Summary
Este protocolo presenta un nuevo sistema de genes reporteros y la configuración experimental para detectar la transcripción en roturas de doble cadena de ADN con sensibilidad de molécula única.
Abstract
Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son el tipo más grave de daño en el ADN. A pesar de las consecuencias catastróficas en la integridad del genoma, sigue siendo hasta ahora difícil de alcanzar cómo los DSB afectan la transcripción. Una razón para esto fue la falta de herramientas adecuadas para monitorear simultáneamente la transcripción y la inducción de un DSB génico con suficiente resolución temporal y espacial. Este trabajo describe un conjunto de nuevos reporteros que visualizan directamente la transcripción en células vivas inmediatamente después de la inducción de un DSB en la plantilla de ADN. Los bucles de tallo de ARN de bacteriófagos se emplean para monitorear la transcripción con sensibilidad de una sola molécula. Para dirigir el DSB a una región genética específica, los genes reporteros están diseñados para contener una sola secuencia de reconocimiento de la endonucleasa homing I-SceI, de lo contrario ausente del genoma humano. Una sola copia de cada gen reportero se integró en el genoma de las líneas celulares humanas. Este sistema experimental permite la detección de moléculas individuales de ARN generadas por la transcripción de genes canónicos o por la iniciación de la transcripción inducida por rotura de ADN. Estos reporteros brindan una oportunidad sin precedentes para interpretar las interacciones recíprocas entre la transcripción y el daño al ADN y para revelar aspectos hasta ahora no apreciados de la transcripción inducida por la ruptura del ADN.
Introduction
Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son lesiones tóxicas del ADN que alteran la función celular y contribuyen a la insurgencia de varias enfermedades y al envejecimiento1. Las mutaciones resultantes de la reparación inexacta de los DSB afectan la expresión génica y establecen las bases para el declive funcional de la célula. La visión emergente de que los DSB impulsan la transcripción inducida por ruptura de novo en el sitio de la lesión2,3,4,5,6,7 sugiere que los DSB también pueden afectar la función celular a través de ARN inducidos por rotura. Varios estudios recientes indican que los DSB son suficientes para iniciar la transcripción programada (por ejemplo, en genes inducibles por estímulos) y no programada (por ejemplo, en promotores no canónicos)4,5,7. Sin embargo, a pesar de varios estudios que exploran los vínculos entre el daño del ADN y la transcripción, el campo todavía se retrasó en su capacidad para ofrecer una caracterización precisa (es decir, de una sola molécula) de los eventos transcripcionales en los sitios de ruptura del ADN. Una razón importante para esto fue la falta de herramientas experimentales apropiadas. La irradiación celular (rayos γ, rayos X, iones pesados) y los tratamientos farmacológicos (por ejemplo, inhibidores de la topoisomerasa o agentes intercalantes) carecen de precisión espacial e inducen lesiones de ADN distintas de los DSB, incluidas las roturas de una sola cadena y los aductos de ADN8. Las endonucleasas, como I-PpoI y AsiSI, generan DSB específicos de locus, pero no se han combinado con un sistema que permita la visualización simultánea de la transcripción en células vivas en un solo locus con alta precisión temporal8. Para evitar esta limitación, nuestro laboratorio encabezó el desarrollo de un conjunto de reporteros de vanguardia que visualizan directamente la transcripción con resolución de una sola molécula tras la inducción controlada de un DSB4 único. Aquí, describimos a estos reporteros, proporcionamos un protocolo detallado para imágenes de células vivas de la transcripción en DSB y mostramos datos que revelan el inicio de la transcripción en un solo DSB.
Los sistemas de genes reporteros utilizados en este protocolo se basan en el bien caracterizado gen reportero IgM de ratón y contienen los exones M1 y M2 de la forma unida a la membrana (μm) de la cadena pesada IgM μ 9,10,11. Un intrón híbrido separa los dos exones con el fuerte adenovirus de transcripción tardía mayor (AdML) py tract12. La expresión de los genes reporteros está controlada por el promotor del citomegalovirus humano (CMV), en el que se han insertado dos copias en tándem de la secuencia del operador de Tet (TetO). Los genes reporteros se insertan en un vector plásmido que contiene un sitio Flp Recombination Target (FRT) y se insertan en un sitio objetivo ESPECÍFICO de FRT en el genoma de una línea celular huésped HEK293. Esta línea celular también expresa constitutivamente la proteína represora Tet para regular la expresión del gen reportero a través de la presencia o ausencia de tetraciclina/doxiciclina. Para permitir la visualización de la transcripción del gen reportero, se insertaron 24 repeticiones en tándem de la secuencia del bucle del tallo MS2 y 24 repeticiones en tándem de la secuencia del bucle del tallo PP7 en diferentes posiciones con respecto al sitio de inicio de la transcripción y la estructura del exón/intrón del gen reportero. Los bucles del tallo de ARN MS2/PP7 se forman tras la transcripción y se unen específicamente a proteínas de la capa MS2/PP7 expresadas ectópicamente marcadas con proteínas fluorescentes verdes y rojas, una estrategia ampliamente utilizada antes para la transcripción de imágenes13,14,15. Además, se insertó una sola copia de la secuencia de reconocimiento de 18 pb para la endonucleasa homing I-SceI que está flanqueada directamente por las matrices de secuencia de arn stem-loop en los genes reporteros. Se utilizaron técnicas de clonación estándar para generar todos los plásmidos, el fragmento que contiene el bucle de tallo I-SceI-24xMS2 del gen reportero PROP fue sintetizado por un servicio comercial de síntesis de genes.
