Summary
여기에서는 DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 생물물리학적 메커니즘을 연구하기 위해 단일 분자 이미징 방법인 DNA 커튼의 사용에 대해 설명합니다.
Abstract
염색체 전좌로 인한 융합 유전자는 많은 고형 종양 또는 백혈병에서 발견되었습니다. 융합 종양 단백질의 FUS / EWS / TAF15 (FET) 계열에 속하는 EWS-FLI1은 유잉 육종에서 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 이러한 FET 패밀리 융합 단백질은 일반적으로 N-말단에 FET 단백질의 저복잡성 도메인(LCD)을, C-말단에 DNA 결합 도메인(DBD)을 가지고 있습니다. EWS-FLI1은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 표적 결합 유전자좌에서 생체 분자 축합 물을 형성하는 것으로 확인되었으며, 이러한 축합 물은 RNA 중합 효소 II를 모집하여 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 응축수가 결합 부위에서 어떻게 조립되는지는 불분명합니다. 최근에는 EWS-FLI1 응축물의 이러한 조립 과정을 시각화하기 위해 단일 분자 생물 물리학 방법인 DNA 커튼이 적용되었습니다. 여기에서는 표적 DNA에 조립되는 생체 분자 응축수를 연구하는 데 DNA 커튼을 적용하기 위한 상세한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 접근 방식에 대해 논의합니다.
Introduction
전사 조절은 살아있는 세포에서 정확한 유전자 발현을 위한 중요한 단계입니다. 염색체 변형, 전사 인자(TF) 및 비코딩 RNA와 같은 많은 요인이 이복잡한 과정에 참여합니다1,2,3. 이러한 요인 중 TF는 프로모터 또는 인핸서로 알려진 특정 DNA 서열을 인식하고 결합한 다음 전사 4,5,6,7을 활성화하거나 억제하기 위해 다른 기능성 단백질을 모집함으로써 전사 조절의 특이성에 기여합니다. 이러한 TF가 인간 게놈에서 표적 부위를 검색하고 히스톤 및 비 히스톤 DNA 결합 단백질로 코팅 된 DNA와 상호 작용하는 방법은 수십 년 동안 과학자들을 당혹스럽게했습니다. 지난 몇 년 동안, TF의 표적 검색 메커니즘에 대한 몇 가지 고전적인 모델이 DNA 사슬 8,9,10,11을 따라 "미끄러지는", "홉", "점프"또는 "세그먼트 간 전달"하는 방법을 설명하기 위해 구축되었습니다. 이 모델은 단일 TF 분자의 DNA에 대한 검색 행동에 중점을 둡니다. 그러나 최근 연구에 따르면 일부 TF는 핵에서 단독으로 또는 매개체 복합체12와 함께 액체-액체 상 분리 (LLPS)를 겪습니다. TF의 관찰된 액적은 프로모터 또는 인핸서 영역과 연관되어, 전사 및 3차원 게놈13,14,15에서 생체분자 축합물 형성의 역할을 강조한다. 이러한 생체 분자 응축수는 생체 내 및 시험관 내에서 막이 없는 구획과 연결되어 있습니다. 이들은 LLPS를 통해 형성되며, 여기서 모듈식 생체 거대분자와 단백질의 내재적으로 무질서한 영역(IDR)은 다가 상호 작용의 두 가지 주요 원동력입니다16. 따라서 TF는 DNA를 검색 할뿐만 아니라 이러한 응축수 4,17,18 내에서 상승 작용을합니다. 현재까지 DNA에 대한 이러한 전사 응축 물의 생물 물리학 적 특성은 불분명하다.
따라서 이 연구는 단일 분자 방법인 DNA 커튼을 적용하여 시험관 내 DNA에서 TF에 의해 형성된 전사 응축물의 형성과 역학을 직접 이미지화하는 것을 목표로 했습니다. 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 연구하기 위한 고처리량 체외 이미징 플랫폼인 DNA 커튼은 DNA 복구 19,20,21, 표적 검색 22 및 LLPS17,23,24에 적용되었습니다. DNA 커튼의 플로우 셀은 바이오 티닐화 지질 이중층으로 코팅되어 표면을 부동 태화하고 생체 분자가 표면에 확산되도록합니다. 나노 가공 된 지그재그 패턴은 DNA의 움직임을 제한합니다. 비오틴화된 람다 DNA 기질은 장벽 가장자리를 따라 정렬될 수 있으며 배향된 완충액 흐름에 의해 늘어날 수 있습니다. 모든 분자의 동일한 시작 및 끝 서열은 DNA 상의 단백질의 추적을 허용하고 결합 이벤트(25, 26)의 위치 분포를 설명한다. 또한 DNA 커튼과 전반사 형광 현미경(TIRFM)의 조합은 배경 노이즈를 최소화하고 단일 분자 수준에서 신호를 감지하는 데 도움이 됩니다. 따라서 DNA 커튼은 DNA 모티프에서 전사 응축수 형성의 역학을 조사하는 유망한 방법이 될 수 있습니다. 이 논문은 염색체 전좌에 의해 생성된 FUS/EWS/TAF15(FET) 패밀리 융합 종양단백질, EWS-FLI1의 예를 설명합니다. EWS-FLI1의 결합 서열인 25× GGAA를 함유하는 람다 DNA27-를 DNA 커튼 실험에서 DNA 기질로 사용하여 EWS-FLI1 분자가 DNA에서 LLPS를 겪는 방식을 관찰하였다. 이 원고는 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법에 대해 자세히 설명합니다.
