faltenerhöhung des Tumorgehalts durch Makrodissektion (d) | Nicht makrodissektiert (e) | Makrodissektiert (f) | ||||
| % Lebensfähiger Tumor | % Sonstige | % Lebensfähiger Tumor | % Sonstige | # von 5 μm Objektträgern extrahiert | RNA conc (ng/μL) | # von 5 μm Objektträgern extrahiert | RNA conc (ng/μL) |
|||
| Beispiel A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Beispiel B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Beispiel C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Beispiel D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Beispiel E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tabelle 1: Pathologie-Review-Daten. Die Tabelle zeigt (a) den Prozentsatz des lebensfähigen Tumors im gesamten Gewebe abschnittsweise nach Gebieten, (b) den Prozentsatz des lebensfähigen Tumors in dem Bereich, der vom Pathologen während der Überprüfung nach Zellularität eingekreist/markiert wurde, (c) die geschätzte Gesamtzellularität des Tumors des gesamten Gewebes (a x b), (d) die geschätzte Zunahme der Tumorzellularität, die mit der Makrodissektion erreicht wurde, (e und f) die Anzahl der extrahierten 5 μm unbefleckten FFPE-Objektträger-Gewebeschnitte und die resultierenden RNA-Konzentrationen für übereinstimmende nicht-makrodissektierte und makrodissektierte Proben. % Sonstiges bezieht sich auf alle anderen Gewebe, die in einer bestimmten Probe vorhanden sind, die kein Tumorgewebe sind und Bindegewebe, Stromafibroblasten, Blutgefäße sowie andere inhärente Stromaelemente umfassen können. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
| Beispiel-ID | RNA-Input (ng) | DLBCL90 COO-Anruf | DLBCL90-Anrufwahrscheinlichkeit | DHITsig-Anruf | DHITsig pos Wahrscheinlichkeit | DHITsig neg Wahrscheinlichkeit | |
| Nicht makroseziert | Beispiel A | 95.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.135 | 0.865 |
| Beispiel B | 170.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.032 | 0.968 | |
| Beispiel C | 68.5 | Gcb | 0.028 | Neg | 0.033 | 0.967 | |
| Beispiel D | 286.5 | ABC | 0.998 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Beispiel E | 126.0 | ABC | 0.989 | UNKLASSE | 0.212 | 0.788 | |
| Makrodissektiert | Beispiel-A_M | 291.7 | Gcb | 0.000 | UNKLASSE | 0.224 | 0.776 |
| Beispiel B_M | 300.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.016 | 0.984 | |
| Beispiel C_M | 231.2 | UNKLASSE | 0.210 | Neg | 0.015 | 0.985 | |
| Beispiel D_M | 300.0 | ABC | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Beispiel-E_M | 223.2 | ABC | 0.987 | Neg | 0.151 | 0.849 | |
| Makrodissektiert & RNA verdünnt | Beispiel-A_M | 95.0 | Gcb | 0.000 | UNKLASSE | 0.254 | 0.746 |
| Beispiel B_M | 170.0 | Gcb | 0.000 | Neg | 0.023 | 0.977 | |
| Beispiel C_M | 68.5 | UNKLASSE | 0.117 | Neg | 0.027 | 0.973 | |
| Beispiel D_M | 286.5 | ABC | 0.999 | Neg | 0.002 | 0.998 | |
| Beispiel-E_M | 126.0 | ABC | 0.995 | Neg | 0.167 | 0.833 | |