El gen promotor-proximal DSB reporter (PROP) se construyó insertando el sitio de corte I-SceI 45 pares de bases (pb) aguas abajo del supuesto sitio de inicio de la transcripción en el exón I, seguido de 149 pb hasta el inicio del cassette 24x MS2 stem-loop, que fue diseñado de novo con dos secuencias alternas no idénticas stem-loop16 y cinco secuencias de espaciadores no repetitivas de 20 pb para reducir la redundancia. La matriz de bucle de vástago MS2 es seguida por 72 pb hasta el comienzo del intrón de 1844 pb y el exón II de 1085 pb hasta el sitio de escisión y poliadenilación. El exón II codifica una proteína fluorescente cian (CFP) fusionada a una secuencia de orientación peroxisomal C-terminal (PTS) de la acil CoA oxidasa peroxisomal humana para permitir un cribado independiente de la expresión génica del reportero (Figura 1A).
El gen reportero DSB exon II (EX2) consiste en un exón I de 167 pb seguido del intrón y el exón II que codifica el CFP-PTS. Más abajo, a una distancia de 169 pb, se insertó un casete que contenía 24 bucles de vástago MS2, seguido de una secuencia de enlazador de 84 pb con un sitio I-SceI en el centro, seguido de 24 bucles de vástago PP7 y 221 pb hasta el sitio de escisión y poliadenilación17 (Figura 1B).
Por último, el gen reportero DSB exon II con etiquetado de transcripción antisentido (EX2AS) se basa en la transcripción del gen de la ubiquitina B humana (UBB) UBB-201 y contiene dos exones y un intrón. El exón I tiene una longitud total de 1534 pb con una inserción inversa de la secuencia de bucle de tallo MS2 24x. Por lo tanto, la secuencia correcta de ARN del bucle del tallo MS2 se transcribirá en una dirección antisentido con respecto a la transcripción sensorial del gen reportero del promotor del CMV. El intrón tiene una longitud de 490 pb, seguido del exón II con el sitio I-SceI , y se insertó una región codificante para dos subunidades de ubiquitina en el marco. Aguas abajo del gen UBB hay una secuencia que forma un bucle de tallo PP7 24x tras la transcripción del gen reportero en una dirección sensorial (Figura 1C).
La transfección transitoria de un constructo inducible de la endonucleasa I-SceI permite la creación controlada de un DSB en el sitio de reconocimiento insertado dentro de cada gen reportero18. La endonucleasa I-SceI se fusiona en marco con el dominio de unión al ligando del receptor glucocorticoide y una proteína fluorescente de color rojo lejano iRFP713. Este constructo es citoplasmático en ausencia de acetónido de triamcinolona (TA), pero migra rápidamente al núcleo tras la adición de TA al medio de crecimiento de las células (Figura 1D). La inducción de DSB por el sistema I-SceI es robusta, como se demostró antes18,19,20. La transcripción del gen reportero se puede monitorear en paralelo visualizando los sistemas de asa madre de ARN marcados fluorescentemente MS2 y PP7.
Protocol
1. Preparación y transfección de células para microscopía de células vivas
- Preparar un matraz de cultivo celular de 25 cm2 de la línea celular reportera (EX2, EX2-AS o PROM) con 5 ml de DMEM para lograr una confluencia del 80-90% el día anterior al experimento de microscopía de células vivas.
- Aspire el medio con una pipeta del matraz de cultivo celular de 25 cm2 y lave las células con 2,5 ml de 1x PBS.
- Añadir 1 ml de tripsina-EDTA (0,05%) e incubar a 37 °C durante 2-3 min para el desprendimiento celular.
- Después del desprendimiento celular, agregue 4 ml de DMEM sin rojo fenol que contenga tampón HEPES, complementado con suero bovino fetal sin carbón al 10% (v / v), y resuspenda suavemente las células.
- Placa 1 mL de la solución celular en un plato redondo de 35 mm con pozo de fondo de vidrio de 10 mm (diámetro No. 1.5) y homogeneizar. Almacene el plato redondo de 35 mm dentro de un plato de cultivo celular estándar de 100 mm e incube a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.
- ~ 6 h después de la siembra, transfecte las células en el plato con fondo de vidrio. Para cada mezcla de transfección, prepare dos soluciones de la siguiente manera:
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar la solución A que contenga 150 μL de medio esencial mínimo (MEM) sérico reducido, ADN plásmido (como se describe en la Tabla 1) y 2,5 μg/μL de ADN del reactivo auxiliar de transfección (ver Tabla de Materiales).
- Paralelamente, preparar la solución B, que contiene 150 μL de MEM sérico reducido y 1,5 μg/μL de ADN de un reactivo de transfección a base de lípidos (ver Tabla de Materiales).
- Incubar ambas soluciones a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Luego, agregue suavemente la solución A a la solución B e incube 20 min a RT.
- Para transfectar las células, agregue 300 μL de solución A + B gota a gota a gota a cada plato y distribuya suavemente. Almacene el plato con fondo de vidrio dentro de un plato de cultivo celular estándar de 100 mm e incube a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2.
- Prepare un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 200 μL de DMEM con HEPES, sin rojo fenol suplementado con suero bovino fetal al 10% (v / v) despojado de carbón y agregue TA a una concentración de 7.5 x 10-7 M.
2. Configuración experimental
- Ajuste la temperatura de la cámara de incubación del microscopio de plexiglás grande y la cámara de incubación de la etapa superior a 37 ° C en la unidad de control común. Ajuste las condiciones ambientales dentro de la cámara de incubación de la etapa a 5% de CO2 y 100% de humedad.