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Protocol
1. 지질 이중층 마스터 믹스의 제조
- 유리 바이알을 이중 증류수 (ddH2O)와 99 % 에탄올로 헹구고 60 ° C 건조 오븐에서 건조시킵니다.
- 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 1g, 폴리에틸렌글리콜 반응(PEG화) 지질 100mg(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염)(PEG2000 DOPE) 100mg 및 비오티닐화 지질 25mg(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(캡 비오티닐)(나트륨염)(비오티닐 캡 DOPE))을 클로로포름 10mL에 녹여 지질 마스터 믹스를 만듭니다.
- 바이알당 지질 마스터 믹스 1mL 분취량을 준비하고 -20°C에서 깨끗한 유리 바이알에 보관합니다.
알림: 용해된 지질을 유리 바이알에 보관하고 보관 중에 바이알 캡을 파라필름으로 덮으십시오.
2. 리포좀 용액의 제조
- 2mL 유리 바이알을 ddH2O 및 99 % 에탄올로 헹구고 60 °C 건조 오븐에서 완전히 건조시킵니다.
- 250μL 유리 주사기를 클로로포름으로 헹군 다음 200μL의 지질 마스터 혼합물을 마른 유리 바이알에 옮깁니다.
- 질소 스프레이 건을 사용하여 바이알을 한 방향으로 계속 회전시키면서N2 를 부드럽게 흐르게 합니다.
참고 : N2 는 클로로포름을 증발시키는 데 도움이되며 잔류 지질은 유리 바이알의 벽에 박막을 형성합니다. 처음에는 질소 흐름을 매우 부드럽게 조정하고 바이알에 흰색 필름이 나타날 때 흐름을 증가시킵니다. 5분 이내에 이 증발 과정을 완료하십시오. - 유리 바이알을 실온 (RT)의 진공 건조 오븐으로 16-24 시간 동안 옮겨 지질에서 클로로포름을 완전히 제거합니다.
- 2mL의 새로운 지질 완충액(10mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 100mM NaCl)을 유리 바이알에 추가하고 RT에서 2시간 동안 지질을 용해시킵니다. 용액을 여러 번 볼텍스하고 5mL 폴리프로필렌 배양 튜브로 옮깁니다.
- 마이크로 팁 초음파 처리기로 얼음에 지질 용액을 초음파 처리하여 작은 단층 소포를 형성합니다., 다음 설정을 사용하여: 6 초 on-12 s 끄기 (20 % 진폭) 6 사이클 동안, 다음 6 초 on-6 s 끄기 (30 % 진폭) 3 사이클 동안, 마지막으로 10 초 온 (40 % 진폭).
알림: 초음파 처리 중 온도가 상승하면 거품이 파열되고 리포좀이 파괴 될 수 있습니다. 따라서 거품의 상태와 온도를 확인하고 얼음을 자주 보충하십시오. - 리포좀을 0.22 μm 나일론 주사기 필터, 분취량을 통해 여과하고, 이를 4°C에서 보관한다.
알림: 장기간 보관하면 이동성이 감소하므로 리포좀은 2-3 개월 내에 사용하거나 사용하기 전에 새로 준비해야합니다.
3. 람다 DNA의 서열 클로닝 및 비오티닐화
- 람다 DNA에 결합 모티프 삽입
- 결합 모티프 및 람다 DNA를 함유하는 표적 단편을 NheI 및 XhoI로 분해한다. RT에서 하룻밤 동안 T4 리가아제를 사용하여 Lambda DNA로 표적 단편을 결찰합니다.
- 대장균 VCS257 세포를OD600이 0.6에 도달할 때까지 무항생제 LB 배지에서 배양한다. 나중에 사용할 수 있도록 박테리아를 4 ° C에 보관하십시오.