Tabelle 2: Ergebnisse des digitalen DLBCL90-Genexpressionsassays. Fünf Proben (A-E) wurden entweder nicht makrodissektiert oder makrodissektiert, bevor Nukleinsäureextraktionen durchgeführt wurden. Die resultierende RNA wurde auf dem DLBCL90-Assay ausgeführt, für den das maximale RNA-Eingangsvolumen 5 μL beträgt. Nicht-makrodissektierte Proben wurden mit 5 μL Stamm-RNA durchgeführt. Jede makrodissektierte Probe wurde zweimal mit (a) 5 μL Stamm-RNA durchgeführt, es sei denn, Aliquots von 60 ng/μL waren möglich und (b) 5 μL Stamm-RNA verdünnt, um den Konzentrationen/dem Input ihrer nicht-makrodissektierten Gegenstücke zu entsprechen. Das Suffix _M bedeutet, dass diese Probe makrodissektiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
FFPE-Gewebe sind häufig heterogene Beimischungen von Tumor- und Nicht-Tumorgeweben. Hochempfindliche genomische Tests werden sowohl in klinischen als auch in Forschungsumgebungen immer häufiger, können jedoch durch das Vorhandensein von kontaminierendem Nicht-Tumorgewebe verwirrt werden. Tatsächlich wird für genomische Studien häufig ein Mindesttumorgehalt von 60% empfohlen. Der prozentuale Tumor kann durch die Gewebefläche, die vom Tumormaterial besetzt ist, oder durch den Anteil der Tumorzellen innerhalb des Gewebes bestimmt werden. Obwohl Tumor nach Fläche eine häufig verwendete Metrik für die Tumorreinheit ist, zeigt sie nicht immer eine genaue Beschreibung des Gewebes. Betrachten Sie zwei Gewebe, beide mit 1000 Zellen, von denen 500 Tumorzellen sind. Im Gewebe A sind die 500 Nicht-Tumorzellen Stromazellen mit ähnlichen Volumina wie die Tumorzelle. In diesem Gewebe kann der Prozentsatz des Tumors sowohl nach Zellularität als auch nach Fläche als 50% angesehen werden. Im Gewebe B sind die 500 Nicht-Tumorzellen Fettzellen mit Volumina, die 4x so groß sind wie die der Tumorzelle. In diesem Gewebe beträgt der prozentuale Tumor immer noch 50% nach Zellularität, aber 20% nach Fläche. Ein drittes Gewebe, Gewebe C, besteht aus 500 Tumorzellen plus 400 Fettzellen und 800 Stromazellen mit Volumina, die 4x bzw. 0,5x so groß sind wie das der Tumorzellen. Bei 100 Fettzellen, die dem Volumen von 800 Stromazellen entsprechen, beträgt der prozentuale Tumor des Gewebes C 29% nach Zellularität (500/1700), aber immer noch 20% nach Fläche. Gewebe D besteht auch aus Tumor-, Fett- und Stromazellen mit Volumenverhältnissen von 1x, 4x und 0,1x. Die Anzahl der Zellen beträgt jedoch 400, 10 bzw. 720. Somit beträgt der prozentuale Tumor von Gewebe D 35% nach Zellularität (400/1130), aber 78% nach Fläche. Diese Beispiele sind zu einfach und spiegeln keine realen Gewebezusammensetzungen wider, sondern vermitteln deutlich die Bedeutung der Gewebezusammensetzung und den Unterschied zwischen Tumorgehalt nach Fläche und Zellularität. Wenn es um die Anreicherung des Tumorgehalts für die nachgeschaltete Nukleinsäureextraktion geht, ist die Tumorzellularität aufgrund des erhöhten Störpotenzials der Extraktion von genomischem Material aus mehr Nicht-Tumorzellen als Tumorzellen das wichtigere Attribut. Dies unterstreicht nicht nur die Notwendigkeit, den Tumorgehalt von Geweben in Bezug auf die prozentuale Zellularität zu bewerten, sondern auch die Notwendigkeit, unerwünschtes Gewebe zu entfernen, um mögliche negative Auswirkungen des Nicht-Tumorgewebes zu minimieren. Es gibt mehrere Methoden zur Gewebeanreicherung, wobei die wichtigsten Makrodissektion und Mikrodissektion sind.