NOTA: La temperatura de la jaula del microscopio y la incubadora de la etapa deben configurarse al menos 1 h antes de comenzar el experimento para permitir el calentamiento del sistema completo para minimizar las fluctuaciones de temperatura. Inicie todas las demás unidades de control y operación del microscopio al mismo tiempo. - Inducir la transcripción de los genes reporteros añadiendo doxiciclina (0,5 μg/mL) al medio de crecimiento y mezclar suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta de 200 μL ~1 h antes de iniciar la observación microscopía.
NOTA: Mantenga el plato con fondo de vidrio con las células transfectadas dentro de un plato de cultivo celular estándar de 100 mm para facilitar el manejo y el transporte desde el cultivo celular hasta la sala de microscopios en un recipiente de espuma de poliestireno para mantener la temperatura lo más estable posible. - Transporte las células al microscopio al menos 30 minutos antes de comenzar la observación y, a su llegada, coloque el plato de 100 mm con las células inmediatamente dentro de la cámara de incubación del microscopio grande precalentada.
- Coloque el tubo de la microcentrífuga con la TA preluida del paso 1.7. dentro de la gran cámara ambiental del microscopio para calentar hasta 37 °C.
- Reemplace la tapa del plato con fondo de vidrio similar a la preparada anteriormente con un orificio de 3 mm de diámetro perforado en la tapa (Figura 2A).
NOTA: El TA se agregará más tarde a las células a través del pequeño orificio en la tapa sin manipular el plato montado en el escenario del microscopio. - Seleccione el objetivo de inmersión en aceite 100x (objetivo apocromático, apertura numérica 1,4) en el panel de control del microscopio. Aplicar una gota de aceite de inmersión al objetivo.
- Coloque el plato con fondo de vidrio con las células dentro de la cámara de incubación de la etapa del microscopio y enciérrelo en su lugar. Cierre la tapa de la incubadora de escenario y todas las puertas de la carcasa del microscopio.
- Inicie el software de operación y control del microscopio, abra la ventana Control de enfoque (Figura 2B), haga clic en el panel Alcance y, en el panel Selección de emisión , haga clic en el cuadro 100% Ojo para establecer la trayectoria del haz ocular para la observación directa de la muestra a ojo.
- En el menú Conjunto de filtros , cambie al conjunto de filtros oculares y haga clic en Campo brillante y pulse el botón Abrir campo brillante .
- Mueva el objetivo del microscopio hacia el plato con fondo de vidrio hasta que el aceite toque el vidrio. Luego mire a través de los oculares y concéntrese manualmente en el plano de las células. Apague el botón Abrir campo brillante .
- Deje las células durante 30 minutos antes de comenzar las observaciones experimentales para adaptarse a las condiciones ambientales y evitar la deriva focal durante la obtención de imágenes por gradientes de temperatura.
- Coloque una micropipeta de 200 μL y puntas de filtro de 200 μL listas para usar a un lado a temperatura ambiente.
3. Adquisición de imágenes
- En la ventana Control de enfoque del software de control del microscopio, establezca la intensidad del láser en 5% e introduzca un valor de 50 ms para el tiempo de exposición (Figura 2B).
- Abra la ventana Captura para ajustar la configuración para realizar una adquisición automatizada de imágenes de lapsos de tiempo tridimensionales (3D) (Figura 2C).
- Seleccione el tipo de adquisición de captura 3D y establezca de 12 a 16 cortes ópticos separados por 0,4 μm, marque las casillas de verificación de Rango alrededor de la corriente y Volver a la posición actual después de la captura.
- En el panel Captura de lapso de tiempo , especifique un valor de 120 para el número de puntos de tiempo y 30 s para el intervalo.
- Seleccione el conjunto de filtros confocales de acuerdo con las etiquetas de proteínas fluorescentes transfectadas con λ = 488 nm para GFP, λ = 561 nm para TagRFPt y λ = 640 nm para iRFP713 y establezca el tiempo de exposición para cada canal en 50 ms.
- Utilice la configuración Corriente para la potencia del láser para utilizar el valor del 5% seleccionado en la ventana de enfoque (figura 2C).
- En la ventana Control de enfoque , vaya al panel Cámara , seleccione el control de visualización de imagen Escala y elija el botón Manual para configurar un rango fijo de intensidades de imagen que se mostrará. Introduzca los valores de Bajo: 500 y Alto: 5000 (consulte la Figura 2B).
NOTA: Esta configuración limita el rango dinámico de la captura de la cámara que se muestra en la vista en vivo para seleccionar celdas dentro del mismo rango de intensidades de fluorescencia (Figura 2D). - Seleccione las células para la imagen de lapso de tiempo 3D de los sitios de transcripción tras la inducción de un DSB. Examine las celdas y seleccione tres campos de visión de acuerdo con las condiciones descritas en la Discusión.
- Enfoque cada celda seleccionada previamente ubicada en el centro del campo de visión con el sitio de transcripción en el plano medio de la pila Z.
NOTA: Centrar la célula y el sitio de transcripción en XYZ se adapta a algún movimiento de la célula. - Marque cada posición XYZ en el panel XY de la ventana Control de enfoque haciendo clic en Establecer punto.
NOTA: Vuelva a visitar las posiciones seleccionadas 2-3 veces durante los siguientes 5 minutos para confirmar la transcripción continua de los genes reporteros y la estabilidad posicional relativa de las posiciones de las células en dimensiones XYZ. - Añadir 200 μL de la AT prediluida a partir del paso 1.7. a las celdas como se muestra en la Figura 2F.