- 결찰 용액을 65°C에서 20분 동안 가열하여 T4 리가아제를 변성시킵니다.
- 람다 파지 추출물을 해동하고, 무딘 팁으로 피펫팅하여 결찰된 생성물과 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 500μL의 SM 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 및 8mMMgCl2, 0.22μm 필터를 통해 여과됨) 및 20μL의 클로로포름을 단계 3.1.4의 패키징 혼합물에 첨가하고, 잘 혼합하고, 용액을 원심분리한다.
참고: 포장 추출물의 활성은 장기간 4°C에서 유지될 수 있습니다. - 10 μL의 패키징 추출물과 90 μL의 SM 완충액 및 100 μL의 VCS257 세포 (단계 3.1.2에서)를 함께 혼합함으로써 반응 혼합물을 제조하고, 혼합물을 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
참고: 포장 용액 농도는 다음 날 파지 플라크의 밀도에 따라 다릅니다. 필요에 따라 희석하거나 첨가 할 수 있습니다. - 15mL 튜브에 녹인 상단 한천(22g/L NZCYM 국물과 15g/L 한천)을 ~5mL 섭취합니다. 상단 한천이 ~42°C로 냉각되는 즉시 무딘 피펫을 사용하여 반응 혼합물(3.1.6단계에서)을 천천히 추가하고 액체를 무항생제 LB 한천 플레이트에 붓습니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 밤새 보관합니다.
- 상부 한천 플레이트의 투명 파지 플라크 중 양성 플라크를 PCR로 확인하였다. 양성 플라크를 피펫으로 새로운 상단 한천 플레이트로 옮기고 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 밤새 보관합니다.
- 400μL의 VCS257 세포를 10mM MgCl2 및 10mMCaCl2를 함유하는 400μL의 완충액에 첨가하고, 하나의 플라크를 이 세포 혼합물에 접종하고, 250rpm에서 37°C 쉐이커에서 15분 동안 배양한다.
- 파지 플라크를 함유하는 이 현탁액 800 μL를 2 L 플라스크의 NZCYM 브로스 200 mL에 첨가하고, 이를 125 rpm에서 37°C 진탕기에서 인큐베이션한다.
- 배양 ~4시간 후 박테리아 현탁액의 OD600 을 측정합니다. OD600 값은 먼저 상승한 다음 ~0.2에서 저점으로 떨어집니다. OD600 값이 다시 상승하려고 할 때 배양을 중지하고 500μL의 클로로포름을 추가하고 80rpm에서 5분 더 흔듭니다.
알림: 트로프 후 OD600 의 증가는 빠르게 발생합니다. 따라서OD600 값은 배양에서 과도한 VCS257 세포 성장을 피하기 위해 0.3으로 감소할 때 더 자주 측정해야 합니다. - 파지 배양액을 500mL 병에 옮기고 11.7g의 NaCl을 넣고 병을 흔든다. 병을 얼음 위에 10 분 동안 배양하십시오.
- 현탁액을 4개의 50mL 튜브에 균등하게 옮깁니다. 튜브를 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
알림: 섹션 3.1의 이러한 모든 원심 분리 단계는 4 ° C에서 수행해야합니다. - 상청액을 4개의 새로운 50mL 튜브로 옮기고 5분 동안 동일한 속도로 다시 원심분리합니다.
- 상청액을 수집하고 10%(w/v) PEG8000 분말을 추가하고 4°C에서 회전하여 30분 동안 배양합니다.
- 단계 3.1.15로부터의 현탁액을 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 파지 펠렛을 수득하였다.
- 4개의 튜브에 1mL의 파지 희석 완충액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl 및 10mM MgCl2)에 펠릿을 재현탁하고 이들 혼합물 4mL를 모두 50mL 튜브에 붓습니다.
- RNase A (10 mg / mL) 및 DNase I (4 mg / mL)를 20 μg / mL 및 5 μg / mL 최종 농도에 첨가하고 37 °C에서 30 분 동안 배양하여 과잉 핵산을 분해합니다.
- 4.5mL의 300mM Tris-HCl(pH 7.5), 2.76mL의 0.5M 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 1.67mL의 10% 나트륨 도데실설페이트(SDS) 및 75μL의 프로테이나제 K(10mg/mL)를 튜브에 넣고 65°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 미리 냉각된 4.5mL의 3M 아세트산칼륨을 넣고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 8,000 x g에서 10분 동안 원 심분리하고, 상청액을 10,000 x g에서 추가로 5분 동안 회전시킨다.