Die Makrodissektion, die in diesem Protokoll beschriebene Methode, ist relativ schnell, einfach und erfordert keine kostspielige oder spezielle Ausrüstung. Obwohl die Makrodissektion den Tumorgehalt stark verbessern kann, ist es wichtig zu verstehen, dass sie Nicht-Tumormaterial nicht vollständig eliminiert. Der Zweck der Makrodissektion besteht darin, das interessierende Gewebe durch den Ausschluss von unerwünschtem Gewebe ausreichend anzureichern, um das von unerwünschtem Gewebe ausgehende "Rauschen" zu reduzieren, was wiederum das Signal des Interesses des interessierenden Gewebes verstärken kann. Daher ist die makrodissektionsvermittelte Tumoranreicherung eine Möglichkeit, das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, um Marker von Interesse besser zu erkennen, insbesondere tumorspezifische molekulare Marker mit geringer Häufigkeit oder schlechter Expression. Die Makrodissektion hat jedoch Einschränkungen aufgrund der mangelnden Präzision, die grobe Werkzeuge wie Rasierklingen bieten, und ist anfällig für Präzisionsprobleme, die sich aus der Linienstärke des Markers des Pathologen ergeben, sowie für mögliche Fehler bei der Verfolgung der H & E-Abgrenzungen der Pathologen. Wie oben angedeutet, ist es nicht möglich, eine 100%ige Tumorreinheit zu erreichen, da inhärente und tumorinduzierende Stromaelemente (dh Bindegewebe, Stromafibroblasten, Blutgefäße, gutartige reaktive Lymphozyten, Makrophagen), die in den Tumor selbst eingebettet sind, vorhanden sind. Tatsächlich induzieren viele invasive oder diffus infiltrative Malignome eine robuste desmoplastische Stromareaktion, was zu Clustern von Tumorzellen führt, die eng mit stromalen Fibroblasten und anderen nicht-neoplastischen Zelltypen vermischt sind; wo Tumore, die mit diesem stromalen Reaktionsmuster assoziiert sind, wie Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe21, mehr von digital geführter Mikrodissektion als von manueller Makrodissektion profitieren können.
Die manuelle Mikrodissektion wird unter einem Mikroskop durchgeführt, um die Identifizierung, Dissektion und Isolierung von gewebespezifischen Zellen oder Populationen mit einer Nadel oder einem Skalpell zu unterstützen, und hat den Vorteil einer erhöhten Präzision gegenüber der Makrodissektion22. Die manuelle Mikrodissektion ist jedoch ein mühsamer Prozess, dem die für komplexe Gewebe mit niedrigem Tumorgehalt oder komplizierten Merkmalen, die mit der manuellen Dissektion nicht kompatibel sind, erforderliche Finesse fehlt. Solche Gewebe können mit hochpräzisen automatisierten Methoden wie der Laser-Capture-Mikrodissektion seziert werden. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die digital geführte Mikrodissektion im Vergleich zur manuellen Makrodissektion in Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe einen höheren prozentualen Tumorgehalt liefert23. Die Nachteile dieser hochpräzisen automatisierten Methoden, wie der Bedarf an spezialisierten, teuren Geräten und gut ausgebildeten Personen, haben jedoch die Integration in Arbeitsabläufe behindert. Eine Studie von de Bruin et al., in der die Auswirkungen von Makrodissektion und Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) auf die Genexpressionsprofilierung verglichen wurden, ergab, dass LCM-Proben niedrige Gesamt-RNA-Ausbeuten (30 ng-Durchschnitt) aufwiesen und zwei Runden mRNA-Amplifikation erforderten, um die cDNA-Bibliotheksvorbereitungs-Eingangsschwelle24 zu erreichen. Die Autoren fanden heraus, dass die resultierenden LCM-Genexpressionsprofile von den Runden der mRNA-Amplifikation stärker beeinflusst wurden als makrodissektierte Profile von Nicht-Tumorstroma-Beiträgen betroffen waren, und folgerten, dass die Makrodissektion angemessen genutzt werden könnte, um zuverlässige Genexpressionsdatenzu generieren 24.