NOTA: Tenga mucho cuidado de no tocar el plato con fondo de vidrio o la tapa mientras agrega el TA para evitar cualquier cambio de las posiciones XY marcadas. Después de la inducción de DSB, confirme que las células están centradas dentro del campo de visión y que el sitio de transcripción está en el plano Z central. El reenfoque y la actualización de la posición no deben tomar más de 1-2 minutos. - Inicie la imagen de series temporales 3D haciendo clic en Inicio en la ventana Capturar .
- Guarde los datos de imagen en el formato de datos del software de control del microscopio en el disco duro de la computadora de control del microscopio.
4. Análisis de datos
- Abra los datos de imagen en el software de control del microscopio y expórtelos como archivos de formato TIFF de 16 bits.
- Abra los archivos exportados con el software StaQtool21 . Seleccione el modo Single Spot 3D y cargue los archivos de imagen presionando Ir.
NOTA: La serie temporal seleccionada se abre en el Visor de lapso de tiempo de proyección máxima, mostrando una proyección de intensidad máxima de la pila z del primer punto de tiempo (Figura 3A). - Ajuste la visualización de la intensidad de la imagen con el control deslizante vertical MAX en el lado izquierdo.
- Seleccione el punto de tiempo que desea analizar con el control deslizante horizontal Punto de tiempo .
- Coloque el cursor en la posición del sitio de transcripción etiquetado para marcar manualmente o use la función de detección automática y presione el sitio de transcripción respectivo si se detectaron varios objetos.
- Utilice la función Seguimiento automático para determinar las posiciones XYZ del sitio de transcripción a lo largo del tiempo.
NOTA: Si no se realizó un seguimiento correcto de una posición determinada, seleccione el sitio de transcripción manualmente de acuerdo con el manual del software StaQtool. - Pulse el botón Auto para realizar el ajuste de Gauss para cada punto de tiempo y medir la intensidad total de fluorescencia (TFI).
NOTA: Si la actividad transcripcional cesa, la herramienta de seguimiento permanece en la última posición donde se detectó un objeto limitado por difracción (un sitio de transcripción etiquetado). Si la celda se mueve en dirección XY después de que desaparece la etiqueta del sitio de transcripción, se requiere un reposicionamiento manual del cuadrado de búsqueda . - Después de finalizar la asignación del valor TFI para cada punto de tiempo, presione el botón Finalizar lapso de tiempo para cerrar el archivo de imagen de serie temporal actual y continuar con el siguiente archivo.
Nota : los valores TFI se exportan automáticamente y se guardan en un archivo de Excel.
5. Mediciones y análisis de calibración de microscopía
- Sembrar células en platos con fondo de vidrio de 35 mm y transfectar con las proteínas de la capa MS2 y PP7 marcadas fluorescentemente como se describe en la Sección 1.
NOTA: Para las mediciones de calibración, utilice las mismas líneas celulares de genes reporteros descritas en la Introducción. - Añadir 0,5 μg/ml de doxiciclina al medio de crecimiento de las células 1 h antes de iniciar la adquisición de imágenes de microscopía.
- Monte el plato con fondo de vidrio dentro de la cámara de incubación de la etapa del microscopio y prepare la adquisición de la imagen como antes (ver Sección 2).
NOTA: La tapa original del plato con fondo de vidrio no se reemplaza para los experimentos de calibración. - Utilice los mismos ajustes de intensidad y exposición del láser que se describen en el punto 3.1.
- Establezca la configuración de captura para series temporales 2D (anule la selección de la opción 3D en el panel Tipo de captura ) y establezca 120 puntos de tiempo a intervalos de 500 ms en el panel Captura de lapso de tiempo (figura 2C).
NOTA: Esta configuración de adquisición de imágenes dará como resultado series temporales dentro de un solo plano óptico a intervalos muy cortos. - Adquiera docenas de series de tiempo de calibración desde múltiples posiciones para generar conjuntos de datos para contar varios cientos de mediciones TFI de transcripciones individuales.
- Para el análisis de las series temporales de calibración, convierta los archivos a archivos de formato TIFF de 16 bits de acuerdo con el punto 4.1.
- Abra los archivos exportados con el software StaQtool21 (Figura 3). Pulse el botón Seleccionar archivo LOG , elija el archivo de registro de las respectivas series temporales 2D adquiridas como se describe en el punto 4.2.
- Seleccione la casilla de verificación Multiple Spots 2D y presione el botón GO para cargar la serie temporal en el software de análisis.
- En la ventana Visor de lapso de tiempo (Figura 3A), en el FWHM de PSF, el campo de entrada inserta el valor calculado para el sistema de microscopio y el objetivo como se describe21.
- Para iniciar el proceso de análisis, pulse el botón Detección automática para detectar todos los objetos con difracción limitada para el punto de tiempo actual que se muestra. A continuación, haga clic en AutoFit para realizar la adaptación gaussiana para determinar el valor TFI para cada objeto (Figura 3A).
- Alternativamente, apunte el cursor sobre un objeto de difracción limitada y haga clic para seleccionarlo (aparece un círculo verde dentro de un cuadrado blanco) y presione el botón Ajuste gaussiano para la selección manual y el procedimiento de ajuste de Gauss.
NOTA: Se recomienda el último modo para excluir objetos no contabilizados, como sitios de transcripción brillantes con varias transcripciones nacientes presentes en el mismo núcleo. - Pulse el botón Finalizar timelapse para finalizar el paso anterior.
Nota : los resultados se guardan automáticamente en un formato de archivo de Microsoft Excel en la misma carpeta que el archivo de imagen. - Inicie el módulo TFI y W Distributions para múltiples puntos presionando el botón respectivo (Figura 3B).