- 충분한 혼합과 함께 수집 된 상청액 (단계 3.1.21에서)에 70 % 부피의 이소프로판올을 첨가하고, RT에서 2 분 동안 배양 한 다음, 8,000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리한다. 이소프로판올을 버리고 5분 동안 다시 돌립니다.
알림: DNA 펠릿은 처음 10분 원심분리 전에 번집니다. 펠릿은 두 번째 5분 원심분리 후 튜브 바닥에 농축됩니다. - 침전된 DNA를 2-3mL의 70% 에탄올로 세척하고 1분 동안 다시 스핀다운합니다. 펠릿을 4°C에서 2시간 동안 건조시킨 다음, RT에서 밤새 500μL의 TE 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1mM EDTA)에 DNA를 재현탁시킨다.
- DNA를 1.5mL 튜브로 옮기고 18,000 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. DNA를 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 정제된 람다 DNA를 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 비오틴-람다 DNA 준비
- 클로닝된 모티프가 있는 정제된 람다 DNA 50μL를 65°C에서 10분 동안 녹입니다.
참고: Lambda DNA의 길이는 ~48kbp이므로 DNA 파손을 방지하기 위해 피펫팅 전에 가열해야 합니다. - 50 μL의 람다 DNA, 1 μL의 비오틴 프라이머 (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) 및 54 μL의ddH2O를 함께 혼합한다. 혼합물을 65°C에서 5분 동안 공동 배양하고 벤치에 두어 RT로 냉각시킵니다.
- 12μL의 10x T4 리가아제 완충액 및 3μL의 T4 리가아제를 추가하고 RT에서 몇 시간 또는 밤새 배양합니다.
- 동일한 부피의 페놀-클로로포름(1:1) 혼합물을 결찰 생성물에 첨가하고 즉시 잘 혼합한 다음 RT에서 2분 동안 12,000 x g 로 원심분리합니다.
- DNA가 포함된 상부 수성 상을 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 같은 부피의 클로로포름을 넣고 잘 혼합한 다음 12,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
- 상부 수성 상을 새로운 튜브로 옮기고, 동일한 부피의 이소프로판올과 3M 아세트산 나트륨 부피의 10 %를 첨가하고, RT에서 2 분 동안 배양한다. 혼합물을 12,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 펠릿을 75% 에탄올로 세척한 다음 12,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 75% 에탄올을 제거하고, DNA를 RT에서 10분 동안 자연 건조하고, 120μL의 TE 완충액을 사용하여 DNA를 용해시킨다.
- 3.2.8 단계의 용액 120 μL에 완충액 A 60 μL (30 % (w / v) PEG8000 및 30 mM MgCl2)를 첨가하고 4 °C에서 20-24 시간 동안 회전합니다.
- 혼합물을 18,000g에서 5 분 동안 원 심분리하고, 상청액을 제거한다.
- 180μL의 사전 냉각된 75% 에탄올을 사용하여 펠릿을 세척하고 3.2.10단계를 반복합니다.
- RT에서 펠릿을 건조시키고 100μL의 TE150 버퍼를 사용하여 DNA를 용해시킵니다.
- 클로닝된 모티프가 있는 정제된 람다 DNA 50μL를 65°C에서 10분 동안 녹입니다.
4. 나노 가공 지그재그 장벽
- 초음파 처리로 20 분 동안 아세톤에서 슬라이드를 청소하고 20 분 동안 초음파 처리를 위해 1M NaOH가있는 새로운 유리 용기로 옮깁니다. 90mL의 H2SO4를 30mL의H2O2와 혼합하고, 슬라이드를 이 혼합물에 30분 동안 침지시킨다. 슬라이드를 아세톤과 이소프로판올로 헹구고 슬라이드를N2로 건조시킨다.
참고 : H 2 SO4 및 H 2 O2의 혼합은 발열 과정이다; 작동 중 적절한 안전 예방 조치를 취하십시오. - 세척된 슬라이드를 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 25 kDa, PMMA 49.5 kDa 및 전도성 보호 코팅의 최상층으로 연속적으로 코팅합니다. 전자빔 리소그래피를 사용하여 지그재그 장벽을 작성합니다(그림 1A).
- 전도성 보호 코팅을 제거하기 위해ddH2O로 슬라이드를 세척하고N2로 슬라이드를 건조시킨다.
- 마그네트론 스퍼터링 기계를 사용하여 30nm 크롬 (Cr) 층을 증착하고 나머지 PMMA 층을 아세톤으로 제거합니다.