Ein wesentlicher Vorteil der digitalen Genexpressionsprofilierung von NanoString, insbesondere bei der Arbeit mit hochgradig abgebauter FFPE-abgeleiteter RNA, besteht darin, dass keine enzymatisch abhängigen Prozesse wie RNA-Amplifikation oder Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken erforderlich sind. Assays sind jedoch typischerweise für Inputs zwischen 50-300 ng der Gesamt-RNA 25,26 optimiert, die auf der Grundlage der Ergebnisse von de Bruin et al.24 möglicherweise nicht mit mikrodissektiertem Gewebe kompatibel sind, ohne den Gewebeeintrag zu erhöhen; Eine ungünstige Nachfrage in einer Zeit, in der Gewebeproben zunehmend als kleine Biopsien und nicht als chirurgische Resektionen gesammelt werden. Die für den DLBCL90-Assay verwendeten RNA-Inputs reichten von 68,5 bis 300 ng sowohl für das makrodissektierte als auch für das nicht dissektierte Gewebe. Die Ergebnisse zeigen, dass die Makrodissektion bei 60% der untersuchten Proben zu Aufrufänderungen führte und dass diese Veränderungen unabhängig vom RNA-Input der makrodissektierten Proben beobachtet wurden. Die COO-Wahrscheinlichkeit für den niedrigen RNA-Eingang hat jedoch die COO GCB/UNC-Wahrscheinlichkeitsschwelle überschritten, wo die Schwellenwerte 0 bis <0,1 für GCB, 0,1-0,9 für UNC und >0,9 bis 1,0 für ABC-Anrufe20 sind. Die wichtigsten DLBCL-COO-Subtypen sind GCB und ABC, die 41% und 44% aller DLBCL-Fälle ausmachen, wobei UNC eine Zwischengruppe der beiden und ABC die aggressivsten20,27 darstellt. Während also die Änderung des COO-Aufrufs bei der Makrodissektion von Stichprobe C keine offene Änderung des COO-Subtyps von GCB zu ABC verursachte, kann der Wechsel von GCB zu UNC auf eine Verschiebung hin zu einer aggressiveren Krankheit hindeuten. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass der UNC-Subtyp nicht einfach nur ein Zwischensubtyp ist und dass er potenziell subtypspezifische therapeutisch nutzbare Eigenschaften besitzenkann 28. In ähnlicher Weise verursachte die Makrodissektion der Proben A und E keine offenen Änderungen der DHITsig-Aufrufe von DH negativ zu DH positiv oder umgekehrt. Die Bewegungen einer GCB-Probe (Probe A) von NEG nach UNCLASS und einer ABC-Probe (Probe E) von UNCLASS zu NEG bei Makrodissektion sind jedoch biologisch angemessen, da berichtet wird, dass Doppelschlagtranslokationen mit BCL2 ausschließlich ein GCB-Phänomensind 19. Obwohl Translokationen traditionell und allgegenwärtig von FISH in klinischen Umgebungen nachgewiesen werden, gibt es eine wachsende Dynamik, eine alternative, weniger komplizierte und zeitaufwändige Methode für ihre Erkennung zu identifizieren. Der DLBCL90-Assay ist ein wichtiges Instrument, das diesem Bedarf gerecht wird, wobei die Begründung für seine Verwendung durch die Feststellung gestärkt wird, dass dieser Assay in der Lage ist, kryptische Translokationen zu FISH-Sonden zu erkennen, die in der klinischen Diagnostik verwendet werden29.
Das oben beschriebene Makrodissektionsprotokoll skizziert eine einfache Methode, die es Forschern ermöglicht, den Tumorgehalt von Gewebeproben zu erhöhen, die normalerweise unter die üblicherweise verwendeten Grenzwerte für Studieneinschlusskriterien fallen würden. Die Einbeziehung der Makrodissektion in einen Studien-Workflow ermöglicht es Forschern, schlecht tumordichtes Gewebe aus dem Studienausschluss zu retten, indem sie ihren Tumorgehalt erhöhen. Dies wiederum ermöglicht ein erhöhtes Vertrauen, dass die resultierenden RNA- und DNA-Eluate den Tumor darstellen, der genomisch untersucht wird. Obwohl es andere präzisere Methoden für die Gewebedissektion gibt, ist die Makrodissektion für Tumore, die expansivere, nicht infiltrative, blattartiger oder fester wachsen, wahrscheinlich ausreichend. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Tumorreinheit in genomischen Assays und der Makrodissektion als zuverlässiges Werkzeug, um dies zu erreichen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der NIH-finanzierten AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) im Rahmen ihres Bioproben-Wissenschaftsprogramms unterstützt. Das Video wurde gefilmt und der Postproduktionsschnitt wurde von Mayo Clinic Media Services durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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