- Cargue archivos de Excel a través del botón Agregar archivo e inicie el análisis TFI presionando el botón Ir.
NOTA: El resultado es el valor medio de TFI determinado a partir de múltiples TFI de transcripciones únicas medidas. - Comience el análisis W insertando el PSF FWHM utilizado anteriormente en el punto 5.10. y pulse el botón Ir utilizando el valor predeterminado de la Papelera.
NOTA: El parámetro W es el control de calidad para las mediciones TFI de transcripción única para cumplir con el valor correcto de PSF FWHM para el sistema de microscopio utilizado.
6. Fusión de datos y calibración
- Introduzca los valores TFI de la serie temporal obtenidos de la hoja de Excel guardada en el punto 4.8. en una nueva hoja de Excel y divida cada valor de punto de tiempo por la TFI media para transcripciones individuales obtenidas en el punto 5.15.
NOTA: Para estandarizar este proceso, se utilizaron formularios de plantilla de Excel preparados a medida.
Representative Results
Las líneas celulares que albergan los genes reporteros descritos en la Figura 1A-C permiten el estudio de la dinámica de transcripción a un solo DSB en células vivas. Los números de la Figura 1A-C debajo de cada representación gráfica del gen informador indican la longitud en pares de kilobases (kbp). CmV indica el promotor del citomegalovirus, TetO es las secuencias del operador de Tet, pA destaca la escisión 3' y el sitio de poliadenilación en el extremo del gen. CFP-PTS es la proteína fluorescente cian codificada fusionada a una señal de orientación peroxisomal, y 2UBB es la unidad tándem de ubiquitina B humana codificada. Siguiendo el protocolo y los procedimientos de análisis descritos anteriormente, es posible obtener gráficos que muestran el número de transcripciones de genes reporteros marcados fluorescentemente a lo largo del tiempo, con una resolución temporal de segundos durante períodos de hasta horas (Figura 4A-D). El gráfico de la Figura 4A muestra el curso temporal de los valores de TFI de un sitio de transcripción del gen reportero PROM marcado por la acumulación de moléculas MS2-GFP en transcripciones nacientes. Este gráfico en particular representa un experimento de control sin adición de TA; por lo tanto, no se induce ningún OSD. La transcripción continúa con picos en forma de ráfaga y 2-8 transcripciones a la vez durante todo el período de observación de 60 minutos. Se obtuvieron resultados similares para los genes reportero EX2 y EX2-AS (datos no mostrados aquí)4. La inducción de un solo DSB en los genes reporteros (utilizando I-SceI-GR-iRFP) permite estudiar el impacto del DSB en la transcripción del gen reportero en curso y el monitoreo de los eventos de transcripción que emergen del sitio DSB, a saber, la transcripción inducida por ruptura (Figura 4B-D).
La dinámica de la transcripción inducida por la ruptura del ADN depende de la ubicación del DSB dentro del gen
La inducción de un solo DSB por I-SceI-GR-iRFP en el gen reportero con un sitio de reconocimiento I-SceI promotor-proximal conduce al silenciamiento transcripcional del gen reportero después de aproximadamente 11 minutos después de la adición de TA, y la transcripción no se restaura dentro del período de observación de 60 minutos (Figura 4B). Al observar la transcripción del gen reportero EX2, se detectó la supresión completa de la transcripción impulsada por el promotor canónico mediante una pérdida simultáneamente completa de las señales MS2-GFP y PP7-RFP alrededor de 30 minutos después de la adición de TA. Sin embargo, dentro de los 10 minutos, la transcripción se reinicia, como lo revelan los picos de reaparición de fluorescencia PP7-RFP. La recuperación completa de la señal PP7-RFP (y no de la fluorescencia MS2-GFP) muestra el inicio de la transcripción inducida por rotura (Figura 4C). La transcripción inducida por ruptura no es estable durante largos períodos; parece una ráfaga y de baja intensidad máxima, lo que indica que sólo unas pocas transcripciones inducidas por roturas se iniciaron desde el sitio del OSD.
El gen reportero EX2AS, que contiene una matriz de bucle de tallo PP7 24x en el exón II aguas abajo del sitio I-SceI para detectar la transcripción del sentido, muestra la transcripción impulsada por el promotor canónico que termina dentro del gen reportero EX2AS dentro de aproximadamente 25 minutos después de la adición de TA. Luego se reemplaza por la transcripción inducida por ruptura antisentido, como lo revela la acumulación de la proteína MS2-GFP que se une al ARN generado a partir de secuencias de bucle de tallo MS2 antisentido (Figura 4D). La actividad transcripcional antisentido estaba ausente antes de la interrupción de la transcripción sensorial debido a la inducción del DSB y muestra en este ejemplo que varias transcripciones se iniciaron desde el sitio de ruptura en alrededor de 15 min. Los datos representativos obtenidos aquí muestran que los DSB tienen diferentes efectos sobre la transcripción dependiendo de su ubicación dentro del gen, como se informó recientemente4. Los datos también revelan una variabilidad de célula a célula en el momento de la inducción de DSB por I-SceI-GR-iRFP, que varía de 12 a 30 minutos después de la adición de TA. Además, la detección de transcripciones individuales permite el descubrimiento de diferencias de célula a célula y sitio de ruptura hacia la intensidad de la actividad transcripcional inducida por ruptura. La transcripción inducida por ruptura solo se detecta en los DSB dentro del gen. Está ausente en los DSB promotores-proximales, donde la transcripción canónica cesa en un DSB durante el período de observación restante.