참고: 하나의 플로우셀을 20개 이상의 DNA 커튼 실험에 재사용할 수 있습니다. 플로우셀을 재사용하려면 에탄올, 세제 및 NaOH로 세척하십시오.
5. EWS-FLI1 단백질의 정제
참고: 25× GGAA 모티프를 가진 람다 DNA에서 500nM EWS-FLI1을 관찰한 것은 응축수 형성에 DNA 커튼을 적용하는 좋은 예입니다. EWS-FLI1은 EWSR1(1-265)의 N-말단과 FLI1(220-453)의 C-말단을 결합한 융합 단백질이다. 시각화를 위해 mCherry 태그를 EWS-FLI1 융합 단백질의 N 말단에 융합했습니다.
- EWS-FLI1 유전자를 재구성된 pRSF 벡터 또는 임의의 다른 적합한 원핵생물 발현 벡터로 복제한다.
- 7x His-mCherry-EWSFLI1을 코딩하는 플라스미드를 대장균 BL21(DE3) 균주로 변환하고; 단일 콜로니를 37°C에서 5mL의 LB 배지에서 밤새 성장시킨다. LB 배지 2L로 옮긴 후OD600 값이 0.6-0.8에 도달하면 0.5mM IPTG를 추가하고 18°C에서 16-18시간 동안 세포 배양물을 흔들어줍니다.
- 배양물을 원심분리하여 상청액을 제거하고 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M KCl; 1 M 우레아; 10 mM 이미다졸; 1.5 mM 베타-메르캅토에탄올(β-ME); 및 5% 글리세롤)으로 재현탁시켰다.
- 초음파 처리 및 원심 분리 후 18000 × g 에서 ~ 30 분 동안 상청액을 용해 완충액의 5 배 부피에서 평형 화 된 Ni-NTA 수지에 넣은 다음 10 배 부피의 세척 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M 요소, 40 mM 이미 다졸, 1.5 mM β-ME 및 5 % 글리세롤).
- 결합된 단백질을 15mL의 용리 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1M KCl, 1M 요소, 500mM 이미다졸, 1.5mM β-ME 및 5% 글리세롤)으로 용리하고 용출을 ~500μL로 농축합니다.
- 농축된 단백질 용액을 겔 여과 컬럼에 넣고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 생성물을 분석합니다. 정제된 단백질을 액체 질소에 빠르게 동결시키고 -80°C에서 보관합니다.
6. DNA 커튼 플로우셀의 제조
- DNA 커튼 실험을 위해 지그재그 나노 가공 장벽이 있는 플로우셀을 준비하고 흐름 방향을 결정합니다. 이렇게하려면 입력 및 출력 튜브를 올바른 방향으로 연결하십시오.
- 2개의 3mL 주사기를 사용하여 2.5mL의 지질 완충액으로 플로우셀을 세척합니다. 플로우셀에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 출력물로부터 주사기를 제거하고, 각 주입 후 5분 배양과 함께 1mL의 리포좀 용액(섹션 2로부터의 리포좀 스톡 40μL 및 지질 완충액 960μL)을 3회 주입한다.
- 치유 단계를 위해 2.5mL의 지질 완충액으로 플로우셀을 천천히 세척하고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
알림: 필요한 경우 치유 시간이 더 길어질 수 있습니다. 거품이 나타나면 5.3단계와 5.4단계를 반복하여 이중 치유를 수행하여 거품을 제거합니다. - 30mL의 소 혈청 알부민(BSA) 완충액(표면 패시베이션을 위한 40mM Tris-HCl(pH 7.5), 2mMMgCl2, 1mM 디티오트레이톨 및 0.5mg/mL BSA)을 준비합니다. 30분의 치유 후 출력 측에서 2.5mL의 BSA 버퍼로 플로우셀을 세척합니다.
알림: BSA 스톡은 4°C에서 보관된 20mg/mL 용액이며 1-2주 이내에 사용해야 합니다. 완충액 내의 BSA 농도는 표면 상태에 따라 조정될 수 있다. - 800μL의 스트렙타비딘 완충액(1mg/mL 스트렙타비딘 스톡 10μL, BSA 완충액 790μL)을 각 단계 후 10분 배양과 함께 두 단계로 입력 측에서 플로우셀에 주입합니다.
참고: 스트렙타비딘은 비오티닐화된 지질과 비오티닐화된 DNA 사이를 연결하여 다가성으로 인해 DNA를 지질에 고정시킵니다. - 플로우셀을 BSA 버퍼 2.5mL로 세척하여 모든 유리 스트렙타비딘 분자를 제거합니다.