Figura 1: Genes reporteros y el sistema para inducir roturas de doble cadena de ADN. La representación esquemática en (A) a (C) muestra la estructura de los tres genes reporteros utilizados para estudiar la transcripción tras la inducción de una rotura de doble cadena de ADN. El gen reportero con el sitio promotor-proximal I-SceI en el primer exón (PROM) flanqueado aguas abajo por una matriz de secuencia de bucle de tallo MS2 24x (MS2-SL) se representa en (A). El gen reportero con el sitio I-SceI en el segundo exón (EX2) flanqueado aguas arriba con una secuencia de bucle de tallo MS2 24x y aguas abajo por una matriz de bucle de tallo PP7 24x (PP7-SL) se muestra en (B). El gen reportero con el sitio I-SceI localizado en el exón II con una inserción antiparalela de la secuencia 24x MS2 stem-loop aguas arriba del sitio I-SceI para detectar la transcripción antisentido (EX2-AS) se muestra en (C). La función de la construcción de la proteína de fusión I-SceI-GR-iRFP se representa en (D) mediante una visualización gráfica y las imágenes correspondientes de células vivas a continuación. Tras la expresión transitoria de la construcción (color rojo) en las líneas celulares del gen reportero, la proteína es exclusivamente citoplasmática, lo que evita una escisión prematura del sitio objetivo por la endonucleasa I-SceI . Tras la adición de TA, la proteína de fusión comienza a migrar al núcleo celular (indicado por una línea discontinua) y comienza a acumularse entre 5-15 min. Scalebar = 10 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Selección de células para imágenes de lapso de tiempo en 3D de sitios de transcripción. La foto en (A) muestra un plato con fondo de vidrio de 35 mm utilizado para la imagen de células vivas, con una tapa modificada personalizada, en la que se perforó un orificio de 3 mm de diámetro para agregar el TA diluido en el medio de crecimiento directamente. La ubicación del agujero está marcada con un círculo rojo. El panel en (B) muestra una captura de pantalla de la ventana "Enfoque" del software de control del microscopio para configurar el tiempo de exposición de la vista en vivo, la configuración del filtro, la intensidad del láser y la visualización de la imagen de escala para detectar celdas para la posterior imagen de lapso de tiempo en (C), la captura de pantalla de la ventana "Captura" correspondiente para ajustar todas las configuraciones para la adquisición de lapso de tiempo 3D de las células vivas. La configuración específica de los paneles Filtro, Tipo de captura, Captura de lapso de tiempo y Captura 3D se describe en la sección 3. En la vista que se muestra aquí, los ajustes se ajustan para adquirir un lapso de tiempo 3D de la línea de genes reportero PROM transfectada con las construcciones MS2-GFP e I-SceI-GR-iRFP para la transcripción de imágenes tras la inducción de una ruptura de doble cadena de ADN en la región promotor-proximal del gen reportero. La imagen en (D) se fusiona para los canales GFP e iRFP y muestra un campo de visión visto a través del sistema de microscopio, con varias células de la línea celular del gen reportero 293-PROM. Las células fueron co-transfectadas con la construcción de proteína de capa MS2 del dímero en tándem fusionada a una secuencia de localización nuclear, dos proteínas fluorescentes verdes (GFP-MS2CP) y la construcción I-SceI-GR-iRFP. Varias células muestran la expresión de la construcción GFP-MS2CP, destacando así los núcleos y la construcción I-SceI-GR-iRFP destacando el citoplasma. El cuadrado discontinuo indica la región ampliada que se muestra en (E). Para las imágenes de lapso de tiempo 3D, las células se seleccionan de acuerdo con los requisitos conferidos en la Discusión, como la célula con el núcleo más grande en la región ampliada en (D). Esta célula se transfecta con ambas construcciones fluorescentes y muestra un sitio de transcripción brillantemente marcado (punta de flecha) al acumular el GFP-MS2CP en pre-ARNm del gen reportero transcrito de novo (imagen izquierda). El medio de crecimiento de las células no contiene TA; por lo tanto, el constructo I-SceI-GR-iRFP es exclusivamente citoplasmático (imagen derecha). En (F), el plato con fondo de vidrio está montado en la cámara de incubación de la etapa de microscopio para experimentos de imágenes de lapso de tiempo 3D y equipado con la tapa personalizada que contiene el orificio de carga TA. La punta de micropipeta de 200 μL se inserta cuidadosamente en el orificio para aplicar la TA diluida al medio de crecimiento de las células. Scalebar = 10 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Software de adquisición y análisis de imágenes. El panel en (A) muestra una captura de pantalla de la herramienta STaQTool: Spot tracking and quantification. La imagen muestra una serie temporal de ejemplo de la línea celular del gen reportero PROM con un sitio de transcripción marcado con un círculo verde / cuadrado blanco en la pantalla de proyección de máxima intensidad en el centro. Las ventanas en el lado derecho muestran una vista ampliada del punto del sitio de transcripción seleccionado, la correspondiente gráfica de superficie de intensidad sombreada en 3D con la cuadrícula de ajuste gaussiana 2D para el punto de tiempo actual, así como gráficas de la posición Z del punto Z del sitio de transcripción dentro de la pila z, el ancho de ajuste gaussiano (W) y la medición TFI a lo largo del tiempo. La imagen microscópica en (B) muestra un plano óptico único ampliado de un núcleo de una línea celular del gen reportero PROM transfectada con MS2-GFP. La imagen representa un punto único de una serie temporal de calibración 2D con 120 puntos de tiempo. El núcleo muestra varias transcripciones marcadas fluorescentemente que aparecen como objetos limitados por difracción en el nucleoplasma (marcados por cuadrados blancos). El panel lateral derecho muestra una captura de pantalla de la herramienta TFI y W Distributions en STaQTool