- BSA 완충액(2.5μL의 DNA 및 998μL의 BSA 완충액)을 사용하여 섹션 3의 클로닝된 모티프로 비오틴-람다 DNA를 희석합니다. 람다 DNA를 5분 간격으로 천천히 4회 주입합니다.
- 주입하는 동안 현미경과 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 시스템을 켭니다. 10mL의 ddH2O로 튜브를 세척하고 프리즘과 튜브 커넥터를 물, 2% 액체 큐벳 클리너 및 99% 에탄올로 헹굽니다. BSA 버퍼에 KCl 및 이중 가닥 DNA 염료를 추가하여 이미징 버퍼를 준비하여 각각 150mM 및 0.5nM의 최종 농도를 얻고 이미징 버퍼를 30mL 주사기에 최소 20mL를 취합니다.
- 현미경 스테이지에 플로우셀을 설치하고 미세유체 시스템에 연결합니다.
- 0.03mL/min의 유속을 사용하여 DNA 분자를 장벽으로 10분 동안 플러시하고 흐름이 중지된 상태에서 30분 동안 배양한 다음 전원을 꺼서 DNA가 측면으로 확산되도록 합니다.
참고: 이 30분 배양의 목적은 DNA 분자가 플러시되는 입력에 닫힌 장벽 측면에 축적되는 경향이 있기 때문에 간단한 확산을 통해 DNA 분자가 장벽 앞에 더 고르게 분포되도록 하는 것입니다. 배양 시간은 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
7. DNA 커튼의 EWS-FLI1 응축 형성 이미징
- 이미징 소프트웨어를 열고 명시야 아래에서 3 × 3 지그재그 패턴의 위치를 찾아 표시합니다.
- 0.2mL/분으로 흐름을 켜서 이중 가닥 DNA 염료로 DNA를 10분 동안 염색합니다.
- mCherry-EWS-FLI1을 이미징 버퍼로 튜브 내에서 100 μL의 100 nM 농도로 희석한다.
- 100μL 유리 주사기로 밸브를 통해 단백질 샘플을 로드하고 유속을 0.4mL/분으로 변경합니다.
- 488nm 레이저를 켜고 각 영역을 사전 스캔하여 DNA 분포 상태를 확인합니다. DNA 분자가 고르게 분포하는 영역을 선택하십시오. 레이저 출력을 488nm 레이저의 경우 10%, 561nm 레이저의 경우 20%로 설정합니다. 파워 미터를 사용하여 프리즘 근처의 실제 레이저 출력을 측정합니다 (488nm 레이저의 경우 4.5mW, 561nm 레이저의 경우 16.0mW).
- 이미지 획득
- 488nm 및 561nm 레이저를 동시에 사용하여 2초 간격으로 이미지 수집을 시작합니다.
- 밸브를 수동 모드에서 주입 모드로 변경하여 이미징 버퍼가 60초 후에 단백질 샘플을 플로우셀로 플러시하도록 합니다.
참고: 이 과정은 ~30초가 소요되며 EWS-FLI1 단백질이 플로우셀에 도달하는 즉시 시야가 mCherry 신호로 덮여 있습니다. - 사용 가능한 EWS-FLI1을 제거하려면 561nm 레이저만 켠 상태에서 이미징 버퍼로 플로우셀을 5분 동안 계속 세척하십시오. 유동을 중지하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 0.4mL/분으로 유량을 켜서 DNA가 확장되도록 하고 서로 다른 프레임 간에 2초 간격으로 이미지를 획득하여 EWS-FLI1 응축수 형성의 고처리량 데이터를 얻습니다.
8. mCherry-EWS-FLI1에 대한 강도 분석
- 데이터를 이미지 시퀀스로 ImageJ 소프트웨어로 가져오고 8× 8 픽셀 정사각형의 25× GGAA 사이트에서 점을 선택하고 이미지를 .tif 형식으로 저장합니다.
- 전체 푼타를 포함하여 8×8 픽셀 정사각형의 강도 합계로 강도를 계산하고 8 x 8 픽셀 정사각형 근처의 동일한 크기 영역에서 배경 강도를 빼서 배경을 제거합니다.