para analizar múltiples puntos en adquisiciones de lapso de tiempo 2D. En este análisis de ejemplo, la herramienta detectó 408 puntos limitados por difracción que representan transcripciones de genes reporteros marcadas con MS2-GFP que se difunden en el nucleoplasma. Los gráficos de la derecha muestran los histogramas de distribución de ancho de ajuste TFI y gaussiano de los objetos y las curvas de ajuste gaussiano. Los valores medios TFI y W derivados de la posición del pico central de la curva de ajuste gaussiana y los intervalos de confianza calculados se muestran en el panel respectivo. Scalebar = 10 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la detección de transcripción en sitios de roturas de doble cadena de ADN. Los gráficos de (A) a (D) representan la curva TFI calibrada de un sitio de transcripción a lo largo del tiempo. Los valores de TFI se convierten en transcripciones utilizando la TFI media de transcripciones individuales medidas en los experimentos de calibración para la construcción del gen reportero respectivo y la proteína de unión al asa del tallo de ARN marcada fluorescentemente MS2 o PP7 utilizada en el experimento respectivo. En (A), se muestra un gráfico de un experimento de control utilizando el gen prom reportero sin adición de TA. Las transcripciones marcadas con MS2-GFP indican actividad transcripcional continua durante todo el período de observación. El gráfico en (B) representa el gen reportero PROM tras la adición de TA y la inducción de un DSB que conduce a una supresión de la transcripción durante el tiempo de observación restante. El gráfico del gen reportero EX2 en (C) muestra una supresión de la transcripción de la transcripción impulsada por el promotor canónico tras la adición de TA. Más tarde, en el mismo lapso de tiempo, solo emerge la actividad transcripcional marcada con PP7-RFP. En el gráfico en (D), la transcripción del gen reportero EX2-AS del promotor canónico en la dirección del sentido se suprime de manera similar al agregar TA al gen reportero EX2 en (C). Sin embargo, la aparición de transcripciones marcadas con MS2-RFP que se originan en la secuencia de bucle de tallo MS2 insertada inversamente indica que la transcripción antisentido está ausente durante la actividad de transcripción sensorial antes de la adición de TA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Línea celular del reportero | EX2 y EX2-AS | BAILE DE GRADUACIÓN |
| Plásmidos para transfectar | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP |
| 0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry | 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP | |
| 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP |
Tabla 1: Transfección de las líneas celulares del gen reportero. La tabla describe los esquemas de transfección y las cantidades de los diferentes plásmidos utilizados para transfectar las diferentes líneas celulares del gen reportero de forma transitoria.
Discussion
Los conflictos entre procesos biológicos esenciales como la replicación, la transcripción, el daño al ADN y la reparación del ADN se han identificado como una fuente crítica de inestabilidad del genoma22. Estos estudios también han llevado al descubrimiento de la transcripción en sitios de daño en el ADN y han atribuido un papel funcional a las transcripciones inducidas por rotura en la regulación de los procesos de reparación del daño del ADN23. Las nuevas herramientas y el protocolo descrito aquí permiten una mayor investigación de la dinámica de transcripción del ARN Pol II en los DSB. Un punto crítico en este protocolo es la generación de líneas celulares que contienen una sola copia del gen reportero integrado en el genoma. Esta característica clave elimina el ruido creado por la transcripción de varios genes reporteros integrados con múltiples copias dentro de un solo locus genómico y permite la recopilación de parámetros cinéticos de la dinámica de transcripción y transcripciones individuales de ARN. Un requisito técnico crucial para observar la transcripción de integraciones de genes de un solo reportero es la disponibilidad de un sistema de microscopio que permita la detección de transcripciones de ARN único marcadas con el sistema MS2 o PP7 en células vivas4,12. Aquí, la microscopía de células vivas se realiza en un sistema de disco giratorio confocal montado en un microscopio invertido, equipado con láseres de estado sólido de 100 mW acoplados a un filtro sintonizable acústico-óptico como se describe en otra parte24. Además, para estudiar la transcripción en un solo DSB utilizando los reporteros, las células individuales deben ser monitoreadas cuidadosamente para lograr la resolución de tiempo más alta, lo que requiere células de imágenes durante varias horas, lo que lo convierte en un ensayo de bajo rendimiento. Aún así, observamos varias células en paralelo con el posicionamiento controlado por una etapa de microscopio piezoaccionado. Para garantizar condiciones ambientales óptimas para la observación de células vivas durante horas, el cuerpo del microscopio, incluida la etapa de muestra, se coloca dentro de una cámara ambiental de plexiglás. Además, se monta una cámara de incubación de etapa cerrada en la etapa del microscopio y se conecta a los controladores de suministro de CO2 y humedad.
El primer paso crítico en el protocolo es la selección de regiones de interés con células para la obtención de imágenes. Cada posición XY marcada para la obtención de imágenes debe contener una o más células que muestren transfección con las proteínas de unión al asa madre de ARN fluorescente de acuerdo con el gen reportero y el esquema de transfección descritos en la Sección 1, Tabla 1, así como en la Figura 2D, E. Además, las células deben exhibir sitios de transcripción marcados brillantes que deben ser co-transfectados con la construcción I-SceI-GR-iRFP713, y la proteína debe localizarse inicialmente en el citoplasma (Figura 2D y E).