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Representative Results
DNA 커튼의 개략도는 그림 1A, 그림 1B 및 그림 1D에 나와 있습니다. GGAA의 25개의 중단되지 않은 반복을 함유하는 클로닝된 표적 서열은 유잉 육종의 NORB1 프로모터에서 발견된다. 이 표적 서열은 EWS-FLI1 모집28에 결정적이다. EWS-FLI1 분자는 561nm 레이저로 얻은 mCherry 표지된 EWS-FLI1 신호를 검출하여 시각화되었습니다(그림 1C 및 그림 1E). DNA 커튼 실험이 설정된 후, DNA 기질의 1× GGAA 부위에서 EWS-FLI25의 생체 분자 응축수의 시험관 내 형성을 직접 시각화 할 수있었습니다 (그림 1B-E). DNA 커튼에 사용된 mCherry-EWS-FLI1의 특이성은 25× GGAA를 포함하고 GGAA가 없는 DNA 주형을 사용하는 전기영동 이동성 이동 분석법에 의해 확인되었습니다(그림 2A). 추가적으로, EWS-FLI1의 농도를 20 nM 내지 500 nM로 적정하고, 25× GGAA 부위에서 반점의 강도를 결정하였다. mCherry-FLI1DBD의 강도와 비교하여 EWS-FLI1의 강도는 극적으로 증가한 반면, 단백질이 25× GGAA 부위를 덮도록 포화되었을 때 FLI1DBD의 강도 변화는 무시할 수 있었습니다. 따라서 이러한 결과는 EWS-FLI1이 DNA에 응축수를 형성했음을 강력하게 시사합니다(그림 2B-E).
그림 1: 25× GGAA 모티프를 포함하는 람다 DNA의 EWS-FLI1 응축물 형성. (A) DNA 커튼의 개략도. (B 및 D) 람다 DNA에 조립된 EWS-FLI1 응축물(500nM)을 검출하기 위한 두 가지 전략: (B) 10분 동안 계속 세척하고, (D) 10분 동안 배양합니다. (C 및 E) DNA 커튼의 대표적인 광시야 전반사 형광 현미경 이미지: (C) B의 검출 전략; (E) D의 탐지 전략. C(ii) 및 E(ii) DNA는 단일 DNA 기질 상에 형성된 별개의 반점을 보여주기 위해 확대된다. DNA 기질은 25× GGAA 모티프를 가진 람다 DNA입니다. 숫자 "1, 2, 3, 4"는 하나의 람다 DNA에서 반점의 다른 위치를 나타내고 "3"은 25× GGAA 마이크로 위성 서열이 복제 된 곳입니다. 스케일 바 = 4.9 μm (C, E (i)) 및 0.7 μm (C, E (ii)). 이 수치는 24에서 수정되었습니다. 약어 : dsDNA = 이중 가닥 DNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 25× GGAA에서 mCherry-EWS-FLI1의 분리된 도메인의 결합 이벤트가 반복됩니다. (ᅡ) (i) m체리-EWS-FLI1. (ii) mCherry-EWS-FLI1의 전기영동 이동성 이동 분석: 5' 퀘이사670으로 표지된 306-bp dsDNA를 40 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM KCl, 2 mMMgCl2, 1 mM DTT 및 0.2 mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 반응 완충액에서 실온 하에서 30분 동안 상이한 농도로 mCherry-EWS-FLI1과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 로딩하고 25분 동안 1.3% 아가로스 겔에서 실행했습니다. (B-D) 500nM mCherry(B), 500nM mCherry-EWSLCD(C) 또는 500nM mCherry-FLI1DBD(D)로 인큐베이션한 후 DNA 커튼이 있는 25× GGAA의 광시야 전반사 형광 현미경 이미지. (E) 표적 부위 (25× GGAA) 영역에서 EWSFLI1 (청록색) 및 FLI1DBD (흑색) 신호의 강도 분포 대 단백질 농도. 이 수치는 24에서 수정되었습니다. 약어: LCD = 저 복잡성 도메인; DBD = DNA 결합 도메인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단일 분자 접근법은 반응 시스템의 내용물에 매우 민감하기 때문에 DNA 커튼 실험 중에 모든 물질과 용액, 특히 섹션 1과 2에서 준비된 지질과 섹션 5에서 사용된 완충액의 우수한 품질을 보장하기 위해 추가 노력을 투자해야 합니다. 완충액을 준비하려면 더 높은 순도의 시약을 사용해야 하며, 완충액은 단일 분자 분석을 위해 새로 준비해야 합니다.
500 nM mCherry-표지된 EWS-FLI1을 챔버 내로 플러싱했을 때, 25× GGAA 서열을 포함하는 람다 DNA에 여러 개의 자홍색 반점이 나타났다. 블랭크 버퍼로 10분 동안 세척한 후에도 전체 DNA에 걸쳐 마젠타 신호의 연속적인 비특이적 분포가 있음을 알 수 있습니다(그림 1B, C). 흥미롭게도 EWS-FLI1 분자는 완충액 흐름 없이 10분 배양 동안 DNA에 재배열되어 여러 개의 반점으로 수집되었습니다(그림 1D, E). 이 반점 중 하나는 복제 된 25× GGAA 사이트에서 형성되었으며, 다른 모든 것은 연속 GGAA 모티프의 고밀도를 포함하는 영역에서 형성되었습니다. 이 현상은 무흐름 배양 절차를 통해 EWS-FLI1 분자가 유전자좌를 검색하고 DNA에서 더 빨리 조립할 수 있음을 강력하게 시사합니다.