Las células deben mostrar un nivel de intensidad de fluorescencia de la proteína de la capa MS2 y/o PP7 marcada fluorescentemente no unida lo suficientemente baja como para detectar transcripciones de una sola etiqueta sobre el nivel de fluorescencia de fondo. Al mismo tiempo, es necesario un nivel robusto de intensidad de fluorescencia de las proteínas de la capa MS2 y / o PP7 marcadas fluorescentemente para permitir la obtención de imágenes durante al menos 60 minutos sin perder demasiada fluorescencia debido a algún blanqueamiento que se produce. La "Visualización de imagen de escala" con un rango fijo como se describe en la Sección 3.7 se utiliza para permitir una selección estandarizada de células de acuerdo con su nivel de intensidad de fluorescencia.
Un segundo paso crítico del protocolo es agregar el TA a las celdas en posiciones XY predeterminadas a través del pequeño orificio en la tapa del plato con fondo de vidrio. Cualquier manipulación del plato de fondo de vidrio causaría un cambio de la posición XY marcada de las células y debe evitarse. Por lo tanto, el manejo cuidadoso de la micropipeta mientras se agrega la TA diluida en el medio de crecimiento celular es vital para la observación exitosa de las células preseleccionadas, como se demuestra en la Figura 2F. La adaptación de diferentes sistemas para agregar medicamentos a células montadas en una etapa de microscopio, como un sistema de perfusión, requeriría una cámara de incubación de etapa separada con aberturas de entrada y salida de tubos y una bomba o sistema de inyección para administrar medicamentos. Otros métodos, como las diapositivas de canal con superficies inferiores similares a un deslizamiento de cubierta, dan como resultado una difusión lenta de los medicamentos administrados en el canal y causan un retraso adicional entre la adición del medicamento y el efecto. Finalmente, el pipeteo imprudente en una abertura de deslizamiento de canal también puede cambiar la posición de la muestra. Por lo tanto, el sistema actual con un orificio perforado personalizado en la tapa de un plato con fondo de vidrio es fácil de adaptar, de bajo costo y adecuado para administrar diferentes medios de crecimiento, medicamentos y componentes. El pequeño diámetro del orificio y la atmósfera humidificada en la cámara de incubación de la etapa también evitan el secado del medio celular.
Un tercer paso crítico en este protocolo es el análisis de datos, que requiere una inspección manual de los puntos de tiempo en que cesa la transcripción debido a la inducción de un DSB. El punto de tiempo de terminación de la transcripción se indica liberando las últimas transcripciones del sitio previamente brillante de la transcripción del gen reportero. Del mismo modo, los eventos de iniciación de la transcripción inducida por ruptura deben inspeccionarse con cuidado para detectar eventos de transcripción individuales con la relación señal-ruido relativamente baja de los ARNm únicos marcados con fluorescencia.
La dinámica de reparación del OSD inducido añade una capa adicional de complejidad a los análisis de los datos generados utilizando estos informadores, limitándolos a los primeros minutos inmediatamente después de la inducción del OSD. La naturaleza transgénica de los genes reporteros y la naturaleza rica en repeticiones de las matrices de bucle de tallo MS2 y PP7 pueden ensamblar un paisaje único de cromatina, interfiriendo con el establecimiento de supuestos programas de transcripción estables inducidos por ruptura. No obstante, en comparación con la irradiación ionizante o UV, la inducción mediada por I-SceI de un DSB en genes reporteros es un sistema mucho más robusto para investigar la transcripción en DSB individuales.
Diferentes sistemas de endonucleasa como I-CreI, I-PpoI o AsiSI que tienen o no sitios de reconocimiento adicionales dentro del genoma humano se pueden combinar con los actuales sistemas de genes reporteros para una posible mayor eficiencia de generación de DSB. Sin embargo, primero requieren introducir el sitio de reconocimiento de endonucleasa en los genes reporteros. En segundo lugar, pueden tener una variabilidad similar en el momento y la eficiencia de la inducción de un DSB en células individuales. Por otro lado, la inserción de copias en tándem de los sitios de reconocimiento de endonucleasa puede aumentar la eficiencia de la inducción de DSB. Además, probar los sistemas de genes reporteros presentados en diferentes líneas celulares permitiría la comparación de la dinámica de transcripción en los sitios DSB entre diferentes fondos celulares y la disponibilidad de diferentes vías de reparación del daño del ADN, como en células cancerosas, células primarias y células diferenciadas no ciclantes. Sin embargo, la construcción de los genes reporteros para que sean compatibles con el sistema Flp/FRT está limitando actualmente la integración en las líneas celulares huésped Flp/FRT disponibles.
Además de las aplicaciones basadas en microscopía, los genes reporteros actuales también pueden combinarse con ensayos bioquímicos, como la inmunoprecipitación de cromatina, para estudiar el reclutamiento de factores de reparación o transcripción del ADN en un solo DSB o para evaluar la ocupación de nucleosomas, las modificaciones de histonas y el estado de cromatina alrededor del sitio de DSB. Además, una combinación con diferentes sistemas de reporteros permitiría el estudio de los vínculos funcionales entre el daño del ADN y procesos como la organización del genoma o la replicación del ADN.
Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca por los regalos de plásmidos y reactivos. También estamos en deuda con el personal de iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento y J. Rino, por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 y PTDC/MED-OUT/4301/2020 de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal y por LISBOA-01-0145-FEDER-007391, proyecto cofinanciado por FEDER a través de POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa y FCT. También se recibió financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la UE (RiboMed 857119). M.A. es el destinatario de la beca FCT Ph.D. 2020.05899.BD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
| 3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
| Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
| CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
| Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
| I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
| Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
| Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
| MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
| microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
| pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
| SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
| triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |
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