이러한 응축수가 DNA 커튼에서 어떻게 형성되는지 명확히 하기 위해 몇 가지 제어 실험을 수행해야 합니다. 우리는 mCherry, mCherry-EWSLCD 및 mCherry-FLI1DBD를 정제하고 동일한 절차에 따라 이러한 단백질을 챔버에 주입했습니다. mCherry(그림 2B)와 mCherry-EWSLCD(그림 2C)는 DNA에 어떠한 신호도 남기지 않았으며, 이는 EWS-FLI1의 FLI1DBD가 DNA와의 상호작용에 필요함을 나타냅니다. 이러한 낮은 단백질 농도의 DNA 커튼에서 상 분리가 발생했음을 확인하기 위해 mCherry-EWS-FLI1의 농도를 25nM에서 500nM로 적정하고 클론 부위에서 하나의 DNA 분자에 대한 각 반점의 강도를 측정했습니다(그림 2E). mCherry로 표지된 융합 TF FLI1DBD의 강도와 비교한 결과, EWS-FLI1 및 FLI1-DBD의 점상 강도는 낮은 단백질 농도에서 유사했지만 농도가 500nM에 도달한 경우에도 FLI1DBD의 강도는 낮게 유지된 반면 EWS-FLI1의 강도는 극적으로 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 EWS-FLI1 분자가 25× GGAA 서열에 결합하고 LCD 상호 작용을 통해 응축수로 조립됨을 시사합니다. 단일 FLI1DBD는 2x GGAA 모티프에 결합할 수 있고, 고차 올리고머는 고도로 반복적인 저친화성 서열(27)에 결합한다. 25× GGAA 서열의 mCherry-FLI1DBD 신호는 개별 단백질 분자가 아닌 단백질 클러스터에서 나왔습니다. mCherry-FLI1DBD는 25× GGAA 부위에 결합할 수 있었지만 DNA에 응축수로 조립되지 않아 LCD-LCD 상호 작용이 상 분리에 필요하다는 것을 확인했습니다(그림 2D, E).
단일 분자 방법을 통해 연구원은 전사 인자 응축물 내부의 역학을 연구할 수 있습니다. DNA 커튼 방법은 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)29, 초고해상도 이미징(30) 및 광학 핀셋(31,32)과 같은 다른 단일 분자 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, DNA 커튼 방법은 시험관 내에서 긴 게놈 DNA에서 전사 기계의 재구성과 고처리량 데이터 수집을 통한 전사 응축수 형성의 실시간 관찰을 허용합니다. 둘째, 정렬된 DNA 분자는 각 DNA 가닥에서 응축물의 위치를 매핑할 수 있습니다. 따라서, 점상 형성을 위한 바람직한 DNA 서열이 용이하게 결정될 수 있다.
또한 DNA 커튼을 사용하면 장기 획득이 가능하므로 한 푼크텀의 온레이트(k on) 및 오프레이트(koff)를 측정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 DNA 커튼에는 몇 가지 고유한 기술적 결함이 있어 다양한 방법의 증거를 집합적으로 조사해야 합니다. 한편으로, DNA 커튼의 분해능은 0.18 μm 또는 ~ 1,000-bp에 도달 할 수 있는데, 이는 긴 람다 DNA 템플릿이 회절 한계와 관련하여 제한을 가지고있어 인접한 두 형광 신호의 분화를 방해 할 수 있기 때문입니다. 한편, 흐름은 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 확장하는 데 사용되며, 생체 분자에 가해지는 힘은 DNA에 결합하는 단백질의 확산 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 이중 테더링 DNA 커튼은 dsDNA의 양쪽 끝을 고정하고 흐름 없이 단백질의 이동을 기록할 수 있으며 이는 주목할만한 솔루션(33)입니다. 요약하면, DNA에 대한 생체 분자 응축수의 동적 조립에 대한 이해를 실시간으로 심화하면 LLPS의 생물 물리학 적 메커니즘뿐만 아니라 유전자 전사 조절24와 같은 LLPS 관련 세포 과정의 기본 생물학에 대해서도 밝힐 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NSFC 보조금 번호 31670762 (Z.Q.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
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